Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Summary

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Abstract

Memeli beyin işaretli simetri sagittal düzlem sergiler. Ancak, simetrik Beyin bölgelerindeki yetişkin memeli hayvanlarda sinirsel dynamics ayrıntılı açıklaması zor kalır. Bu çalışmada, kalsiyum dynamics ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde yukarıda çift optik pencerelerden ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi kullanarak. Bu yöntem sırasında aynı anda aynı deneyi için uzun bir dönem içinde vivokayıtları ve ikili fare beyin bölgelerinde bir sinirsel aktivite quantifications sağlar. Bir saat içinde tamamlanabilir, bu yöntemin önemli yönleri çift optik windows ve 2 P görüntüleme kullanımı oluşturmak için minimal invaziv cerrahi prosedürler içerir. Her ne kadar biz sadece S1 alanında tekniği göstermek, belgili tanımlık yöntem diğer bölgelerinde yaşayan beyin beyin sinir ağları yapısal ve işlevsel karmaşıklığı aydınlatma kolaylaştırmak için uygulanabilir.

Introduction

Kalsiyum ve onun yönetmelik çok sayıda fizyolojik süreç arabuluculuk gereklidir. Kalsiyum dynamics izleme normal beyin fonksiyonlarının yanı sıra beyin hastalıkları ^{1,2,3,4,5,6 patolojik koşulları anlamak için yararlıdır ,7,8}. GCaMP6s floresan Imaging spike numaraları, zamanlama, miktarının için güçlü bir araçtır ve frekans olarak sinaptik düzeyde vitro ve in vivo ^9,10,11girdi.

Memeli beyin işaretli simetri sagittal düzlem sergiler. Her ne kadar son nörolojik araştırma kortikal remodeling ışık tutmak ve nöronal aktivite travmatik beyin ya da omurilik yaralanma ^6,7tarafından rolleri o sağlam doku simetrik olarak tetiklenen karşılık gelen bölgeler oynamak Kurtarma hala belirsiz vardır.

Bu çalışmada, bilateral simetrik optik windows vivo içinde görüntüleme için oluşturmak için deneysel yordamlar açıklar. Bu optik windows kullanarak, biz birincil somatosensor cortices (S1) üzerinden kalsiyum dynamics ölçme 2 P mikroskobu kullanılarak GCaMP6s transgenik farelerde açıklar. Sonuçlar bölümünde, vivo içinde dendritik Morfoloji 2 P Imaging'i kullanma EGFP transgenik farelerde S1 bölgedeki farklı zaman noktalarda da gösteriyoruz. Gözlem yöntemi ile ilgili ağ dynamics ikili S1 alanlarda bir ilk nasıl çift açık kafatası pencerelerinin nörologlar yerel ve simetrik bilgi normal yetişkin memeli beyninde işlem soruşturma için yardımcı olacak bir örnektir koşulları or farklı hastalığında içinde vivomodelleri.

Protocol

Tüm cerrahi ve hayvan işleme yordamlarını Kılavuzu altında bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Araştırma Konseyi) ve Indiana Üniversitesi okul tıp kurumsal hayvan bakım ve kullanım yönergeleri için onaylanmış yapıldı Komitesi. 2-foton görüntüleme kurulumunun şematik resim 1' de gösterilen.

1. hayvan görüntüleme için hazırlanması

1. Steril gazlı bez, pamuk temizleme bezi ve autoclaved cerrahi araçlar cerrahi alan (Tablo 1) yerleştirin. Bir mikro boncuk Sterilizatör cerrahi araçlar intersurgery sterilizasyon için açın.
2. Fare (erkek veya kadın, 1,5-2,5 ay, 20-25 g) mayi enjeksiyonu (IP) ketamin (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) ve acepromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g vücut ağırlığı) karışımı ile anestezi. Ne zaman hayvan için bir ayak çimdik uyarıcı cevap sona erer ve hiçbir Korneal refleks uygun anestezi derinliği ulaşılana kadar bekleyin. Ameliyat sırasında bir booster doz ver 1/3'ü anestezi kokteyl olarak özgün doz özgün anestezik durumunu korumak gerekli.
3. Buprenorfin subkutan enjekte (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) ameliyat öncesi bir analjezik ajan olarak. Koruyucu merhem kornea kurutma ve katarakt oluşumunu önlemek için hayvan gözler için geçerlidir.
4. GCaMP6s transgenik fare hipotermi önlemek ve steril cerrahi örtüsü ile yeterli bir ısıtma yastığı yerleştirin. Hayvanın kafa fareler için bir kafa tutan adaptörü ile sabitleyin.
5. Çoğu çift kenar jilet ile kafa derisi üzerinde kafa tıraş. Povidone-iyot çözüm tarafından takip steril alkol hazırlık pad ile cerrahi alanı temizleyin.

2. kronik kafatası pencere hazırlık

1. Bir tarafta (sağda) kafatası makas ile kafa derisi (2 x 3 mm) dikdörtgen bir kesim yapmak. Bir çekim alanı oluşturmak için bir kenara bir pamuklu çubukla kabuğuyla itmek > 3 mm çapında (Şekil 3A). Kafatası Yavaşça bir künt mikrocerrahi bıçakla (neşter Blade #10; kafatası kazıma bağlı bağ dokusu kaldırmak Şekil 3 c).
2. Yavaşça bir daire çizerek S1 alanını işaretlemek (3 mm çapında, merkezi koordinasyon: bregma ve orta hat üzerinden 2.5 mm-1.5 mm) (Şekil 2B) bir diş kullanarak kafatasında matkap.
3. Aynı yordamı sol kafatasında (Şekil 2B) gerçekleştirin.
4. Diş çimento uygulama için bir temel sağlamak için kemiğe Cyanoacrylate süper tutkal ince bir tabaka uygulayın.
5. İnce diseksiyon mikroskop altında kafatası yüksek hızlı microdrill (şekil 3D) kullanarak S1 çevresinde dairesel bir oluk aşağı. Üstüne görme duyusuyla ilgili bir pencere için düz bir kenar oluşturmak için amaçtır.
6. Sürekli olarak yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF, oda sıcaklığında) kafatası sondaj kolaylaştırmak ve ısı dağılımı için düzenli aralıklarla inceltme işlemi sırasında uygulanır. Zaman zaman sürtünme kaynaklı aşırı ısınmayı önlemek için sondaj gerçekleştirin. Uzakta bir ev vakum hattı veya bir vakum pompası ile kemik enkaz emer.
7. Yaklaşık 2/3 derinlik kemik delinmiştir sonra yavaş ve dikkatli kafatasından (kalp kapakcıgını) dairesel bir parça çevreleyen kafatasından tamamen boşalana kadar kalan 1/3 kemik ince.
8. Yavaş ve dikkatli bir çift # 5/45 forseps ile dairesel kalp kapakcıgını kaldırmak ve dura (Şekil 2C; maruz Şekil 3E).
9. Maruz kalan beyin bölgesi ACSF (Şekil 3E) ile nemli tutmak. Kaçının pial gemiler, herhangi bir hasar beri kanama serebral kan akımı alter, beyin şişmesi hızlandırmak ve ciddi biçimde görüntü kalite bozulmasına yol açar.
10. Aynı yordamı kafatası (kontralateral) sol tarafında gerçekleştirmek.
11. Optik pencere montajı için kullanım optik yapıştırıcı tutkal ve coverglass arasında tedavi için tek tek katmanlar. Gerekirse, yapışkanlı bağ geliştirmek için bir kuluçka optik penceresinde (12 h 50 ° C) sıcak. Optik pencere 2 bölümleri içerir: üst kısmı 5 mm çapında tek bir yuvarlak kapak cam ve alt bölümü 1 – 3 yuvarlak kapak gözlük 3 mm (Şekil 2B) çapında içerir.
12. Optik pencere etanol (% 70, vol/vol) depolamak ve kullanımdan önce steril serum fizyolojik ile durulayın. Optik pencere montaj önce kusurları, optik yapışkanlı veya yanlış hizalama'nın altında bir stereoscope yanlış bir miktarı için optik penceresini denetleyin.
13. Optik pencere kranyotomi bölgede (Şekil 2B) yükleyin. Optik pencerenin üst kısmındaki kafatasında aittir ve optik pencerenin alt kısmındaki craniotomized açılış içinde uyuyor ve dura CSF (2D rakam, E) huzurunda dayanmaktadır.
14. Kafatası Cyanoacrylate süper yapıştırıcı (2F rakam; ile optik pencere kenarına üst kısmı mühür Şekil 3F).
15. Cyanoacrylate süper tutkal kuruduktan siyah diş çimento (Dentsply cam kenarına karşılamak için) uygulanır. Diş çimento maruz kafatasına uygulamak ve ışık (Şekil 2 g-H; engellemek için kenar boşluklarını yara Şekil 3B).
16. Sol taraftaki aynı yordamı gerçekleştirin.
17. Hayvan ısıtma yastığını yeniden elde etmek ve uygun izleme altında kurtarma için ev onun kafes hayvan dönmek izin. Çiğneme ve nemlendirme kolaylaştırmak için ıslak yiyecek sağlamak. Ağrı azaltmak için buprenorfin yönetmek SC (0,05-2.0 mg/kg) 2 gün boyunca her 8 – 12 h postinjury. Fareyi kurtarmak izin vermek için ek bir 7-10 gün önce görüntüleme.

3. iki fotonlu görüntüleme

1. Deneme günü, ketamin ve xylazine (doz ve yukarıda açıklandığı gibi anestezi bakımından) hayvanla anestezi. %75 (vol/vol) etanol ile kafatası pencere temizle.
2. 2 P mikroskop ve kafa tutan bir ısıtma yastığı kafasının bir fare kafa sahibine bağlı kulak barlar ile immobilize ile dinlenme adaptör, oluşan bir görüntüleme ayarı altında fareyi getirin.
3. Optik penceresinin bir tarafında bir anda görüntü. Optik anomalileri en aza indirmek için optik pencere ve sağ kafatası mikroskop optik eksen odaklı dik olduğundan emin olun.
4. Parlak alan aydınlatma ile kafatası penceresinin bir ilk resmi 4 x büyütme ile daha yüksek büyütme 2 P angiographies (Şekil 4A1) kaydı için bir başvuru harita olarak atın.
5. 10 x büyütme (Şekil 4A2) kullanarak ilgi alan üzerinde yakınlaştırır.
6. Seçin bir S1 alanda ilgi alanı kortikal katmanlarda ı ya da II (en çok 150 µm pial yüzeyinin altında). Yüksek büyütme isterseniz bir 20 X hedefi kullanın.
7. Görüş alanı birden çok nöronlar ile arayın. 2 P mikroskop (Şekil 4B) kullanarak görüntüleri elde etmek. Pozlama süresi ve derinliği dayalı uyarma ışık (≈910 nm) ve ifade düzeyini GCaMP6s, zayıf sinyalleri uzun pozlama süreleri gerektiren ve önemlisi daha az zaman çözünürlüğü belirleyin. Biz genellikle ~ 4 µs başına piksel pozlama süreleri kullanın. 3-5 Hz kare hızları 512 × 512 piksel çözünürlükte görüntüler elde etmek.
8. Saat serisi kaydetmeye başlayın. Faiz (ROI) indirgeme puan veya vasküler desen göre her bölgesinin koordinatlarını düşük büyütme görüntüler içinde saklar. Aynı YG zaman içinde görüntü. S1 alanının sol hemisfer dinamikleri kalsiyum gözlemlemek için aynı yordamı gerçekleştirin. Floresans her yatırım getirisi gelen değişiklikleri hesaplamak.
9. Görüntüleri tek tek veya Hızlandırılmış film (Şekil 4 c1-C3, D, E) olarak elde.
10. Kortikal kan akışı dynamics in vivo kemirgenler 2 P mikroskobu ile kuyruk ven içine enjekte floresan dextran boyalar Imaging tarafından çalışma. Vasculatures yerler tanımak ve uzun sürelerle oturumları Imaging'de aynı YG resim kullanın.

4. veri işleme

1. ImageJ ve kaynak görüntü analizi için kullanın. ImageJ (Şekil 5A-B) görüntü sıralarıyla alın. Tek tek görüntüleri (veya t-serisi filmler), görüntülü bir neuron ve 2 yakın bölgeler arka plan ölçüm (Şekil 5C) için ayrı bir yatırım getirisi seçin. Toplam yoğunluğu elde etmek bir yatırım getirisi Yöneticisi (Şekil 5C).
   Not: Şekil 6 temsilcisi kalsiyum görüntüleri gösterir. Kalsiyum geçici (yeşil) ve kan damarı (kırmızı) farklı zaman noktalarda ilk pencere kurulumdan sonra saniye (Şekil 6A-D) 7 d Mouse göster. Z-projeksiyon için kırmızı ve yeşil kanallarını (Şekil 6E) veya yeşil kanal (Şekil 6F) 3 dk kayıt döneminin de gösterilir. Bir z-projeksiyon tüm resimler sıkıştırılmış bir görüntüsünü (tüm çerçeveleri ilgi nesnesi nöron kapsayan) bir kaba ve daire sınır el ile yanı sıra 2 arka plan bölgeleri ( bağımsız seçim seçilmiş olduğunu film görüntüler Şekil 6G).
2. Her yatırım getirisi ortalama floresans arka FB, FB hesaplamak (FB1 + FB2) = / 2 ve soma (F) Floresan değişiklikleri ifade olarak ΔF/F, ΔF/F (F-FB) = / FB.
3. Adım adım temel düzeltme, en yüksek bulma/belirlenmesi, tepe tümleştirme, tepe uygun, ve/veya Time-Saving en yüksek çözümleme özellikleri de dahil olmak üzere ImageJ işlevlerini kullanarak en yüksek çözümlemesi gerçekleştirin.

Representative Results

Bilateral optik penceresini kullanarak, biz 2 ayrı deneylerden sonuçlar elde. İlk deneme EGFP ifade fareler görüntü dendritik varicosities için istihdam. Şekil 4 c 1-3 farklı zaman noktalarda optik pencere implantasyon sonra yakalanan görüntüleri gösterilmektedir. Sayısı ve konumu dendritik şube ve omurgalar 2 kez (Şekil 4 d, E, z-projeksiyon) son derece kararlı olduğunu unutmayın.

İkinci deneme geçici, böylece bir tek nöron vivo içinde içinde (Şekil 6) kalsiyum fizyolojisi nasıl ölçülebilir gösteren hücre içi kalsiyum ölçmek için Thy1 -GCaMP6s transgenik fareler istihdam. Bu teknik kaydetmek ve spontan aktivite katman V piramidal nöronların derin yer alan nüfus ölçmek için kullanılabilir olarak > 500 µm PIA aşağıda. (Ortalama yanıt-e doğru her zaman noktasında hesaplanır) zaman içinde ortalama spontan yanıt sayısız denemeler arasında hesaplanabilir. 2P teknik etkinlik aynı anda büyük ya da dağınık nöron popülasyonları beyne multielectrode kayıtları ile karşılaştırıldığında küçük mekanik rahatsızlık ile uzun süre tespit avantajına sahiptir.

Kabul edilebilir bir ortalama ölçüm oluşturmak için 5-10 denemeler tavsiye edilir. Denemeler sayısı spontan yanıt veya belirli bir stimülasyon yanıtlarını doğal değişkenliği bağımlı olacaktır. Tüm belgili tanımlık merdiven kesinlikle yukarıda açıklandığı gibi izlediyseniz, bir araştırmacı her iki inceltilerek-kafatası kafatası pencere teknikte eğitimli ve in vivo 2 P kalsiyum görüntüleme kayıtları 100 – 200 nöronların her iki günde 1-2 hayvanlardan elde etmek gerekir.

Tepe analiz sonra zirve, gerçek genlik, alanı ve her zirve için yarım en (FWHM) tam genişliği gerçek konumu gibi sonuçlarını topluluğu elde edilebilir.

Resim 1 : 2-foton (2P) görüntüleme için kafatası bir optik pencere bileşenlerinin Şematik çizimde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Şematik çizim gösterir bir kafatası pencere hazırlanması için önemli adımlar. (A)diseksiyon mikroskop altında cilt cerrahi bölgede cerrahi makas kullanarak kaldırın. (B) kullanımı dairesel groove (3 mm çap) kafatasında S1 alana kadar kemik üretmek için yüksek hızlı bir microdrill kapak oluk içinde çevreleyen kemiğinden müstakil hale gelir. (C) yavaş yavaş kalp kapakcıgını alttaki dura ortaya çıkarmak için kaldırın. (D) montajı coverglasses 2 farklı çaplarda optik penceresiyle. Üst coverglass daha büyük çapı (5 mm) ve alt coverglasses (genellikle 1-3) daha küçük çaplı (3 mm) vardır. Yüklemeye coverglasses kalınlığı kafatası kalınlığına bağlı olacaktır. (E) optik bir pencere oluşturmak için dairesel açılış kafatası üzerine coverglass yer. Coverglasses alt kısmındaki kafatası açılış içinde uygun olmalıdır. Coverglasses alt beyin zarı hafifçe başvurmalısınız. Kafatasında cyanoacrylate tutkal ile (F) mühür pencere kenarları. (Siyanoakrilat kurur,G) siyah diş çimento lateral tutkal duvara Uygula. (H) GKD₂ile O kafatası penceresini doldurun ve su-daldırma hedefleri görüntüleme için kullanın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Kafatası üzerinde ikili windows oluşturulması. (A) A fotoğrafik görüntü gösterir 2 kafatası optik windows S1 alan örten kafatası her tarafında. (B) yüksek büyütme altında yatan dura ve kan damarları açığa bilateral optik windows gösterilen görüntü (A) kutulu bölgesinin. Ölçek çubuğu 680 µm. (C) maruz kafatası =. Dairesel bir oluk içinde merkezi bir kalp kapakcıgını görülür (D) oluşturma. Ölçek çubuğu 900 µm. (E) = kalp kapakcıgını kaldırıldıktan sonra kafatası açılış yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile doluydu. Ölçek çubuğu 720 µm. (F) = optik penceresinin kafatası açılış ve süper yapıştırıcı ile pencerenin kenarına mühürleme üzerine yüklenmesi. Dura ve kan damarları optik pencereden görülebilir. Ölçek çubuğu 600 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Kalsiyum ve dendritik görüntüleme. (A1) Bölgeler Thy1simge yapılar olarak kan damarları (BV) kullanarak ilgi tanımlamak-GCaMP6s fareler. (A2) Aynı etiketli hücreleri (kırmızı oklar) zaman içinde aynı simge ve kaydı kullanarak tanımlayın. (B) temsilcisi Z-projeksiyon kalsiyum primer somatosensor korteks (S1) nöronların (kırmızı oklar) sinyalleri. Ölçek çubuğu 10 µm. (C1-3) = dendrites (yeşil) ve bir kan damarı (B6 içinde kırmızı) görselleştirme. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J katmanı II 1 gün optik pencere kurulumdan sonra S1 bölgesinin farklı derinliklerde. (D) Z-projeksiyon 1 gün aynı bölge, birden çok görüntü. (E) Z-projeksiyon 7 gün sonra optik pencere montaj, aynı bölge, birden çok görüntü. Sayının olağanüstü istikrar ve yetişkin spines ve dendritik dalları arasında 1 gün ve 7 gün sonra optik pencere montaj yeri unutmayın. Ölçek çubuğu C-E 5 µm (C-E) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kalsiyum sinyal izleme. (A, B) 2 nöronların veri analizi için ImageJ ile alınan t-serisi film örnekleri (nöron 1 ve nöron 2, sırasıyla). (C) A elektronik tablo üzerinde Aydınlatma şiddeti ilgi bölgesinden veri gösterir (ROI; nöron ve 2 bölgeler ayrı olarak arka plan önlemler). (D) hesaplama tepe: ΔF/F (F-FB) = / FB, FB (FB1 + FB2) = / 2 (ortalama floresans arka plan [FB] ve [F] ΔF/F ifade edilen soma floresans değişiklikler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 . Temsilcisi kalsiyum görüntüler. (A-D) Kalsiyum geçici (yeşil) ve kan damarları (kırmızı) bir fare saniyede 7 gün itibariyle farklı zaman noktalarında optik pencere kurulumdan sonra. Sarı ok: nispeten daha az aktif nöron. Beyaz ok: spiking nöron. (E, F) Z-projeksiyon kırmızı (kan damarları) ve yeşil (kalsiyum) kanalları (E) ve yeşil kanal sadece (F) için bir 3 dk kayıt süresi. (G) seçili neurons ve onların bitişik arka plan alanları işaretlenir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

İki fotonlu görüntüleme beyin yüzeyinin yaklaşık 800 µm kadar makul bir çözünürlükte çok sayıda hücre faaliyetlerinin eşzamanlı ölçüm sağlar. Biz 2 P ve bir çift optik pencere teknik kalsiyum dynamics katman V nöronal somata yer alan nüfus gözlemlemek için genetik olarak kodlanmış GCaMP6s ile entegre > 500 µm PIA aşağıda. Açık bir optik pencere ile kafatası her tarafında, uzun süreli ve istikrarlı kalsiyum içinde vivogörüntüleme için simetrik memeli beyin bölgeleri arasında sinirsel aktivite kayıtları yöntem sağlar. Bu yöntemin önemli yönleri çift açık kafatası optik windows oluşturmak için minimal invaziv cerrahi performansını ve 2 P görüntüleme nöronal aktivite simetrik S1 bölgelerde içerir.

İkili S1 bölgelerde ağ etkinliğinin incelenmesi nasıl çift kafatası windows örneği yerel ve simetrik bilgi işlem içinde yetişkin beyin içinde vivosoruşturma için kullanılabilir olduğunu. Bu yöntem aynı zamanda nöronal aktivite ( Thy1 -GCaMP6s fare kullanarakÖrneğin ) ve kortikal plastisite B6 eğitim için kullanılabilir. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J kurtarma deafferentation bir tek taraflı CNS yaralanma nedeniyle sonra karşılık gelen simetrik bölgelerde olduğu gibi dokusundan. Yöntemi optogenetic, elektrik veya kimyasal elektrodlar gibi periferik stimülasyon stratejileri doğrultusunda Kortikal faaliyet incelemek için kullanılabilir. Biz sadece S1 alanında tekniği göstermek rağmen bu yaklaşım primer motor korteks (M1) katman V nöronlar gibi yaşayan beyin simetrik diğer alanlarında faaliyetlerine araştırmak için istihdam olabilir. Beyin bölgeleri yeniden yapılanma üzerine gözlemler sinirsel bir substrat işlevinin postinjury kurtarma kritik bir rol oynamaktadır adaptif motor davranış için sağlayabilir. Ayrıca genetik olarak tanımlanan hücreleri simetrik aktivite kronik ölçüm sırasında baş-sabit farelerde davranış için sağlar.

Teknik olarak, araştırmacılar dikkatli kalite ve tutarlılık çift kafatası Windows dikkat etmelidir. İnceltilerek-kafatası kafatası pencere tekniği ¹² çalışmaya yeni başlayanlar için önerilir. Dikenleri onların morfolojisi ve yerel akını ve ekstrüzyon mekanizmaları nedeniyle kalsiyum bölmeleri vardır. Bu çalışmada B6 kullandık. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J fareler dendritik omurga dynamics in vivo (Şekil 4) göstermek için bir örnek olarak. Bir açık-kafatası cam pencere montaj cerrahi ¹²' den sonra yüksek omurga ciro ve reaktif gliyal yanıt neden olabilir. Buna ek olarak, inceltilerek-kafatası pencere tekniği ile dikenleri ve dendrites de korunabilir.

Seçimler boyutlarının ve optik windows kalınlıkları istenen görüş alanı, kafatası eğriliği, kafatası kalınlık ve görüntüleme ¹³tür bağlı olacaktır. Beyin zarı üzerinde optik coverglasses yetersiz baskısı dura, kafatası, büyütme kalinlasma neden olabilir ve beyin hareket arttı. Buna ek olarak, optik coverglasses aşırı basınç kortikal kan akışını engelleyebilir.

Optik pencere derleme, tutkal ve optik yapıştırıcı ve uzun dalga boyunda UV ışık ile bir anda coverglasses bir ek katmanlar tedavi. Yapışkanlı bağ güçlenmesine yardımcı olmak için bir kuluçka fabrikasyon penceresinde (12 h 50 ° C) sıcak. Optik pencere coverglass % 70 (vol/vol) etanol depolamak ve ameliyattan önce steril serum durulayın. Optik pencere (görsel yapışkanlı veya hatalı hizalaması yanlış bir miktarı gibi) kusurları için incelenmesi hatalarını önlemek üzere kullanmadan önce bir stereoscope altında gereken. Optik yapıştırıcı çok ince ise, hava alanlarda, optik anomalileri veya cam dekolmanı implantasyonu, neden olabilir katlanmış. Buna ek olarak, çok fazla optik yapıştırıcı taşma kafatası pencere kenarlarını geçmiş neden olabilir.

Özetle, burada tarif biz kalsiyum dynamics ya da 2 simetrik birincil somatosensor kortikal bölgelerde Thy1kafatası windows ile dendritik morfoloji ölçme için deneysel bir işlem-GCaMP6s ve Thy1- YFP transgenik fareler, sırasıyla, 2 P mikroskobu kullanılarak. Bu teknik büyük ölçüde sinir ağları karmaşık yapısal ve işlevsel ilişkinin dissekan kolaylaştırabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.