Vi beskriver en eksperimentell prosedyre for å måle neuronal aktivitet gjennom doble optiske windows over bilaterale primære somatosensory corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgene mus med 2-fotonet (2 P) mikroskopi i vivo.
Pattedyr hjernen utstillinger merket symmetri over sagittal flyet. Detaljert beskrivelse av nevrale dynamikken i symmetrisk hjernen regioner i voksen pattedyr dyr er imidlertid fortsatt flyktig. I denne studien, beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å måle kalsium dynamics gjennom doble optiske Vinduer over bilaterale primære somatosensory corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgene mus med 2-fotonet (2 P) mikroskopi. Denne metoden gjør opptak og quantifications av nevrale aktivitet i bilaterale musen områder av hjernen en samtidig i samme eksperiment for en lengre periode i vivo. Nøkkelen aspektene ved denne metoden, som kan fullføres innen en time, inkluderer minimal invasiv kirurgi prosedyrer for å lage to optiske windows, og bruk av 2P bildebehandling. Selv om vi bare demonstrere teknikken i området S1, kan metoden brukes til andre regioner av levende hjernen tilrettelegge utviklingen av strukturelle og funksjonelle kompleksiteten i hjernen neural nettverk.
Kalsium og dens regulering er viktig på formidling flere fysiologiske prosesser. Overvåking kalsium dynamics er nyttig for å forstå vanlig hjernefunksjon samt pathological betingelser hjernen lidelser 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s fluorescens er et kraftig verktøy for å kvantifisere spike tall, timing, frekvens, samt nivåer av synaptic inndata både i vitro og vivo 9,10,11.
Pattedyr hjernen utstillinger merket symmetri over sagittal flyet. Selv om nyere nevrologiske forskning har kaste lys over kortikale remodeling og neuronal aktivitet utløst av traumatiske hjernen eller ryggmargen skaden 6,7rollene som intakt vev av symmetrisk spille tilsvarende regioner i utvinning er fremdeles uklar.
I denne studien beskrive vi eksperimentelle prosedyrene for å opprette bilaterale symmetrisk optisk Vinduer for i vivo bildebehandling. Bruker disse optisk windows, beskrive vi måling av kalsium dynamikken fra primær somatosensory halvdelene (S1) i GCaMP6s transgene mus med 2P mikroskopi. I delen resultater vise vi også i vivo dendrittiske morfologi på ulike tidspunkt i regionen S1 i EGFP transgene mus med 2 P imaging. Metoden observasjon om nettverket dynamikken i bilaterale S1 områder er bare første eksempel hvordan åpne skallen Windows vil hjelpe nevrologer å undersøke lokale og symmetrisk informasjonsbehandling i voksen pattedyr hjernen i normal betingelser eller annen sykdom modeller i vivo.
To-fotonet bildebehandling kan samtidig måling av aktiviteten av mange celler med en rimelig oppløsning på opp til ca 800 µm under hjernen overflaten. Vi integrert 2P og en dobbel optisk vindu teknikk med genetisk kodet GCaMP6s å observere kalsium dynamics bestander av lag V neuronal somata ligger > 500 µm under pia. Med åpne optisk Vinduer på hver side av skallen gjør metoden opptak av nevrale aktivitet over symmetrisk pattedyr hjernen regioner for langvarig og stabil kalsium imaging i vivo. Nøkkelen aspektene ved denne metoden inkluderer ytelsen til minimal invasiv kirurgi å lage to åpne skallen optisk Vinduer og 2P imaging neuronal aktivitet i symmetrisk S1 regioner.
Undersøke nettverksaktivitet i bilaterale S1 regioner er et eksempel på hvordan skallen windows kan brukes til å undersøke lokale og symmetrisk informasjonsbehandling i voksen hjernen i vivo. Denne metoden kan også brukes til å studere neuronal aktivitet (f.eks ved hjelp av Thy1 –GCaMP6s mus) og kortikale plastisitet B6. CG-vs (Thy1– YFP) HJrs/J fra intakt vev av tilsvarende symmetrisk regionene i utvinning etter deafferentation på grunn av en ensidig CNS skade. Metoden kan også brukes til å undersøke kortikale aktivitet i respons til perifert stimulering strategier som optogenetic, elektriske eller kjemiske stimulations. Selv om vi bare demonstrere teknikken i S1-området, kan dette brukes til å undersøke aktiviteter i andre symmetrisk områder i levende hjernen som lag V nervecellene i primære motorisk cortex (M1). Observasjoner på omorganisering av hjernen regioner kan gi en neural substrat for adaptive motor atferd, som spiller en avgjørende rolle i postinjury utvinning av funksjonen. Det gjør det også mulig for kronisk måling av symmetrisk aktiviteten av genetisk identifiserte celler under virkemåte i hodet-fast mus.
Teknisk, etterforskere bør betale forsiktig oppmerksomhet til kvalitet og konsistens av dobbelt skallen windows. Tynnet skallen skallen vinduet teknikk 12 er sterkt anbefalt for nybegynnere å øve. Spines er kalsium rom deres morfologi og lokale tilstrømningen og ekstrudering mekanismer. I denne studien brukte vi B6. CG-vs (Thy1– YFP) HJrs/J mus som et eksempel å demonstrere dendrittiske ryggraden dynamikken i vivo (Figur 4). En åpen-skallen glass vindu installasjon kan forårsake høy fjellrygg omsetning og reaktive glial svar etter kirurgi 12. Derimot med tynnet skallen vinduet teknikken, kan spines og dendrites være godt bevart.
Valg av dimensjoner og tykkelser av optisk windows vil være avhengig av ønsket synsfelt, skallen kurvatur, skallen tykkelse og typen tenkelig 13. Utilstrekkelig presset av den optiske coverglasses på dura kan forårsake fortykkelse av dura, gjenvekst av skallen, og økt hjernen bevegelse. Derimot kan hardt av den optiske coverglasses hindre kortikale blodstrøm.
For optisk vindu samlingen, lim og kurere flere lag med coverglasses en samtidig med optisk lim og lang-bølgelengde UV-lyset. For å styrke den selvklebende bånd, varme fabrikkerte vinduet (50 ° C for 12 h) i en inkubator. Lagre optisk vindu coverglass i 70% (vol/vol) etanol og før operasjonen, skyll den med sterilt saltvann. Vinduet optisk må undersøkes for feil (for eksempel feil beløp av optisk klebende eller unøyaktig justering) under en stereoscope før bruk for å unngå feilen. Hvis den optiske lim er for tynn, kan luft mellomrom være brettet, som kan forårsake optisk avvik eller dekke glass avdeling på implantasjon. Derimot kan mye optisk lim forårsake overflyt forbi kantene av vinduet skallen.
Oppsummert her beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å måle kalsium dynamics eller dendrittiske morfologi gjennom skallen windows fra 2 symmetrisk primære somatosensory kortikale områder i Thy1-GCaMP6s og Thy1– YFP transgene mus, henholdsvis bruker 2P mikroskopi. Denne teknikken kan forenkle dissekere komplekse strukturelle og funksjonelle forholdet mellom neural nettverk.
The authors have nothing to disclose.
Vi er svært takknemlig til Wenbiao Gan (Skirball Institute, Institutt for fysiologi og nevrovitenskap, New York University School of Medicine, USA) for utmerket teknisk veiledning og Patti Raley, medisinsk Editor (avdeling av nevrologiske kirurgi, Indiana Universitet skolen av medisin), for redigering manuskriptet. Vi takker Dr. Jinhui Chen (Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) for å gi B6. CG-vs (Thy1– YFP) HJrs/J mus. Dette arbeidet var støttes delvis ved grunnleggelsen av direktør i General Hospital i Jinan militære regionen av kinesiske PLA 2016ZD03 (XJL), og NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, fortjener omtale Award I01 BX002356 fra USA Institutt for veteraner Saker, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ryggmarg og hjerne skader Research Foundation, Mari Hulman George begavelse midler (XMX).
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |