Vi beskriver en eksperimentel metode til måling af neuronal aktivitet gennem dual optiske vinduer over bilaterale primære somatosensoriske corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s Transgene mus bruger 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.
Pattedyr hjernen udviser markante symmetri på tværs af sagittale flyet. Detaljeret beskrivelse af neurale dynamics i symmetrisk hjerneregioner i voksne pattedyr dyr er imidlertid fortsat undvigende. I denne undersøgelse, vi beskriver en eksperimentel procedure til måling af calcium dynamics gennem dual optiske vinduer over bilaterale primære somatosensoriske corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s Transgene mus ved hjælp af 2-foton (2 P) mikroskopi. Denne metode giver mulighed for optagelser og kvantificeringer af neurale aktivitet i bilaterale mus hjerneregioner én ad gangen i den samme eksperiment for en langvarig periode i vivo. Vigtige aspekter af denne metode, som kan være afsluttet inden for en time, omfatter minimalt invasiv kirurgi procedurer til oprettelse af dobbelt optisk windows og brug af 2P billeddannelse. Selv om vi kun viser teknikken i området S1, kan metoden anvendes til andre regioner i den levende hjerne letter udredning af strukturelle og funktionelle kompleksiteten af hjernens neurale netværk.
Calcium og dets forordning er afgørende i mægle flere fysiologiske processer. Overvågning calcium dynamics er nyttige for at forstå normal hjernefunktion samt patologiske tilstande i hjernen lidelser 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s Fluorescens er et kraftfuldt værktøj til kvantificering af spike numre, timing, og hyppighed, samt niveauer af synaptic input både in vitro- og i vivo 9,10,11.
Pattedyr hjernen udviser markante symmetri på tværs af sagittale flyet. Selv om nyere neurologisk forskning har kastet lys over den kortikale remodellering og neuronal aktivitet udløst af traumatisk hjerne eller rygmarv skade 6,7, roller, intakt væv af symmetrisk spiller tilsvarende regioner i opsving er stadig uklare.
I denne undersøgelse beskriver vi eksperimentelle procedurer for at skabe bilaterale symmetrisk optisk windows for i vivo billeddannelse. Brug disse optiske vinduer, beskriver vi måling af calcium dynamics fra primære somatosensoriske cortex (S1) i GCaMP6s Transgene mus ved hjælp af 2P mikroskopi. I afsnittet resultater viser vi også i vivo dendritiske morfologi på forskellige tidspunkter i regionen S1 i EGFP Transgene mus ved hjælp af 2 P billeddannelse. Metoden observation vedrørende netværk dynamik i de bilaterale S1 områder er men en indledende eksempel hvordan dual åbne kraniel Vinduer vil hjælpe neuroforskere at sonde lokale og symmetrisk informationsbehandling i den voksne pattedyr hjerne i normal betingelser eller i forskellige sygdom modeller in vivo.
To-foton imaging giver samtidig måling af aktiviteten af mange celler med en rimelig opløsning på op til ca. 800 µm under hjernen overflade. Vi integreret 2P og en dobbelt optisk vindue teknik med genetisk kodet GCaMP6s at observere calcium dynamics i populationer af lag V neuronal somata beliggende > 500 µm nedenfor pia. Med et åbent optiske vindue på hver side af kraniet kan metoden optagelser af neurale aktivitet på tværs af symmetrisk pattedyr hjerneregioner for længerevarende og stabil calcium imaging in vivo. Vigtige aspekter af denne metode omfatter udførelsen af minimalt invasiv kirurgi til at oprette dual åbne kraniet optiske vinduer og 2P billeddannelse af neuronal aktivitet i symmetriske S1 regioner.
Undersøge netværksaktivitet i bilaterale S1 regioner er et eksempel på hvordan dual kraniel windows kan bruges til at probe lokale og symmetrisk informationsbehandling i den voksne hjerne in vivo. Denne metode kan også bruges til at studere neuronal aktivitet (f.eks. ved hjælp af Thy1 –GCaMP6s mus) og cortical plasticitet B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J fra intakt væv af de tilsvarende symmetrisk regioner i bedring efter deafferentation på grund af en ensidig CNS skade. Metoden kan også bruges til at undersøge kortikale aktivitet som svar på perifer stimulation strategier såsom optogenetic, elektriske eller kemiske stimulering. Selv om vi kun viser teknikken i området S1, kunne denne tilgang anvendes til at undersøge aktiviteter i andre symmetrisk områder i den levende hjerne som lag V neuroner i den primære motor cortex (M1). Bemærkninger om omlægning af områder af hjernen kan fastsætte en neurale substrat adaptive motor adfærd, som spiller en afgørende rolle i postinjury inddrivelse af funktion. Det giver også mulighed for kronisk måling af genetisk identificerede cellerne symmetriske aktivitet under opførsel i hoved-fast mus.
Teknisk, efterforskere bør betale opmærksomhed til kvalitet og konsistens af dobbelt kraniel windows. Tyndet kraniet kraniel vindue teknik 12 er stærkt anbefales til begyndere til praksis. Pigge er calcium rum på grund af deres morfologi og lokale tilstrømning og ekstrudering mekanismer. I denne undersøgelse brugte vi B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J mus som et eksempel for at vise dendritiske rygsøjlen dynamics i vivo (figur 4). En åben-kraniet glas vindue installation kan forårsage høj ryg omsætning og reaktive glial svar efter kirurgi 12. Derimod med tyndet kraniet vindue teknik, kan pigge og dendrites blive godt bevaret.
Valg af dimensioner og tykkelser af optiske windows vil være afhængig af den ønskede synsfelt, kraniet krumning, skull tykkelse og type af imaging 13. Utilstrækkelig pres af den optiske coverglasses på dura kan forårsage fortykkelse af dura, genvækst af kraniet, og øget hjerne bevægelse. I modsætning, kan overdreven pres af den optiske coverglasses hæmme kortikale blodgennemstrømning.
For optiske vindue forsamling, lim og helbrede yderligere lag af coverglasses, en ad gangen med optiske limen og lang bølgelængde UV-lys. For at bidrage til at styrke klæbende limning, varm vinduet fabrikerede (50 ° C til 12 h) i en inkubator. Gemme optiske vindue daekglas i 70% (vol/vol) ethanol, og før operationen, skyl det med sterilt saltvand. Vinduet optisk behov skal undersøges for mangler (såsom en forkert mængde af optiske klæbende eller unøjagtige justering) under en Stereoskopet før brugen for at undgå fiasko. Hvis den optiske limen er for tynd, kan luft rum være krøllet, hvilket kan forårsage optiske aberrationer eller cover glas udstationering på implantation. Derimod kan for meget optiske limen forårsage overløb forbi kanten af vinduet kranie.
I sammendrag, her beskriver vi en eksperimentel procedure til måling af calcium dynamics eller dendritiske morfologi gennem kraniel vinduer fra 2 symmetriske primære somatosensoriske kortikale regioner i Thy1-GCaMP6s og Thy1– YFP Transgene mus, henholdsvis, ved hjælp af 2P mikroskopi. Denne teknik kan i høj grad lette dissekere det komplekse strukturelle og funktionelle forhold af neurale netværk.
The authors have nothing to disclose.
Vi er meget taknemmelige for Wenbiao Gan (Skirball Institut, Institut for Fysiologi og neurovidenskab, New York University School of Medicine, USA) fremragende tekniske retningslinjer og Patti Raley, medicinsk Editor (afdeling af Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine), til redigering håndskriftet. Vi takke Dr. Jinhui Chen (Stark neurovidenskab Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) for at give B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J mus. Dette arbejde blev støttet i en del af grundlaget for direktøren for almindelig Hospital af Jinan militære Region af kam PLA 2016ZD03 (XJL), og NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit anmeldelse Award I01 BX002356 fra USA ‘s Department of Veterans Anliggender, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana rygmarv og hjerne skade Research Foundation, Mari Hulman George Endowment midler (XMX).
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |