Imaging Neural aktivitet i den primära somatosensoriska Cortex med Thy1-GCaMP6s transgena möss

Summary

Vi beskriver en experimentell förfarande för mätning av neuronal aktivitet genom dubbla optiska fönster ovanför bilaterala primära somatosensoriska corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgena möss med hjälp av 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.

Abstract

Däggdjur hjärnan uppvisar markanta symmetri i sagittalplanet. Detaljerad beskrivning av neurala dynamics i symmetriska hjärnan hos vuxna däggdjur djur förblir dock svårfångade. I denna studie, beskriver vi en experimentell förfarande för mätning av kalcium dynamics genom dubbla optiska fönster ovanför bilaterala primära somatosensoriska corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgena möss med hjälp av 2-foton mikroskopi (2 P). Denna metod möjliggör inspelningar och kvantifieringar av neural aktivitet i bilaterala mus hjärnan en i taget i samma experiment för en långvarig period i vivo. Viktiga aspekter av denna metod som kan slutföras inom en timme, inkluderar minimalinvasiv kirurgi procedurer för att skapa dubbla optiska windows och användning av 2P imaging. Även om vi bara demonstrera tekniken i området S1, kan metoden tillämpas till andra regioner i den levande hjärnan att underlätta förtydligandet av strukturella och funktionella komplexiteten i hjärnans neurala nätverk.

Introduction

Kalcium och dess reglering är viktiga i medla flera fysiologiska processer. Övervakning kalcium dynamics är användbara för att förstå hjärnans normala funktion samt sjukdomstillstånd av hjärnans sjukdomar ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. Imaging GCaMP6s fluorescens är ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera spike nummer, timing, och frekvens, samt nivåer av synaptic ingång både in vitro- och in-vivo ^9,10,11.

Däggdjur hjärnan uppvisar markanta symmetri i sagittalplanet. Även om senaste neurologisk forskning har belysa den kortikala remodeling och neuronal aktivitet utlöses av traumatisk hjärnan eller ryggmärgen skadan ^6,7, roller som intakt vävnad av symmetriskt spelar motsvarande regioner i återhämtningen är fortfarande oklara.

I denna studie beskriver vi experimentella procedurer för att skapa bilateralt symmetriska optiska fönster för i vivo imaging. Med dessa optiska windows, beskriver vi mätning av kalcium dynamics från primära somatosensoriska cortices (S1) GCaMP6s transgena möss med 2P mikroskopi. I resultatavsnittet visar vi också i vivo dendritiska morfologi vid olika tidpunkter i regionen S1 i andra transgena möss med hjälp av 2 P imaging. Metoden observation angående nätverk dynamiken i de bilaterala S1-områdena är men ett inledande exempel hur dubbla öppna kraniala Windows hjälper neuroforskare sond lokala och symmetriska informationsbehandling i den vuxna däggdjur hjärnan i normal förhållanden eller i olika sjukdomen modellerar i vivo.

Protocol

Alla kirurgiska och djurens hantering utfördes som godkänts enligt guiden för vård och användning av försöksdjur (National Research Council) och riktlinjerna av Indiana University skola av medicin institutionella djur vård och användning Kommittén. Schematisk illustration av 2-photon imaging setup visas i figur 1.

1. förbereda djuret för avbildning

1. Placera steril gasbinda, bomull svabb och autoklaveras kirurgiska verktyg i området kirurgi (tabell 1). Aktivera en Micro Bead autoklaven för intersurgery sterilisering av kirurgiska verktyg.
2. Söva musen (manlig eller kvinnlig, 1,5 – 2,5 månader, 20 – 25 g) av intraperitoneal injektion (i.p.) av en blandning av ketamin (17,2 mg/mL), xylazin (0.475 mg/mL) och Acepromazin (0.238 mg/mL) (6 µL/g kroppsvikt). Vänta tills korrekt djup anestesi uppnås när djuret upphör att svara på en tå nypa stimulans och har ingen korneal reflex. Under operationen, ge en boosterdos av 1/3 den ursprungliga dosen bedövningsmedel cocktail som behövs för att bibehålla det ursprungliga tillståndet för narkos.
3. Injicera buprenorfin subkutant (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) som ett smärtstillande medel före operation. Tillämpa skyddande salva till ögonen på djuret att förebygga korneal torkning och katarakt bildandet.
4. Placera en transgen mus som GCaMP6s på en värmedyna att förhindra hypotermi och täcka det med en steril kirurgiska draperi. Stabilisera djurets huvud med en huvud Holding adapter för möss.
5. Raka huvudet över större delen av hårbotten med en dubbel kant rakblad. Ren det kirurgiska området med en steril alkohol förberedelse pad följt av povidon-jodlösning.

2. kronisk kraniala fönster förberedelse

1. Göra ett rektangulärt snitt i hårbotten (2 x 3 mm) med en sax på ena sidan (höger) av skallen. Tryck huden åt sidan med en bomullspinne för att skapa en exponering område med > 3 mm i diameter (figur 3A). Ta bort den bindväv som bifogas skallen genom att försiktigt skrapa skallen med en trubbig mikrokirurgisk kniv (skalpell bladet nr 10; Figur 3 c).
2. Markera området S1 genom att försiktigt dra en cirkel (3 mm i diameter, center samordning: -1,5 mm från bregma och 2,5 mm från mittlinjen) på skallen med en dental borra (figur 2B).
3. Utför samma procedur på vänster skallen (figur 2B).
4. Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat superlim på benet att ge en bas för dentala cement ansökan.
5. I dissekera Mikroskop, tunna ner ett cirkulärt spår i skallen runt området S1 använder en höghastighets microdrill (figur 3D). Syftet är att skapa en jämn kant för placering av en optiska fönstret på den.
6. Upprepade gånger gäller konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF, rumstemperatur) skallen regelbundet under gallring för att underlätta borrning och avleda värme. Utför borrning periodvis för att undvika friktion-inducerad överhettning. Suga bort ben skräpet med en kammare vakuum linje eller en vakuumpump.
7. Efter cirka 2/3 djup av benet är borrade, långsamt och försiktigt tunna resterande 1/3 benet tills en cirkulär skallen (Ben flap) är helt fria från omgivande skallen.
8. Långsamt och försiktigt ta bort fliken cirkulär ben med ett par nr 5/45 pincett och exponera dura (figur 2 c; Figur 3E).
9. Hålla utsatta hjärnregionen fuktig med ACSF (figur 3E). Undvika skada på pial fartyg, eftersom blödning kommer förändra cerebralt blodflöde, påskynda hjärnan svullnad och allvarligt försämra imaging kvalitet.
10. Utför samma procedur på den vänstra (kontralaterala) sidan av skallen.
11. För montering optiska fönstret, Använd optisk lim lim och bota mellan täckglas lager en i taget. Om nödvändigt, varma optiska fönstret (50 ° C i 12 h) i en inkubator att förbättra självhäftande limning. Den optiska fönstret innehåller 2 delar: den övre delen innehåller en enda runda luckan glas med en diameter på 5 mm och den nedre delen innehåller 1 – 3 runda locket glasögon med en diameter på 3 mm (figur 2D).
12. Lagra det optiska fönstret i etanol (70%, vol/vol) och skölj det med steril koksaltlösning före användning. Innan installation av optiska fönstret, kontrollera de optiska fönstret brister, inklusive ett felaktigt belopp av optiska självhäftande eller felaktig justering under ett stereoskop.
13. Installera den optiska fönstret över regionen kraniotomi (figur 2D). Den övre delen av fönstret optiska vilar på skallen och den nedre delen av optiska fönstret ryms inom craniotomized öppningen och vilar på dura i närvaro av CSF (figur 2D, E).
14. Försegla den övre delen av den optiska fönstret kanten till skallen med cyanoakrylat superlim (figur 2F; Figur 3F).
15. När cyanoakrylat Super limmet har torkat, applicera svart dentala cement (Dentsply) att täcka glaskanten. Gälla alla exponerade skallen dentala cement och såret marginaler för att blockera ljuset (figur 2 g-H. Figur 3B).
16. Utför samma procedur på vänster sida.
17. Låt djuret att återhämta sig på en värmedyna och tillbaka djuret till dess buren för återhämtning under lämplig övervakning. Ge våt mat för att underlätta tugg och återfuktning. För att minska smärta, administrerar buprenorfin s.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) var 8 – 12 h postinjury för 2 dagar. Låt musen för att återhämta sig ytterligare 7 – 10 dagar innan imaging.

3. två-photon imaging

1. På dagen för experimentet, söva djuret med ketamin och xylazin (doser och underhåll av anestesi som beskrivs ovan). Ren det kraniala fönstret med 75% (vol/vol) etanol.
2. Placera musen under en tänkbar uppställning bestående av 2P Mikroskop och huvudet håller adapter, vilande på en värmedyna med huvudet orörlig genom örat barer bifogas en mus rakhuvudshållaren.
3. Bild en sida av optiska fönstret samtidigt. För att minimera optiska aberrationer, kontrollera att den optiska fönstret och rätt skalle är orienterade vinkelrätt mot den optiska axeln av mikroskopet.
4. Ta en första bild av kraniala fönstret med ljusa fält belysningen på 4 x förstoring som en referens karta för registrering med högre förstoring 2P angiographies (figur 4A1).
5. Zooma in på området av intresse med 10 x förstoring (figur 4A2).
6. Välj ett område av intresse i området S1 i kortikala skikt I eller II (upp till 150 µm under pial ytan). Om högre förstoring önskas, Använd ett 20 X-objektiv.
7. Söka efter ett synfält med flera nervceller. Hämta bilder med 2P Mikroskop (figur 4B). Fastställa exponeringstid och excitation ljusnivå (≈910 nm) baserat på djupet och uttryck nivå av GCaMP6s, med svagare signaler som kräver längre exponeringstider och konkurrenslagen mindre tidsupplösning. Vi använder vanligtvis ~ 4 µs per pixel exponeringstider. Skaffa bilder på bildhastigheter på 3 – 5 Hz med en upplösning på 512 x 512 pixlar.
8. Börja registrera tidsserierna. Lagra koordinaterna för varje region av intresse (ROI) i förhållande till det vaskulära mönstret eller relaterat punkter i låg förstoring bilder. Bild samma ROI över tid. Utför samma procedur för att observera kalcium dynamiken i området S1 på vänster hjärnhalva. Beräkna förändringar i fluorescens från varje ROI.
9. Skaffa bilder antingen individuellt eller som en time-lapse film (figur 4 c1-C3, D, E).
10. Studera kortikala blod flöde dynamics i vivo imaging fluorescerande dextran färgämnen injiceras i svansen ven gnagare med 2 P mikroskopi. Använd vasculatures som landmärken att erkänna och bild samma ROI i imaging sessioner under långa perioder.

4. databearbetning

1. Använd ImageJ och ursprung för bildanalys. Importera bildsekvenser med ImageJ (figur 5A-B). För enskilda bilder (eller t-serien filmer), Välj en ROI inom en avbildad neuron och 2 separata närliggande regioner för bakgrunden mätning (figur 5 c). Förvärva total intensitet med en ROI manager (bild 5C).
   Obs: Figur 6 visar representativa kalcium bilder. Kalcium övergående (grön) och blodkärl (röd) visar vid olika tidpunkter i sekunder (figur 6A-D) i en mus på 7 d efter inledande fönstret installationen. Z-projektionen av en 3 minuters inspelningsperiod för röda och gröna kanalerna (figur 6E) eller grön kanal (figur 6F) visas också. En z-projektion visar en komprimerad diskavbildning av alla bilder i filmen som en grov och circle gräns (som omfattar objekt neuron sevärdheter i alla bildrutor) väljs manuellt samt valet av den oberoende närliggande bakgrund regioner ( 2 Figur 6 g).
2. Från varje ROI, beräkna genomsnittliga fluorescens bakgrunden FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 och fluorescens ändringarna av soma (F) uttryckt som ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Utföra den peak analys steg med funktioner imagej inklusive baslinjekorrektion, Peak konstaterande/bestämning, Peak Integration, Peak Fitting eller byggplatsen Peak analysfunktioner.

Representative Results

Med hjälp av bilaterala optiska fönstret, fått vi resultaten från 2 separata experiment. Det första experimentet anställd andra-uttryckande möss till bild dendritiska varicosities. Figur 4 c 1-3 visar exempel på bilder tagna vid olika tidpunkter efter optiska fönstret implantation. Observera att antalet och placeringen av dendritiska grenar och taggar är anmärkningsvärt stabil mellan de 2 visningar (figur 4 d, E, z-projektion).

Andra försöket anställd Thy1 -GCaMP6s transgena möss att mäta det intracellulära kalciumet övergående, vilket illustrerar hur kalcium fysiologi kan mätas inom en enda neuron i vivo (figur 6). Denna teknik kan användas för att registrera och kvantifiera spontan aktivitet i populationer av lager V pyramidal nervceller ligger så djupt som > 500 µm nedanför pia. Spontan sisådär över tid (beräknad som de genomsnittliga svaren vid varje tidpunkt) kan beräknas över många prövningar. 2P tekniken har fördelen av att upptäcka aktivitet samtidigt i stort eller spridda neuronala populationer över en längre period med lite mekaniska störningar i hjärnan jämfört med multielectrode inspelningar.

Generera en godtagbar genomsnittliga mätning, rekommenderas 5 – 10 prövningar. Antalet försök kommer att vara beroende av de spontana Svaren eller inneboende variabilitet av svaren på en särskild stimulans. Om alla steg följs strängt, som beskrivs ovan, en forskare utbildas i både tunnas-skalle kraniala fönster teknik och i vivo 2 P kalcium imaging bör kunna erhålla inspelningar av 100 – 200 nervceller på båda sidor från 1 – 2 djur per dag.

Efter peak analysen, kan en samling av resultaten som den verkliga platsen av toppen, riktiga amplituden, området och full bredd högst hälften (FWHM) för varje topp erhållas.

Figur 1 : Schematisk illustration av komponenterna i en kranial optiska fönstret för 2-fotonen (2P) imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Schematisk ritning visar viktiga steg för att förbereda ett kraniala fönster. (A) i dissekera Mikroskop, ta bort huden över regionen kirurgiskt med hjälp av ett par kirurgisk sax. (B) Använd en höghastighets microdrill att producera ett cirkulärt spår (3 mm i diameter) på skallen över området S1 tills benet flaxa inom spåret blir fristående från omgivande ben. (C) avlägsna sakta ben luckan för att exponera underliggande dura. (D) Montera optiska fönstret med täckglas med 2 olika diametrar. Den övre täckglas har en större diameter (5 mm) och de lägre täckglas (vanligtvis 1-3) har en mindre diameter (3 mm). Tjockleken på den täckglas installeras kommer att vara beroende av tjockleken på skallen. (E) plats på täckglas på cirkulär öppnandet av skallen för att skapa en optiska fönstret. Den nedre delen av täckglas bör passa inom kranial öppningen. Botten av täckglas bör försiktigt kontakta dura. (F) tätning fönstret kanter till skallen med cyanoakrylat lim. (G) när cyanoakrylat torkar, gälla limma väggen svart dentala cement i sidled. (H) Fyll fönstret kraniala med ddH₂O och använda nedsänkning i vatten mål för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 . Skapandet av bilaterala windows på skallen. (A) A fotografisk bild visar 2 kraniala optiska fönster på varje sida av kraniet överliggande området S1. (B) hög förstoring av bilden (A) boxed regionen visar bilaterala optiska windows exponera underliggande dura och blodkärl. Skalstapeln = 680 µm. (C), exponerade skallen. (D) inrättandet av ett cirkulärt spår inom vilken en central ben flik ses. Skalstapeln = 900 µm. (E) efter avlägsnande av ben klaffen, kraniala öppningen var fylld med konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF). Skalstapeln = 720 µm. (F) installationen av den optiska fönstret över det kraniala öppnandet och tätning kanten av fönstret med superlim. Den dura och blodkärlen syns genom optiska fönstret. Skalstapeln = 600 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4 : Kalcium och dendritiska imaging. (A1) Identifiera regioner av intresse med blodkärl (BV) som sevärdheter i Thy1-GCaMP6s möss. (A2) Identifiera samma märkta celler (röda pilar) över tiden med samma sevärdheter och posten. (B) representant Z-projektion av kalcium signaler i nervceller (röda pilar) i den primära somatosensoriska cortexen (S1). Skalstapeln = 10 µm. (C1-3) visualisering av dendriter (grön) och ett blodkärl (röd) i B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J på olika djup i lagret II av regionen S1 vid 1 dag efter optiska fönstret installationen. (D) Z-projektion av flera bilder på samma område på 1 dag. (E) Z-projektion av flera bilder på samma region 7 dagar efter optiska fönstret installationen. Observera den anmärkningsvärda stabiliteten av antalet och placeringen av vuxen ryggar och dendritiska grenar mellan 1 dag och 7 dagar efter optiska fönstret installationen. Skalstapeln = C-E 5 µm (C-E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kalcium signal spårning. (A, B) Exempel på importerade t-serien filmer med ImageJ för dataanalys av 2 nervceller (neuron 1 och neuron 2, respektive). (C) en kalkylblad visar data på belysning intensitet från regionen av intresse (ROI; inom neuron och 2 separata närliggande regioner som bakgrund åtgärder). (D) beräkning av toppen: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (genomsnittliga fluorescens bakgrunden [FB], och fluorescens ändringarna av de soma [F] uttryckt som ΔF/F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 . Representativa kalcium bilder. (A-D) Kalcium övergående (grön) och blodkärl (röd) vid olika tidpunkter på sekunder i en mus på 7 dagar efter optiska fönstret installationen. Gul pil: en relativt mindre aktiva neuron. Vit pil: en tillsatta neuron. (E, F) Z-projektion av en 3 minuters inspelningsperiod för röd (blodkärl) och grön (kalcium) kanaler (E) och gröna kanalen endast (F). (G) valda nervceller och deras angränsande områden markeras. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Två-foton imaging möjliggör samtidig mätning av aktiviteten hos många celler på en rimlig upplösning på upp till cirka 800 µm under hjärnan ytan. Vi integrerade 2P och en dubbla optiska fönstret teknik med genetiskt kodade GCaMP6s att observera kalcium dynamik i populationer av lager V neuronala somata ligger > 500 µm nedanför pia. Med ett öppet optiska fönster på varje sida av kraniet möjliggör metoden inspelningar av neural aktivitet i symmetriska däggdjur hjärnregioner för långvarig och stabil kalcium imaging i vivo. Viktiga aspekter av denna metod inkluderar minimalinvasiv kirurgi att skapa dubbla öppna skallen optiska windows prestanda och 2P avbildning av neuronal aktivitet i symmetriska S1 regioner.

Att undersöka nätverksaktivitet i bilaterala S1 regioner är ett exempel på hur dubbla kraniala windows kunde användas sond lokala och symmetriska informationsbehandling i den vuxna hjärnan i vivo. Denna metod kan också användas för att studera neuronal aktivitet (t.ex. med hjälp av Thy1 -GCaMP6s möss) och kortikala plasticitet B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J från intakt vävnad motsvarande symmetrisk regioner i återhämtning efter deafferentation på grund av en ensidig CNS-skada. Metoden kan också användas för att undersöka kortikal aktivitet som svar på perifer stimulering strategier såsom optogenetic, elektriska eller kemiska stimuli. Även om vi bara demonstrera tekniken i området S1, kunde detta tillvägagångssätt användas för att undersöka aktiviteter i andra symmetriska områden i den levande hjärnan såsom lager V nervceller i primära motoriska cortex (M1). Iakttagelser om omorganiseringen av regioner i hjärnan kan ge ett neuralt substrat för adaptiv motor beteende, som spelar en avgörande roll i postinjury återvinning av funktion. Det möjliggör också för kronisk mätning av genetiskt identifierade celler symmetriska aktivitet under uppförande i huvudet-fasta möss.

Tekniskt, utredare bör ägna stor uppmärksamhet åt kvaliteten och enhetligheten dubbla kraniala Windows. Tunnas-skalle kraniala fönster teknik ¹² rekommenderas för nybörjare att öva. Taggarna är kalcium fack på grund av deras morfologi och lokala mekanismer för inflöde och extrudering. I denna studie använde vi B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J möss som exempel att demonstrera dendritiska ryggraden dynamics i vivo (figur 4). En öppen-dödskalle glas fönster installation kan orsaka hög ryggrad omsättning och reaktiva gliaceller reaktioner efter kirurgi ¹². Däremot med tunnas-skalle fönster teknik, kan ryggar och dendriter väl bevaras.

Val av dimensioner och tjocklekar av optiska windows kommer att vara beroende av önskad synfältet, skalle krökning, skalle tjocklek och typ av imaging ¹³. Otillräcklig trycket av den optiska täckglas på dura kan orsaka förtjockning av dura, återväxt av skallen, och ökade hjärnan motion. Däremot kan övertryck av den optiska täckglas hindra kortikala blodflödet.

För optiska fönster montering, lim och bota ytterligare lager av täckglas en i taget med optisk självhäftande och lång våglängd UV-ljus. För att bidra till att stärka självhäftande limning, varma fönstret fabricerade (50 ° C i 12 h) i en inkubator. Lagra den optiska fönstret täckglas i 70% (vol/vol) etanol, och innan operationen, skölj den med steril koksaltlösning. Den optiska fönstret behöver undersökas för brister (t.ex. ett felaktigt belopp av optiska självhäftande eller felaktig justering) under ett stereoskop innan användning för att undvika fel. Om optiska limmet är för tunn, kan luftvolymer vara skrynkligt, vilket kan orsaka optiska avvikelser eller skyddsglaset lossnar vid implantation. Däremot kan för mycket optisk lim orsaka dataspill förbi kanterna på fönstret kraniala.

I sammanfattning, här beskriver vi en experimentell förfarande för mätning av kalcium dynamics eller dendritiska morfologi genom kraniala windows från 2 symmetriska primära somatosensoriska kortikala regioner i Thy1-GCaMP6s och Thy1- YFP transgena möss, respektive använda 2P mikroskopi. Denna teknik kan underlätta dissekera komplexa strukturella och funktionella förhållandet av neurala nätverk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.