Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

Summary

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Abstract

El cerebro mamífero exhibe marcada simetría en el plano sagital. Sin embargo, la descripción detallada de la dinámica neuronal en regiones cerebrales simétricos en mamíferos adultos sigue siendo elusiva. En este estudio, se describe un procedimiento experimental para medir la dinámica del calcio a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando microscopia de 2 fotones (2 P). Este método permite grabaciones y cuantificaciones de actividad neuronal en regiones cerebrales de ratón bilateral uno a la vez en el mismo experimento en un prolongado período en vivo. Aspectos clave de este método, que puede completarse en menos de una hora, incluyen procedimientos de cirugía mínimamente invasiva para la creación de ventanas ópticas duales y el uso de proyección de imagen de 2P. Aunque sólo nos demuestran la técnica en el área de S1, el método puede aplicarse a otras regiones del cerebro de vida facilita la aclaración de complejidad estructural y funcional de redes neuronales del cerebro.

Introduction

Calcio y su regulación son esenciales en la mediación de múltiples procesos fisiológicos. Supervisión dinámica de calcio es útil para la comprensión de la función normal del cerebro así como las condiciones patológicas del cerebro trastornos ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. GCaMP6s fluorescencia de imagen es una poderosa herramienta para la cuantificación de números de punto, tiempo, y frecuencia, así como niveles de synaptic de entrada tanto in vitro e in vivo ^9,10,11.

El cerebro mamífero exhibe marcada simetría en el plano sagital. Aunque recientes investigaciones neurológicas ha arrojado luz sobre la remodelación cortical y la actividad neuronal provocada por traumática cerebral o la médula espinal lesiones ^6,7, las funciones de ese tejido intacto de simétricamente correspondientes regiones jugar en la recuperación son todavía desconocidos.

En este estudio, describimos los procedimientos experimentales para la creación de ventanas ópticas simétricas bilaterales para la proyección de imagen en vivo . Utilizando estas ventanas ópticas, describimos la medición de la dinámica del calcio de las cortezas somatosensoriales primarias (S1) en GCaMP6s de ratones transgénicos usando microscopia 2P. En la sección de resultados, también mostramos en vivo la morfología dendrítica en momentos diferentes en la región de S1 en los ratones transgénicos de EGFP usando proyección de imagen de 2 P. El método de observación con respecto a la dinámica de la red en las áreas S1 bilaterales es pero un ejemplo inicial de cómo dos ventanas craneales abiertas ayudará neurocientíficos para sondear información local y simétrica en el cerebro mamífero adulto en condiciones normales condiciones o en la enfermedad de diferentes modelos en vivo.

Protocol

Se realizaron todos los procedimientos de manejo quirúrgico y animal aprobado bajo la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council) y las directrices de la Indiana University School de medicina institucional Animal Care y el uso Comité. Ilustración esquemática de la configuración de imagen de 2 fotones se muestra en la figura 1.

1. preparar el Animal para la proyección de imagen

1. Coloque una gasa estéril, torundas de algodón y esterilizadas instrumentos quirúrgicos en el área de cirugía (tabla 1). Gire en un esterilizador de Micro grano de intersurgery esterilización de instrumentos quirúrgicos.
2. Anestesiar el ratón (hombre o mujer, 1,5 – 2,5 meses, 20-25 g) por inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (17,2 mg/mL) y xilacina (0,475 mg/mL), acepromazina (0,238 mg/mL) (peso corporal de 6 μl/g). Espere hasta que se alcanza la profundidad adecuada de anestesia cuando el animal deja de responder a un estímulo del pellizco del dedo del pie y no hay reflejo corneal. Durante la cirugía, dar una dosis de refuerzo de 1/3 la dosis original del cóctel como anestésico necesario para mantener el estado anestésico original.
3. Inyectar la buprenorfina por vía subcutánea (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) como un agente analgésico antes de la cirugía. Aplicar pomada protectora en los ojos del animal para evitar la formación de secado y la catarata corneal.
4. Coloque un ratón transgénico GCaMP6s sobre una almohada para prevenir la hipotermia y cubrirla con un paño quirúrgico estéril. Estabilizar la cabeza del animal con un adaptador de Holding de cabeza para los ratones.
5. Afeitarse la cabeza en la mayor parte del cuero cabelludo con una navaja de doble filo. Limpie el área quirúrgico con una almohadilla de alcohol estéril preparación seguida de solución de povidona-yodo.

2. crónica ventana craneal preparación

1. Hacer un corte rectangular del cuero cabelludo (2 x 3 mm) con un par de tijeras en un lado (derecha) del cráneo. Empuje la piel a un lado con un hisopo de algodón para crear un área de exposición de > 3 mm de diámetro (Figura 3A). Eliminar el tejido conectivo que se une al cráneo raspando suavemente el cráneo con una cuchilla microquirúrgica embotada (bisturí hoja #10; Figura 3).
2. Marque el área S1 suavemente dibujando un círculo (3 mm de diámetro, coordinación del centro:-1,50 mm desde el vértice y 2,5 mm de la línea media) en el cráneo usando un dental del taladro (figura 2B).
3. Realizar el mismo procedimiento en la calavera izquierda (figura 2B).
4. Aplique una capa delgada de pegamento de cianocrilato Super hasta el hueso para proporcionar una base para la aplicación del cemento dental.
5. Con un microscopio de disección, fina por una ranura circular en el cráneo en la zona S1 usando una microperforadora alta velocidad (figura 3D). El propósito es crear un borde liso para la colocación de una ventana óptica sobre la misma.
6. Aplicar varias veces líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, temperatura ambiente) en el cráneo periódicamente durante el proceso de adelgazamiento para facilitar la perforación y disipar el calor. Realizar la perforación intermitentemente para evitar fricción inducida por sobrecalentamiento. A chupar los restos de hueso con una línea de vacío de casa o una bomba de vacío.
7. Después de perfora aproximadamente 2/3 profundidad del hueso, lentamente y con cuidado fino queda 1/3 hueso hasta una pieza circular del cráneo (aleta del hueso) es totalmente gratuita el cráneo circundante.
8. Lentamente y con cuidado quitar la aleta de hueso circular con un par de pinzas de # 5/45 y exponer la duramadre (figura 2; Figura 3E).
9. Mantener la región del cerebro expuesto húmedo con ACSF (figura 3E). Evitar cualquier daño a los vasos piales, puesto que la hemorragia alterar el flujo sanguíneo cerebral, acelerar la inflamación del cerebro y seriamente degradar la calidad de imagen.
10. Realizar el mismo procedimiento del lado izquierdo (contralateral) del cráneo.
11. Para el montaje de la ventana óptica, utilice pegamento óptico a pegamento y cura entre cubreobjetos capas a la vez. Si es necesario, caliente la ventana óptica (50 ° C por 12 h) en una incubadora para mejorar la adhesión. La ventana óptica contiene 2 porciones: la parte superior contiene una sola cubierta redonda de vidrio con un diámetro de 5 mm y la parte inferior contiene 1 – 3 vasos de cubierta redondeos con un diámetro de 3 mm (Figura 2D).
12. Guardar la ventana óptica en etanol (70%, vol/vol) y enjuague con solución salina estéril antes del uso. Antes de la instalación de la ventana óptica, Compruebe la ventana óptica de imperfecciones, incluyendo una cantidad incorrecta de alineación óptica adhesivo o inexacta bajo un estereoscopio.
13. Instale la ventana óptica sobre la región de craneotomía (Figura 2D). La parte superior de la ventana óptica se basa en el cráneo y la parte inferior de la ventana óptica encaja dentro de la abertura craniotomized y descansa sobre la dura presencia de CSF (Figura 2D, E).
14. Selle la parte superior del borde de ventana óptica en el cráneo con el pegamento de cianoacrilato Super (figura 2F; Figura 3F).
15. Cuando se haya secado el pegamento de cianoacrilato Super, aplicar cemento dental negro (Dentsply) para cubrir el borde de vidrio. Cemento dental se aplican a todas la expuestas de cráneo y herida márgenes para bloquear la luz (figura 2-H; Figura 3B).
16. Realizar el mismo procedimiento en el lado izquierdo.
17. Permitir que el animal a recuperar en la almohada y devolver el animal a su jaula casera de recuperación bajo supervisión apropiada. Proporcionan alimento húmedo para facilitar la masticación y la hidratación. Para reducir el dolor, administrar buprenorfina s.c. (0,05 a 2,0 mg/kg) cada postinjury de 8-12 h durante 2 días. Permitir que el ratón para recuperar por 7 – 10 días adicionales antes de la proyección de imagen.

3. dos fotones de

1. En el día del experimento, anestesiar el animal con ketamina y xilacina (dosis y mantenimiento de la anestesia como se describe anteriormente). Limpie la ventana craneal con 75% (vol/vol) de etanol.
2. Coloque el ratón en una configuración de imagen que consiste en un microscopio 2P y el adaptador que cabeza, descansando sobre una almohada con la cabeza inmovilizada por oído barras sujetas a un soporte para ratón.
3. Un lado de la ventana óptica de la imagen a la vez. Para minimizar las aberraciones ópticas, asegúrese que la ventana óptica y calavera derecha orientado perpendicularmente al eje óptico del microscopio.
4. Tomar una imagen inicial de la ventana craneal con iluminación de campo claro con 4 aumentos como un mapa de referencia para el registro con Angiografías de 2P de mayor aumento (Figura 4A1).
5. Ampliar el área de interés de 10 aumentos (Figura 4A2).
6. Seleccione un área de interés en el área S1 en capas corticales I o II (hasta 150 μm por debajo de la superficie pial). Si se desea mayor aumento, utilice un objetivo de 20 X.
7. Búsqueda para un campo de visión con múltiples neuronas. Adquisición de imágenes mediante un microscopio de 2P (Figura 4B). Determinar el tiempo de exposición y nivel luz de excitación (nm ≈910) basado en la profundidad y nivel de expresión de GCaMP6s, con señales más débiles que requieren tiempos de exposición más largos y unanimidad menos tiempo resolución. Por lo general utilizamos ~ 4 μs por tiempos de exposición de pixel. Adquisición de imágenes a velocidades de fotogramas de 3 a 5 Hz con una resolución de 512 × 512 píxeles.
8. Empezar a grabar la serie de tiempo. Almacenar coordenadas de todas las regiones de interés (ROI) en relación con el patrón vascular o a los puntos fiduciales en imágenes de baja magnificación. Imagen el mismo ROI con el tiempo. Realizar el mismo procedimiento para observar la dinámica del calcio de la zona S1 en el hemisferio izquierdo. Calcular los cambios en la fluorescencia de cada retorno de la inversión.
9. Adquisición de imágenes ya sea individualmente o como una película Time-lapse (4 figura1-C3, D, E).
10. Estudio cortical de sangre flujo dinámica en vivo por proyección de imagen tintes fluorescentes dextrano inyectados en la vena de la cola de los roedores con microscopia 2 P. Utilice vasculatures como puntos de referencia para reconocer y el mismo ROI en proyección de imagen sesiones durante largos periodos de la imagen.

4. procesamiento de datos

1. Utilizar ImageJ y origen para el análisis de la imagen. Importación de secuencias de imágenes con ImageJ (figura 5A-B). Para imágenes individuales o películas de la serie t, seleccione un retorno de la inversión dentro de una neurona de la imagen y 2 separados cerca de regiones para la medida de fondo (figura 5). Adquirir intensidad total con un gestor de ROI (figura 5C).
   Nota: La figura 6 muestra imágenes representativas del calcio. Transitorio de calcio (verde) y los vasos sanguíneos (rojos) Mostrar en diferentes puntos temporales en segundos (figura 6A-D) de un ratón en 7 d después de la instalación de la ventana inicial. También se muestra la proyección de z de un período de grabación de 3 minutos para los canales rojos y verdes (figura 6E) o canal verde (figura 6F). Una proyección z muestra una imagen comprimida de todas las imágenes en la película de que un límite áspero y círculo (comprende la neurona objeto de interés en todos los cuadros) es seleccionado manualmente así como la selección de la independiente cerca de regiones de fondo ( 2 Figura 6).
2. Calcular a partir de cada retorno de la inversión, el fondo de la fluorescencia media FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 y los cambios de la fluorescencia del soma (F) expresan en ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Realizar el análisis de pico paso a paso utilizando las funciones de corrección de línea base, incluso, pico encontrar/determinación, integración de pico, pico montaje y características de análisis de Time-Saving pico de ImageJ.

Representative Results

Través de la ventana óptica bilateral, se obtuvieron resultados de 2 experimentos separados. El primer experimento emplearon ratones expresaban EGFP para várices dendríticas imagen. Figura 4 1-3 muestra ejemplos de imágenes captadas en diferentes momentos después de la implantación de la ventana óptica. Tenga en cuenta que el número y la ubicación de las ramas dendríticos y espinas son notablemente estables entre las 2 vistas (figura 4, E, z-proyección).

El segundo experimento empleó Thy1 -GCaMP6s ratones transgénicos para medir el calcio intracelular transitorio, así ilustrando cómo la fisiología del calcio puede medirse dentro de una sola neurona en vivo (figura 6). Esta técnica puede utilizarse para registrar y cuantificar la actividad espontánea en las poblaciones de neuronas piramidales de la capa V ubicadas en tan profundo como > 500 μm a continuación de la pia. Media respuestas espontáneas en el tiempo (calculado como el promedio respuestas en cada momento) pueden calcularse a través de numerosos ensayos. La técnica P 2 tiene la ventaja de detectar actividad simultáneamente en grandes y dispersas poblaciones neuronales durante un período prolongado con poco disturbio mecánico al cerebro en comparación con el micropozo-microcanal grabaciones.

Para generar una medida promedio aceptable, se recomiendan ensayos de 5 – 10. El número de ensayos será dependiente de las respuestas espontáneas o variabilidad inherente de las respuestas a un estímulo particular. Si se siguen todos los pasos estrictamente, como se describió anteriormente, un investigador entrenado en tanto técnica de ventana craneal cráneo adelgazado y en vivo 2 P calcio la proyección de imagen debe ser capaz de obtener grabaciones de 100 – 200 neuronas en ambos lados de 1 a 2 animales por día.

Tras el análisis de pico, se puede obtener una colección de resultados tales como la ubicación real de la Cumbre, la amplitud real, la zona y la anchura total a mitad de máximo (FWHM) para cada pico.

Figura 1 : Ilustración esquemática de los componentes de una ventana óptica craneal para la proyección de imagen de 2 fotones (2P). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Dibujo esquemático muestra pasos claves para preparar una ventana craneal. (A) con un microscopio de disección, quitar la piel sobre la región quirúrgica usando un par de tijeras quirúrgicas. (B) uso una microperforadora alta velocidad para producir un surco circular (3 mm de diámetro) en el cráneo sobre el área S1 hasta el hueso de la aleta en el surco se desprende del hueso circundante. (C) lentamente retire la aleta de hueso para exponer la duramadre subyacente. (D) Ensamble la ventana óptica con coverglasses con 2 diámetros diferentes. El cubre-objetos superior tiene un diámetro más grande (5 mm) y el coverglasses inferiores (generalmente 1-3) tienen un diámetro más pequeño (3 mm). El espesor de la coverglasses a instalar dependerá del grosor del cráneo. (E) lugar el cubreobjetos en la abertura circular del cráneo para crear una ventana óptica. La parte inferior de la coverglasses debe encajar dentro de la abertura craneal. La parte inferior de la coverglasses debe suavemente póngase en contacto con la duramadre. Sello (F) la ventana de los bordes en el cráneo con pegamento de cianocrilato. (G) cuando el cianocrilato se seca, aplicar cemento dental negro lateral a la pared de pegamento. (H) Llene la ventana craneal con ddH₂O y objetivos de inmersión en agua de uso para la proyección de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Creación de ventanas bilaterales en el cráneo. (A) A imagen fotográfica muestra 2 craneales ventanas ópticas de cada lado del cráneo que cubría el área S1. (B) aumento elevado de la región en caja de imagen (A) mostrando ventanas ópticas bilaterales exponiendo la dura subyacente y vasos sanguíneos. Barra de escala = 680 μm. (C) el cráneo expuesto. (D) creación de una ranura circular en el que se ve una aleta de hueso central. Barra de escala = 900 μm. (E) después del retiro de la aleta de hueso, la abertura craneal se llenó de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). Barra de escala = 720 μm. (F) instalación de la ventana óptica sobre la abertura craneal y el borde de la ventana con super pegamento de sellado. La dura y los vasos sanguíneos son visibles a través de la ventana óptica. Barra de escala = 600 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Calcio y la proyección de imagen dendrítica. (A1) Identificar las regiones de interés utilizando los vasos sanguíneos (BV) como puntos de referencia en Thy1-ratones GCaMP6s. (A2) Identificar las células etiquetadas mismo (flechas rojas) con el tiempo usando los mismos puntos de referencia y registro. (B) representante Z-proyección de las señales de calcio en las neuronas (flechas rojas) de la corteza somatosensorial primaria (S1). Barra de escala = 10 μm. (C1-3) visualización de dendritas (verde) y un vaso sanguíneo (rojo) en B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J a diferentes profundidades en la capa II de la región S1 a 1 día después de la instalación de la ventana óptica. (D) Z-proyección de imágenes múltiples en la misma región en 1 día. (E) Z-proyección de imágenes múltiples en la misma región en 7 días después de la instalación de la ventana óptica. Tenga en cuenta la notable estabilidad del número y localización de adultos espinas y ramas dendríticas entre 1 día y 7 días después de la instalación de la ventana óptica. Barra de escala = C-E 5 μm (C-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Seguimiento de la señal de calcio. (A, B) Ejemplos de películas de serie t importado con ImageJ para análisis de datos de 2 neuronas (neurona 1 y la neurona 2, respectivamente). (C) A hoja de cálculo muestra los datos de intensidad de iluminación de la región de interés (ROI; dentro de la neurona y 2 independientes las regiones cercanas como fondo medidas). (D) cálculo del pico: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (el fondo de la media de la fluorescencia [FB] y los cambios de la fluorescencia del soma [F] expresado como ΔF/F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 . Imágenes de calcio representante. (A-D) Transitorio de calcio (verde) y los vasos sanguíneos (rojos) en diferentes puntos temporales en segundos en un ratón a 7 días después de la instalación de la ventana óptica. Flecha amarilla: una neurona relativamente menos activa. Flecha blanca: una neurona spiking. (E, F) Z-proyección de un período de grabación de 3 minutos para el rojo (vasos sanguíneos) y verde (calcio) canales (E) y canal verde (F). Seleccionado (G) las neuronas y sus áreas adyacentes de fondo están marcadas. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Proyección de imagen de dos fotones permite la medida simultánea de la actividad de muchas células con una resolución razonable en hasta aproximadamente 800 μm por debajo de la superficie del cerebro. Integramos 2P y una técnica de doble ventana óptica con GCaMP6s genéticamente codificados para observar la dinámica del calcio en las poblaciones de Somas neuronales capa V encuentra > 500 μm a continuación de la pia. Con una ventana óptica abierta a cada lado del cráneo, el método permite grabaciones de actividad neuronal en todas las regiones del cerebro mamífero simétrico prolongado y estable de calcio en vivola proyección de imagen. Aspectos clave de este método incluyen la realización de cirugía mínimamente invasiva para crear ventanas ópticas doble cráneo abierto y 2P proyección de imagen de la actividad neuronal en regiones simétricas de S1.

Examinar la actividad de red en regiones bilaterales de S1 es que un ejemplo de cómo dos ventanas craneales podría ser utilizado para información local y simétrica en el cerebro adulto vivo enla punta de prueba. Este método también puede utilizarse para estudiar la actividad neuronal (por ejemplo utilizando Thy1 -ratones GCaMP6s) y la plasticidad cortical B6. CG-Tg (Thy1- YFP) J HJrs de tejido intacto de las regiones simétricas correspondientes de recuperación después del deafferentation debido a una lesión unilateral del CNS. El método también puede utilizarse para examinar la actividad cortical en respuesta a estrategias de estimulación periférica como la optogenetic, estímulos eléctricos o químicos. Aunque sólo nos demuestran la técnica en el área de S1, este enfoque podría emplearse para investigar actividades en otras áreas simétricas en el cerebro de la vida como las neuronas de la capa V de la corteza motora primaria (M1). Observaciones sobre reorganización de las regiones del cerebro pueden proporcionar un sustrato neural para el comportamiento adaptativo del motor, que juega un papel fundamental en la recuperación de la función de postinjury. También permite la medida crónica de la actividad simétrica de células genéticamente identificadas durante comportamiento en ratones de cabeza fija.

Técnicamente, los investigadores deben prestar especial atención a la calidad y consistencia de duales windows craneales. Técnica de ventana craneal cráneo adelgazado ¹² es muy recomendable para los principiantes a la práctica. Espinas son compartimentos de calcio debido a su morfología y mecanismos locales de afluencia y de la protuberancia. En este estudio, utilizamos B6. Ratones HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP) como ejemplo para demostrar de la espina dorsal dendrítica dinámica en vivo (figura 4). Una instalación de ventana de cristal del cráneo abierto puede provocar espina dorsal alta facturación y respuestas gliales reactivas después de la cirugía ¹². En cambio, con la técnica ventana de cráneo adelgazado, espinas y las dendritas pueden ser bien conservadas.

Opciones de dimensiones y espesores de ventanas ópticas serán dependientes en el campo de visión deseado, la curvatura del cráneo, cráneo grueso y el tipo de imagen ¹³. Presión insuficiente de la óptica coverglasses en la dura puede causar engrosamiento de la duramadre, crecimiento del cráneo y mayor movimiento del cerebro. Por el contrario, una presión excesiva de la coverglasses óptica puede impedir el flujo sanguíneo cortical.

Para el montaje de la ventana óptica, pegamento y curar capas adicionales de coverglasses uno a la vez con pegamento óptico y luz UV de onda larga. Para contribuir al fortalecimiento de la vinculación adhesiva, caliente la ventana fabricada (50 ° C por 12 h) en una incubadora. Almacenar el cubreobjetos ventana óptica en etanol al 70% (vol/vol) y, antes de la cirugía, aclararlo con solución salina estéril. La ventana óptica necesita examinarse para las imperfecciones (como una cantidad incorrecta de alineación óptica adhesivo o inexacta) bajo un estereoscopio antes de su uso para evitar la falla. Si el pegamento óptico es demasiado fino, espacios de aire puede ser arrugadas, que pueden causar aberraciones ópticas o desprendimiento de la cubierta de vidrio en implantación. Por el contrario, demasiado pegamento óptico puede causar rebose más allá de los bordes de la ventana craneal.

En Resumen, aquí se describe un procedimiento experimental para medir la dinámica del calcio o morfología dendrítica a través de ventanas craneales de regiones corticales somatosensoriales primarias simétricas 2 en Thy1-GCaMP6s y Thy1ratones transgénicos - YFP, respectivamente, utilizando microscopía de 2P. Esta técnica puede facilitar enormemente la compleja relación estructural y funcional de redes neuronales de disección.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.