Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.
El cerebro mamífero exhibe marcada simetría en el plano sagital. Sin embargo, la descripción detallada de la dinámica neuronal en regiones cerebrales simétricos en mamíferos adultos sigue siendo elusiva. En este estudio, se describe un procedimiento experimental para medir la dinámica del calcio a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando microscopia de 2 fotones (2 P). Este método permite grabaciones y cuantificaciones de actividad neuronal en regiones cerebrales de ratón bilateral uno a la vez en el mismo experimento en un prolongado período en vivo. Aspectos clave de este método, que puede completarse en menos de una hora, incluyen procedimientos de cirugía mínimamente invasiva para la creación de ventanas ópticas duales y el uso de proyección de imagen de 2P. Aunque sólo nos demuestran la técnica en el área de S1, el método puede aplicarse a otras regiones del cerebro de vida facilita la aclaración de complejidad estructural y funcional de redes neuronales del cerebro.
Calcio y su regulación son esenciales en la mediación de múltiples procesos fisiológicos. Supervisión dinámica de calcio es útil para la comprensión de la función normal del cerebro así como las condiciones patológicas del cerebro trastornos 1,2,3,4,5,6 ,7,8. GCaMP6s fluorescencia de imagen es una poderosa herramienta para la cuantificación de números de punto, tiempo, y frecuencia, así como niveles de synaptic de entrada tanto in vitro e in vivo 9,10,11.
El cerebro mamífero exhibe marcada simetría en el plano sagital. Aunque recientes investigaciones neurológicas ha arrojado luz sobre la remodelación cortical y la actividad neuronal provocada por traumática cerebral o la médula espinal lesiones 6,7, las funciones de ese tejido intacto de simétricamente correspondientes regiones jugar en la recuperación son todavía desconocidos.
En este estudio, describimos los procedimientos experimentales para la creación de ventanas ópticas simétricas bilaterales para la proyección de imagen en vivo . Utilizando estas ventanas ópticas, describimos la medición de la dinámica del calcio de las cortezas somatosensoriales primarias (S1) en GCaMP6s de ratones transgénicos usando microscopia 2P. En la sección de resultados, también mostramos en vivo la morfología dendrítica en momentos diferentes en la región de S1 en los ratones transgénicos de EGFP usando proyección de imagen de 2 P. El método de observación con respecto a la dinámica de la red en las áreas S1 bilaterales es pero un ejemplo inicial de cómo dos ventanas craneales abiertas ayudará neurocientíficos para sondear información local y simétrica en el cerebro mamífero adulto en condiciones normales condiciones o en la enfermedad de diferentes modelos en vivo.
Proyección de imagen de dos fotones permite la medida simultánea de la actividad de muchas células con una resolución razonable en hasta aproximadamente 800 μm por debajo de la superficie del cerebro. Integramos 2P y una técnica de doble ventana óptica con GCaMP6s genéticamente codificados para observar la dinámica del calcio en las poblaciones de Somas neuronales capa V encuentra > 500 μm a continuación de la pia. Con una ventana óptica abierta a cada lado del cráneo, el método permite grabaciones de actividad neuronal en todas las regiones del cerebro mamífero simétrico prolongado y estable de calcio en vivola proyección de imagen. Aspectos clave de este método incluyen la realización de cirugía mínimamente invasiva para crear ventanas ópticas doble cráneo abierto y 2P proyección de imagen de la actividad neuronal en regiones simétricas de S1.
Examinar la actividad de red en regiones bilaterales de S1 es que un ejemplo de cómo dos ventanas craneales podría ser utilizado para información local y simétrica en el cerebro adulto vivo enla punta de prueba. Este método también puede utilizarse para estudiar la actividad neuronal (por ejemplo utilizando Thy1 –ratones GCaMP6s) y la plasticidad cortical B6. CG-Tg (Thy1– YFP) J HJrs de tejido intacto de las regiones simétricas correspondientes de recuperación después del deafferentation debido a una lesión unilateral del CNS. El método también puede utilizarse para examinar la actividad cortical en respuesta a estrategias de estimulación periférica como la optogenetic, estímulos eléctricos o químicos. Aunque sólo nos demuestran la técnica en el área de S1, este enfoque podría emplearse para investigar actividades en otras áreas simétricas en el cerebro de la vida como las neuronas de la capa V de la corteza motora primaria (M1). Observaciones sobre reorganización de las regiones del cerebro pueden proporcionar un sustrato neural para el comportamiento adaptativo del motor, que juega un papel fundamental en la recuperación de la función de postinjury. También permite la medida crónica de la actividad simétrica de células genéticamente identificadas durante comportamiento en ratones de cabeza fija.
Técnicamente, los investigadores deben prestar especial atención a la calidad y consistencia de duales windows craneales. Técnica de ventana craneal cráneo adelgazado 12 es muy recomendable para los principiantes a la práctica. Espinas son compartimentos de calcio debido a su morfología y mecanismos locales de afluencia y de la protuberancia. En este estudio, utilizamos B6. Ratones HJrs/J CG-Tg (Thy1– YFP) como ejemplo para demostrar de la espina dorsal dendrítica dinámica en vivo (figura 4). Una instalación de ventana de cristal del cráneo abierto puede provocar espina dorsal alta facturación y respuestas gliales reactivas después de la cirugía 12. En cambio, con la técnica ventana de cráneo adelgazado, espinas y las dendritas pueden ser bien conservadas.
Opciones de dimensiones y espesores de ventanas ópticas serán dependientes en el campo de visión deseado, la curvatura del cráneo, cráneo grueso y el tipo de imagen 13. Presión insuficiente de la óptica coverglasses en la dura puede causar engrosamiento de la duramadre, crecimiento del cráneo y mayor movimiento del cerebro. Por el contrario, una presión excesiva de la coverglasses óptica puede impedir el flujo sanguíneo cortical.
Para el montaje de la ventana óptica, pegamento y curar capas adicionales de coverglasses uno a la vez con pegamento óptico y luz UV de onda larga. Para contribuir al fortalecimiento de la vinculación adhesiva, caliente la ventana fabricada (50 ° C por 12 h) en una incubadora. Almacenar el cubreobjetos ventana óptica en etanol al 70% (vol/vol) y, antes de la cirugía, aclararlo con solución salina estéril. La ventana óptica necesita examinarse para las imperfecciones (como una cantidad incorrecta de alineación óptica adhesivo o inexacta) bajo un estereoscopio antes de su uso para evitar la falla. Si el pegamento óptico es demasiado fino, espacios de aire puede ser arrugadas, que pueden causar aberraciones ópticas o desprendimiento de la cubierta de vidrio en implantación. Por el contrario, demasiado pegamento óptico puede causar rebose más allá de los bordes de la ventana craneal.
En Resumen, aquí se describe un procedimiento experimental para medir la dinámica del calcio o morfología dendrítica a través de ventanas craneales de regiones corticales somatosensoriales primarias simétricas 2 en Thy1-GCaMP6s y Thy1ratones transgénicos – YFP, respectivamente, utilizando microscopía de 2P. Esta técnica puede facilitar enormemente la compleja relación estructural y funcional de redes neuronales de disección.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a Wenbiao Gan (Skirball Institute, Departamento de fisiología y neurociencia, New York University Facultad de medicina, EEUU) para la dirección técnica excelente y Patti Raley, Editor médico (Departamento de cirugía neurológica, Indiana Universidad Escuela de medicina), para editar el manuscrito. Agradecemos a Dr. Jinhui Chen (Instituto de investigación de Neurociencias de Stark, Indiana University School of Medicine, USA) para proporcionar B6. Ratones HJrs/J CG-Tg (Thy1– YFP). Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación del Director del Hospital General de 2016ZD03 de la región militar del PLA chino de Jinan (XJL) y NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, mérito de premio I01 BX002356 desde el Departamento de veteranos de Estados Unidos Asuntos, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana de la médula espinal y cerebro lesiones Research Foundation, Mari Hulman George fondos de dotación (XMX).
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |