Neuroscience

इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि प्राथमिक Somatosensory प्रांतस्था का उपयोग Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/56297

Xiaojing Lin^1,2, Tingbao Zhao³, Wenhui Xiong¹, Shaonan Wen⁴, Xiaoming Jin¹, Xiao-Ming Xu¹

¹Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine, Department of Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, ²Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, General Hospital of Jinan Military Region, ³Department of Orthopedics, Shandong Cancer Hospital, Shandong University, ⁴Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy Military Medical Sciences

Summary

हम vivo मेंद्विपक्षीय प्राथमिक somatosensory corticies (एस 1) Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में 2-फोटॉन (2P) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के ऊपर दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियों के माध्यम से ंयूरॉन गतिविधि को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन ।

Abstract

स्तनधारी मस्तिष्क sagittal विमान भर में समरूपता चिह्नित दर्शाती है । हालांकि, वयस्क स्तनधारी पशुओं में सममित मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिशीलता का विस्तृत विवरण मायावी रहता है । इस अध्ययन में, हम दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियों के माध्यम से कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन द्विपक्षीय प्राथमिक somatosensory corticies (एस 1) में Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग 2-फोटॉन (2P) माइक्रोस्कोपी. इस विधि रिकॉर्डिंग और द्विपक्षीय माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में एक समय में एक ही प्रयोग में एक बार में तंत्रिका गतिविधि की quantifications सक्षम बनाता है vivo मेंएक लंबी अवधि के लिए । इस विधि के मुख्य पहलुओं, जो एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है, दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए ंयूनतम इनवेसिव सर्जरी प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और 2P इमेजिंग का उपयोग करें । हालांकि हम केवल एस सी क्षेत्र में तकनीक का प्रदर्शन, विधि रहने वाले मस्तिष्क के अंय क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है मस्तिष्क तंत्रिका नेटवर्क के संरचनात्मक और कार्यात्मक जटिलताओं के elucidation सुविधा ।

Introduction

कैल्शियम और उसके विनियमन एकाधिक शारीरिक प्रक्रियाओं मध्यस्थता में आवश्यक हैं. निगरानी कैल्शियम गतिशीलता सामान्य मस्तिष्क समारोह के साथ ही मस्तिष्क विकारों के रोग की स्थिति को समझने के लिए उपयोगी है ¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶ ^,⁷^,⁸. इमेजिंग GCaMP6s प्रतिदीप्ति स्पाइक संख्या, समय, और आवृत्ति को बढ़ाता है, साथ ही दोनों विट्रो में और vivo ⁹^,¹⁰^,¹¹में synaptic इनपुट के स्तर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।

स्तनधारी मस्तिष्क sagittal विमान भर में समरूपता चिह्नित दर्शाती है । हालांकि हाल ही में स्नायविक अनुसंधान cortical remodeling और न्यूरॉन दर्दनाक मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी की चोट ⁶^,⁷द्वारा ट्रिगर गतिविधि पर प्रकाश डाला गया है, भूमिका है कि सममित इसी क्षेत्रों के बरकरार ऊतक खेलने वसूली में अभी भी अस्पष्ट हैं ।

इस अध्ययन में, हम vivo इमेजिंग में द्विपक्षीय सममित ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन । इन ऑप्टिकल खिड़कियों का प्रयोग, हम प्राथमिक somatosensory cortices (एस सी) से GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में 2P माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कैल्शियम की गतिशीलता को मापने का वर्णन । परिणाम अनुभाग में, हम भी EGFP ट्रांसजेनिक 2P इमेजिंग का उपयोग चूहों में एस सी क्षेत्र में अलग समय बिंदुओं पर vivo वृक्ष आकृति विज्ञान में दिखा । अवलोकन द्विपक्षीय एस सी क्षेत्रों में नेटवर्क गतिशीलता के बारे में विधि है, लेकिन कैसे दोहरी खुला कपाल खिड़कियों की एक प्रारंभिक उदाहरण के neuroscientists में मदद मिलेगी स्थानीय और सममित जानकारी सामांय में वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में प्रसंस्करण की जांच स्थिति या vivo मेंअलग रोग मॉडल में ।

Protocol

सभी शल्य चिकित्सा और पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के तहत अनुमोदित के रूप में प्रदर्शन किया गया (राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) और इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के दिशानिर्देश संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति. 2-फोटॉन इमेजिंग सेटअप के योजनाबद्ध चित्रण चित्रा 1में दिखाया गया है ।

1. इमेजिंग के लिए पशु की तैयारी

शल्य चिकित्सा क्षेत्र (तालिका 1) में बाँझ धुंध, कपास झाड़ू, और autoclaved सर्जिकल उपकरण रखें । शल्य चिकित्सा उपकरणों की एक शल्य चिकित्सा नसबंदी के लिए एक सूक्ष्म मनका नसबंदी पर बारी.
माउस Anesthetize (नर या मादा, 1.5 – 2.5 महीने, 20 – 25 ग्राम) द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन (आईएफसआई) के मिश्रण का ketamine (१७.२ मिलीग्राम/एमएल), xylazine (०.४७५ मिलीग्राम/एमएल) और acepromazine (०.२३८ मिलीग्राम/एमएल) (6 µ l/जी शरीर का वजन) । संज्ञाहरण के उचित गहराई तक पहुंच जब तक पशु एक पैर की अंगुली चुटकी उत्तेजना का जवाब और कोई corneal पलटा है तक प्रतीक्षा करें । सर्जरी के दौरान, मूल संवेदनाहारी राज्य को बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में 1/3 की एक बूस्टर खुराक संवेदनाहारी कॉकटेल की मूल खुराक दे ।
सर्जरी से पहले एक एनाल्जेसिक एजेंट के रूप में buprenorphine (एस॰सी॰; 0.05-0.10 मिलीग्राम/किलोग्राम) सुई । corneal सुखाने और मोतियाबिंद गठन को रोकने के लिए पशु की आंखों के लिए सुरक्षात्मक मरहम लागू करें ।
एक हीटिंग पैड पर एक GCaMP6s ट्रांसजेनिक माउस प्लेस हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए और यह एक बाँझ सर्जिकल कपड़े के साथ कवर । चूहों के लिए एक सिर पकड़े अनुकूलक के साथ पशु के सिर को स्थिर ।
एक डबल बढ़त उस्तरा ब्लेड के साथ खोपड़ी के सबसे अधिक सिर दाढ़ी । एक बाँझ शराब तैयारी povidone-आयोडीन समाधान के बाद पैड के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ ।

2. जीर्ण कपाल खिड़की की तैयारी

खोपड़ी के एक आयताकार काट (2 मिमी x 3 मिमी) एक तरफ कैंची की एक जोड़ी के साथ बनाओ (दाएं) खोपड़ी की । एक कपास झाड़ू के साथ एक तरफ त्वचा पुश व्यास में > 3 मिमी (चित्रा 3ए) के एक जोखिम क्षेत्र बनाने के लिए । एक कुंद microsurgical ब्लेड (स्केलपेल ब्लेड #10 के साथ धीरे से खोपड़ी स्क्रैप द्वारा खोपड़ी से जुड़ी संयोजी ऊतक निकालें; चित्र 3सी) ।
धीरे से एक चक्र ड्राइंग द्वारा एस 1 क्षेत्र मार्क (व्यास में 3 मिमी, केंद्र समन्वय:-bregma से १.५ मिमी और midline से २.५ मिमी) एक दंत ड्रिल (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर खोपड़ी पर.
बाईं खोपड़ी पर एक ही प्रक्रिया प्रदर्शन (चित्रा बी b).
हड्डी के लिए Cyanoacrylate सुपर गोंद की एक पतली परत लागू करने के लिए दंत सीमेंट आवेदन के लिए एक आधार प्रदान करते हैं ।
एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक उच्च गति microdrill (चित्रा 3 डी) का उपयोग कर एस एक क्षेत्र के चारों ओर खोपड़ी में एक परिपत्र नाली पतली । उद्देश्य इस पर एक ऑप्टिकल खिड़की के स्थान के लिए एक चिकनी बढ़त बनाने के लिए है ।
बार समय पर खोपड़ी के लिए कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF, कमरे के तापमान) लागू करने के लिए ड्रिलिंग और गर्मी फैलने की सुविधा के लिए thinning प्रक्रिया के दौरान । घर्षण प्रेरित overheating से बचने के लिए आवर्तक रूप ड्रिलिंग करते हैं । दूर एक घर वैक्यूम लाइन या एक वैक्यूम पंप के साथ हड्डी मलबे चूसना ।
के बाद लगभग 2/3 की गहराई की हड्डी, धीरे और ध्यान से पतली शेष 1/3 की हड्डी है जब तक खोपड़ी का एक परिपत्र टुकड़ा (अस्थि प्रालंब) पूरी तरह से चारों ओर खोपड़ी से मुक्त है ।
धीरे और ध्यान से # 5/45 संदंश की एक जोड़ी के साथ परिपत्र हड्डी प्रालंब को दूर करने और बाडी का पर्दाफाश (चित्रा 2c; चित्रा 3E).
ACSF (चित्रा 3E) के साथ उजागर मस्तिष्क क्षेत्र नम रखें. pial जहाजों को किसी भी क्षति से बचें, क्योंकि नकसीर मस्तिष्क रक्त के प्रवाह को बदल देगा, मस्तिष्क की सूजन में तेजी लाने, और गंभीर रूप से नीचा इमेजिंग गुणवत्ता ।
खोपड़ी के बाएं (contralateral) ओर एक ही प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं ।
ऑप्टिकल विंडो कोडांतरण के लिए, एक समय में coverglass परतों एक के बीच गोंद और इलाज के लिए ऑप्टिकल चिपकने का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, एक मशीन में ऑप्टिकल विंडो (12 ज के लिए ५० डिग्री सेल्सियस) गर्म चिपकने वाला संबंध बढ़ाने के लिए । ऑप्टिकल विंडो 2 भाग शामिल हैं: शीर्ष भाग 5 मिमी का व्यास के साथ एक एकल दौर कवर कांच और नीचे भाग शामिल है 1 3 मिमी (चित्रा 2d) के एक व्यास के साथ 3 दौर कवर चश्मा ।
(७०%, vol/) इथेनॉल में ऑप्टिकल खिड़की की दुकान और उपयोग करने से पहले यह बाँझ खारा के साथ कुल्ला. ऑप्टिकल विंडो स्थापना से पहले, एक stereoscope के तहत ऑप्टिकल चिपकने वाला या गलत संरेखण की एक ग़लत राशि सहित खामियों के लिए ऑप्टिकल विंडो की जाँच करें ।
craniotomy क्षेत्र (चित्रा 2d) पर ऑप्टिकल विंडो स्थापित करें । ऑप्टिकल विंडो के शीर्ष भाग खोपड़ी पर टिकी हुई है और ऑप्टिकल विंडो के नीचे भाग craniotomized खोलने के भीतर फिट बैठता है और सीएसएफ (चित्रा 2d, ई) की उपस्थिति में बाडी पर टिकी हुई है ।
Cyanoacrylate सुपर गोंद के साथ खोपड़ी के लिए ऑप्टिकल विंडो एज के शीर्ष भाग सील (चित्रा 2F; चित्रा 3F).
जब Cyanoacrylate सुपर गोंद सूख गया है, काले दंत सीमेंट (Dentsply) लागू करने के लिए कांच की बढ़त को कवर । प्रकाश ब्लॉक करने के लिए सभी उजागर खोपड़ी और घाव मार्जिन के लिए दंत सीमेंट लागू करें (चित्रा 2g-H; चित्र बी) ।
बाईं ओर एक ही प्रक्रिया निष्पादित करें ।
पशु हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए और उचित निगरानी के तहत वसूली के लिए अपने घर पिंजरे में जानवर लौटने की अनुमति दें । चबाने और जलयोजन की सुविधा के लिए गीले भोजन प्रदान करते हैं । दर्द को कम करने के लिए, प्रशासन buprenorphine एस॰सी॰ (0.05 – 2.0 मिलीग्राम/kg) हर 8-12 ज postinjury 2 दिनों के लिए । माउस की अनुमति के लिए एक अतिरिक्त के लिए ठीक 7-10 इमेजिंग से पहले दिन ।

3. दो-फोटॉन इमेजिंग

प्रयोग के दिन, ketamine और xylazine (ऊपर वर्णित के रूप में संज्ञाहरण की खुराक और रखरखाव) के साथ पशु anesthetize । ७५% (vol/इथेनॉल के साथ कपाल खिड़की साफ ।
एक इमेजिंग सेट के तहत माउस प्लेस-एक 2P माइक्रोस्कोप और सिर पकड़े अनुकूलक से मिलकर, एक माउस सिर धारक से जुड़ी कान सलाखों के माध्यम से मैटीरियल अपने सिर के साथ एक हीटिंग पैड पर आराम ।
छवि एक समय में ऑप्टिकल खिड़की के एक तरफ । ऑप्टिकल विचलन को कम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल विंडो और सही खोपड़ी माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष के लिए सीधा उन्मुख कर रहे हैं.
उच्च आवर्धन 2P angiographies के साथ पंजीकरण के लिए एक संदर्भ मानचित्र के रूप में 4x आवर्धन पर चमकदार क्षेत्र रोशनी के साथ कपाल खिड़की की एक प्रारंभिक तस्वीर ले लो (14a आंकड़ा) ।
10x आवर्धन (चित्रा 4a2) का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र पर ज़ूम ।
cortical परतों मैं या द्वितीय (pial सतह से नीचे १५० µm तक) में एस 2 क्षेत्र में ब्याज के क्षेत्र का चयन करें । यदि उच्च आवर्धन वांछित है, तो एक 20X उद्देश्य का उपयोग करें ।
एकाधिक ंयूरॉंस के साथ देखने के एक क्षेत्र के लिए खोजें । एक 2P माइक्रोस्कोप (चित्रा 4B) का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण । जोखिम समय और उत्तेजना प्रकाश स्तर (≈ ९१० एनएम) GCaMP6s की गहराई और अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर निर्धारित करते हैं, कमजोर संकेत अब जोखिम बार की आवश्यकता होती है और concordantly कम समय संकल्प के साथ । आमतौर पर हम पिक्सेल एक्सपोज़र समय प्रति ~ 4 µs का उपयोग करते हैं । 3 के फ्रेम दर पर छवियों को प्राप्त-5 हर्ट्ज ५१२ × ५१२ पिक्सल के एक प्रस्ताव पर ।
समय श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए प्रारंभ करें । स्टोर निर्देशांक ब्याज के हर क्षेत्र (रॉय) संवहनी पैटर्न के सापेक्ष या कम आवर्धन छवियों में फिड्यूशियल अंक के लिए । समय के साथ एक ही रॉय छवि । एक ही प्रक्रिया करने के लिए बाएं गोलार्द्ध पर एस सी के क्षेत्र के कैल्शियम गतिशीलता का पालन करें । प्रत्येक ROI से प्रतिदीप्ति में परिवर्तनों की गणना करें.
या तो व्यक्तिगत रूप से या एक समय चूक फिल्म (चित्रा 4c1-C3, डी, ई) के रूप में छवियों को प्राप्त करें ।
इमेजिंग फ्लोरोसेंट dextran रंजक द्वारा vivo में cortical रक्त प्रवाह गतिशीलता का अध्ययन 2P माइक्रोस्कोपी के साथ कुतर के पूंछ की नस में इंजेक्ट । लंबे समय से इमेजिंग सत्रों में समान ROI को पहचानने और छवि के लिए लैंडमार्क के रूप में vasculatures का उपयोग करें.

4. डाटा प्रोसेसिंग

छवि विश्लेषण के लिए ImageJ और मूल का उपयोग करें । ImageJ (चित्र 5-बी) के साथ छवि अनुक्रम आयात करें । व्यक्तिगत छवियों (या टी श्रृंखला फिल्मों) के लिए, एक छवि ंयूरॉन के भीतर एक रॉय का चयन करें और पृष्ठभूमि माप (चित्रा 5C) के लिए 2 अलग आस-पास के क्षेत्रों । एक रॉय प्रबंधक (चित्रा 5सी) के साथ कुल तीव्रता प्राप्त ।
नोट: चित्रा 6 प्रतिनिधि कैल्शियम छवियों से पता चलता है. कैल्शियम क्षणिक (हरा) और रक्त वाहिका (लाल) सेकंड में विभिन्न समय बिंदुओं पर दिखाएँ (चित्रा 6A-डी) 7 डी में एक माउस में प्रारंभिक विंडो स्थापना के बाद. लाल और हरे चैनल (फिगर 6E) या ग्रीन चैनल (figure 6F) के लिए 3 मिनट की रिकॉर्डिंग अवधि का z-प्रोजेक्शन भी दिखाया गया है । एक z-प्रोजेक्शन फिल्म में सभी छवियों की एक संकुचित छवि प्रदर्शित करता है जिसमें से एक मोटा और सर्कल सीमा (सभी फ्रेम में ब्याज की वस्तु ंयूरॉन को शामिल) मैंयुअल रूप से चयनित है और साथ ही 2 स्वतंत्र आसपास के पृष्ठभूमि क्षेत्रों का चयन ( चित्रा 6G).
प्रत्येक रॉय से, औसत प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि अमेरिकन प्लान की गणना, अमेरिकन प्लान = (FB1 + FB2)/2, और सोमा के प्रतिदीप्ति परिवर्तन (एफ) ΔF के रूप में व्यक्त/एफ, ΔF/f = (f-FB)/FB.
आधार रेखा सुधार, पीक खोज/निर्धारण, पीक एकीकरण, पीक फिटिंग, और/या समय-बचत पीक विश्लेषण सुविधाओं सहित ImageJ के कार्यों का उपयोग करके पीक विश्लेषण चरण निष्पादित करें ।

Representative Results

द्विपक्षीय ऑप्टिकल विंडो का उपयोग करना, हम 2 अलग प्रयोगों से परिणाम प्राप्त किया । पहला प्रयोग कार्यरत EGFP-व्यक्त चूहों को इमेज वृक्ष varicosities. चित्र 4c 1-3 ऑप्टिकल खिड़की आरोपण के बाद अलग समय अंक पर कब्जा कर लिया छवियों के उदाहरण से पता चलता है. ध्यान दें कि संख्या और वृक्ष शाखाओं के स्थान और spins 2 विचारों (चित्रा 4d, ई, जेड प्रक्षेपण) के बीच उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं ।

दूसरा प्रयोग कार्यरत Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों को मापने के लिए intracellular कैल्शियम क्षणिक, इस प्रकार illustrating कैसे कैल्शियम फिजियोलॉजी में एक एकल ंयूरॉन के भीतर मापा जा सकता है vivo (6 चित्रा) । इस तकनीक को रिकॉर्ड और परत वी पिरामिडीय ंयूरॉंस की आबादी में सहज गतिविधि यों तो पिया के नीचे के रूप में > 500 µm के रूप में गहरे में स्थित इस्तेमाल किया जा सकता है । समय के साथ औसत सहज प्रतिक्रियाओं (हर समय बिंदु पर औसत प्रतिक्रियाओं के रूप में गणना) कई परीक्षणों में गणना की जा सकती है. 2P तकनीक multielectrode रिकॉर्डिंग की तुलना में मस्तिष्क को थोड़ा यांत्रिक अशांति के साथ एक विस्तारित अवधि में एक साथ बड़े या फैलाया न्यूरॉन आबादी में एक साथ गतिविधि का पता लगाने का लाभ है.

एक स्वीकार्य औसत माप उत्पंन करने के लिए, 5-10 परीक्षणों की सिफारिश की है । परीक्षणों की संख्या सहज प्रतिक्रियाओं या एक विशेष उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं की अंतर्निहित परिवर्तनशीलता पर निर्भर हो जाएगा । यदि सभी चरणों का कड़ाई से पालन कर रहे हैं, जैसा कि ऊपर वर्णित है, एक शोधकर्ता दोनों thinned-खोपड़ी कपाल खिड़की तकनीक में प्रशिक्षित और vivo 2P कैल्शियम इमेजिंग में करने के लिए 100 की रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए-1 से दोनों पक्षों पर 200 न्यूरॉन्स-2 प्रति दिन जानवरों.

पीक विश्लेषण के बाद, इस तरह के चरम के वास्तविक स्थान के रूप में परिणामों का एक संग्रह, वास्तविक आयाम, क्षेत्र, और पूर्ण चौड़ाई पर प्रत्येक चोटी के लिए आधे अधिकतम (FWHM) प्राप्त किया जा सकता है ।

चित्रा 1 : 2 के लिए एक कपाल ऑप्टिकल खिड़की के घटकों के योजनाबद्ध चित्रण-फोटॉन (2P) इमेजिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2 : योजनाबद्ध ड्राइंग एक कपाल खिड़की की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण कदम से पता चलता है । (क) एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर शल्य क्षेत्र के ऊपर त्वचा को हटा दें । (ख) एक उच्च गति microdrill का उपयोग करने के लिए एक परिपत्र नाली (3 मिमी व्यास) उत्पादन के लिए एस 1 क्षेत्र पर खोपड़ी जब तक नाली के भीतर हड्डी प्रालंब आसपास की हड्डी से अलग हो जाता है । (ग) धीरे से अंतर्निहित बाडी को बेनकाब करने के लिए बोन फ्लैप निकालें । (घ) coverglasses के साथ 2 अलग व्यास के साथ ऑप्टिकल खिड़की को इकट्ठा । ऊपरी coverglass एक बड़ा व्यास है (5 मिमी) और कम coverglasses (आमतौर पर 1-3) एक छोटे व्यास (3 मिमी) है । स्थापित की जाने coverglasses की मोटाई खोपड़ी की मोटाई पर निर्भर होगी । (ङ) खोपड़ी के परिपत्र खोलने पर coverglass एक ऑप्टिकल खिड़की बनाने के लिए जगह है । coverglasses के निचले हिस्से को कपाल खोलने के भीतर फिट करना चाहिए । coverglasses के नीचे से धीरे से बाडी का संपर्क होना चाहिए । (च) cyanoacrylate गोंद के साथ खोपड़ी के लिए खिड़की के किनारों सील । (छ) जब cyanoacrylate सूख जाता है, गोंद दीवार के लिए काले दंत सीमेंट पार्श्व लागू होते हैं । (ज) ddH₂ओ के साथ कपाल खिड़की भरें और इमेजिंग के लिए जल-विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3 . खोपड़ी पर द्विपक्षीय खिड़कियों का निर्माण । (क) एक फोटो छवि 2 से पता चलता है खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष पर दो कपालीय ऑप्टिकल खिड़कियां एस 1 क्षेत्र । (ख) छवि के बॉक्स्ड क्षेत्र के उच्च आवर्धन (क) द्विपक्षीय ऑप्टिकल खिड़कियां अंतर्निहित बाडी और रक्त वाहिकाओं को उजागर दिखा । स्केल बार = ६८० µm. (ग) उजागर खोपड़ी । (घ) एक परिपत्र नाली का निर्माण जिसके भीतर एक केंद्रीय अस्थि प्रालंब देखा जाता है. स्केल बार = ९०० µm । (ङ) अस्थि फ्लैप को हटाने के बाद कपाल खोलकर कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) से भर दिया गया. स्केल बार = ७२० µm. (च) कपाल खोलने पर ऑप्टिकल विंडो की स्थापना और सुपर गोंद के साथ खिड़की के किनारे सील । इसमें ऑप्टिकल विंडो के माध्यम से बाडी और रक्त वाहिकाएं दिखाई जाती हैं । स्केल बार = ६०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 4 : कैल्शियम और वृक्ष इमेजिंग । (A1) Thy1-GCaMP6s चूहों में लैंडमार्क के रूप में रक्त वाहिकाओं (बी. वी.) का उपयोग करके रुचि के क्षेत्रों की पहचान करें । (A2) समान लैंडमार्क और रिकॉर्ड का उपयोग करके समय के साथ समान लेबल वाले कक्षों (लाल तीरों) को पहचानें. (ख) प्रतिनिधि Z-न्यूरॉन्स में कैल्शियम संकेतों का प्रक्षेपण (लाल तीर) प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था (एस सी) के. स्केल बार = 10 µm. (C1-3) dendrites के दृश्य (हरा) और एक रक्त वाहिका (लाल) में बी-6. सीजी-टीजी (Thy1-YFP) ऑप्टिकल विंडो स्थापना के बाद 1 दिन में एस 2 क्षेत्र की परत द्वितीय में अलग गहराई पर जे HJrs/। (घ) 1 दिन में एक ही क्षेत्र में कई छवियों का Z-प्रक्षेपण । (ङ) ऑप्टिकल विंडो स्थापना के बाद 7 दिनों में एक ही क्षेत्र में कई छवियों का Z-प्रक्षेपण । संख्या और वयस्क spins और वृक्ष शाखाओं के स्थान की उल्लेखनीय स्थिरता नोट 1 दिन और 7 दिनों के बीच ऑप्टिकल विंडो स्थापना के बाद । स्केल बार = c-e 5 µm (c-e). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : कैल्शियम संकेत अनुरेखण । (A, B) 2 न्यूरॉन्स के डेटा विश्लेषण के लिए ImageJ के साथ आयातित टी श्रृंखला फिल्मों के उदाहरण (ंयूरॉन 1 और ंयूरॉन 2, क्रमशः) । (ग) एक स्प्रेडशीट ब्याज के क्षेत्र से रोशनी की तीव्रता पर डेटा से पता चलता है (रॉय, ंयूरॉन के भीतर और 2 अलग पृष्ठभूमि उपायों के रूप में आसपास के क्षेत्रों) । (घ) शिखर की गणना: ΔF/f = (f-fb)/FB, fb = (FB1 + FB2)/2 (औसत प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि [अमेरिकन प्लान], और सोमा के प्रतिदीप्ति परिवर्तन [f] ΔF के रूप में व्यक्त/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 6 . प्रतिनिधि कैल्शियम छवियां । (A-D) कैल्शियम क्षणिक (हरा) और रक्त वाहिकाओं (लाल) सेकंड में एक माउस में 7 दिनों में ऑप्टिकल विंडो स्थापना के बाद अलग समय बिंदुओं पर । पीला तीर: एक अपेक्षाकृत कम सक्रिय ंयूरॉन । सफेद तीर: एक spiking ंयूरॉन । (ङ, च) Z-लाल (रक्त वाहिकाओं) और हरे (कैल्शियम) चैनल (ई) और ग्रीन चैनल केवल (एफ) के लिए एक 3 मिनट रिकॉर्डिंग अवधि के प्रक्षेपण । (छ) चयनित न्यूरॉन्स और उनके निकटवर्ती पृष्ठभूमि क्षेत्रों को चिह्नित किया गया है. स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

दो-फोटॉन इमेजिंग मस्तिष्क की सतह के नीचे लगभग ८०० µm तक एक उचित प्रस्ताव पर कई कोशिकाओं की गतिविधि के एक साथ माप को सक्षम करता है । हम एकीकृत 2P और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग GCaMP6s के साथ एक दोहरी ऑप्टिकल खिड़की तकनीक परत वी न्यूरॉन सोमता की आबादी में कैल्शियम गतिशीलता निरीक्षण करने के लिए स्थित पिया के नीचे 500 µm >. खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष पर एक खुला ऑप्टिकल खिड़की के साथ, विधि vivo मेंलंबे समय तक और स्थिर कैल्शियम इमेजिंग के लिए सममित स्तनधारी मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है । इस विधि के मुख्य पहलुओं दोहरे खुले खोपड़ी ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी के प्रदर्शन में शामिल हैं और 2P सममित s क्षेत्र में ंयूरॉंस गतिविधि की इमेजिंग ।

द्विपक्षीय एस सी क्षेत्र में नेटवर्क गतिविधि की जांच कैसे दोहरी कपाल खिड़कियों का एक उदाहरण है vivo मेंवयस्क मस्तिष्क में स्थानीय और सममित जानकारी प्रसंस्करण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि भी (उदाहरण के लिए Thy1-GCaMP6s चूहों का उपयोग करते हुए) ंयूरॉन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और cortical प्लास्टिक के बी-6 । तटरक्षक टीजी (Thy1-YFP) एक एकतरफा सीएनएस चोट के कारण deafferentation के बाद वसूली में इसी सममित क्षेत्रों के बरकरार ऊतक से HJrs/जे । विधि भी परिधीय उत्तेजना रणनीतियों जैसे optogenetic, बिजली या रासायनिक उत्तेजना के जवाब में cortical गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि हम केवल एस 1 क्षेत्र में तकनीक का प्रदर्शन, इस दृष्टिकोण ऐसे रहने वाले मस्तिष्क में अंय सममित क्षेत्रों में गतिविधियों की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जैसे प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (M1) के स्तर V ंयूरॉंस । मस्तिष्क क्षेत्रों के पुनर्गठन पर टिप्पणियों अनुकूली मोटर व्यवहार है, जो समारोह के postinjury वसूली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के लिए एक तंत्रिका सब्सट्रेट प्रदान कर सकते हैं । यह भी सिर तय चूहों में व्यवहार के दौरान आनुवंशिक रूप से पहचान की कोशिकाओं के सममित गतिविधि की पुरानी माप के लिए अनुमति देता है ।

तकनीकी तौर पर, जांचकर्ताओं की गुणवत्ता और दोहरी कपाल खिड़कियों की निरंतरता के लिए सावधान ध्यान देना चाहिए । thinned-खोपड़ी कपाल खिड़की तकनीक ¹² अत्यधिक अभ्यास करने के लिए शुरुआती के लिए सिफारिश की है । spins उनकी आकृति विज्ञान और स्थानीय आमद और बाहर निकालना तंत्र की वजह से कैल्शियम डिब्बों रहे हैं । इस अध्ययन में, हम बी-6 का इस्तेमाल किया । सीजी-टीजी (Thy1-YFP) HJrs/जे चूहों एक उदाहरण के रूप में vivo में वृक्ष रीढ़ की गतिशीलता (चित्रा 4) प्रदर्शित करने के लिए । एक खुली खोपड़ी ग्लास खिड़की अधिष्ठापन उच्च रीढ़ के कारोबार और प्रतिक्रियाशील glial प्रतिक्रियाओं के बाद सर्जरी के ¹²कारण हो सकता है । इसके विपरीत, पतली खोपड़ी खिड़की तकनीक के साथ, spins और dendrites अच्छी तरह से संरक्षित किया जा सकता है ।

आयामों और ऑप्टिकल खिड़कियों की मोटाई के विकल्प को देखने के वांछित क्षेत्र पर निर्भर हो जाएगा, खोपड़ी वक्रता, खोपड़ी मोटाई, और इमेजिंग ¹³के प्रकार । बाडी पर ऑप्टिकल coverglasses के अपर्याप्त दबाव के कारण बाडी का मोटा होना, खोपड़ी का पुनर्विकास, और मस्तिष्क गति में वृद्धि हो सकती है । इसके विपरीत, ऑप्टिकल coverglasses के अत्यधिक दबाव cortical रक्त प्रवाह में बाधा हो सकती है ।

ऑप्टिकल विंडो असेंबली, गोंद और coverglasses के अतिरिक्त परतों के इलाज के लिए एक समय में एक ऑप्टिकल चिपकने वाला और लंबी तरंग दैर्ध्य यूवी प्रकाश के साथ । मदद करने के लिए चिपकने वाला संबंध मजबूत बनाने के लिए, एक मशीन में गढ़े खिड़की (12 घंटे के लिए ५० डिग्री सेल्सियस) गर्म । ७०% में ऑप्टिकल विंडो coverglass स्टोर (vol/इथेनॉल और, सर्जरी से पहले, यह बाँझ खारा के साथ कुल्ला । ऑप्टिकल विंडो खामियों के लिए जांच की जरूरत है (जैसे ऑप्टिकल चिपकने वाला या गलत संरेखण की एक ग़लत मात्रा के रूप में) एक stereoscope के तहत विफलता से बचने के लिए उपयोग करने से पहले । यदि ऑप्टिकल चिपकने वाला बहुत पतली है, हवा रिक्त स्थान, जो ऑप्टिकल विचलन या कवर कांच टुकड़ी आरोपण पर पैदा कर सकता है हो सकता है । इसके विपरीत, बहुत अधिक ऑप्टिकल चिपकने वाला ओवरफ़्लो पिछले कपाल विंडो के किनारों के कारण कर सकते हैं ।

संक्षेप में, यहां हम Thy1-GCaMP6s और Thy1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों में 2 सममित प्राथमिक somatosensory cortical क्षेत्रों से कपाल खिड़कियों के माध्यम से कैल्शियम की गतिशीलता या वृक्ष आकृति विज्ञान को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन, क्रमशः, 2P माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इस तकनीक को बहुत जटिल संरचनात्मक और कार्यात्मक तंत्रिका नेटवर्क के संबंध विदारक सुविधा हो सकती है ।

Disclosures

लेखकों के पास कुछ भी खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

हम बहुत आभारी है Wenbiao (Skirball संस्थान, शरीर विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान विभाग, ंयूयॉर्क के विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन, संयुक्त राज्य अमेरिका) के लिए उत्कृष्ट तकनीकी मार्गदर्शन और पटी Raley, चिकित्सा संपादक (स्नायविक सर्जरी विभाग, इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन), पांडुलिपि के संपादन के लिए. हम Dr. Jinhui चेन (स्टार्क तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान संस्थान, इंडियाना विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन, संयुक्त राज्य अमेरिका) बी-6 प्रदान करने के लिए धंयवाद । तटरक्षक-टीजी (Thy1-YFP) HJrs/जे चूहों । यह काम जिनान सैन्य क्षेत्र के चाईनीज पीएलए 2016ZD03 (XJL), और NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 के जनरल हॉस्पिटल के निदेशक की फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, दिग्गजों के अमेरिकी विभाग से मेरिट रिव्यू अवार्ड I01 BX002356 मामले, क्रेग एच नेलसन फाउंडेशन २९६७४९, इंडियाना रीढ़ की हड्डी और ब्रेन इंजरी रिसर्च फाउंडेशन, मारी Hulman जॉर्ज बंदोबस्ती कोष (XMX) ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.