Vi beskriver en experimentell förfarande för mätning av neuronal aktivitet genom dubbla optiska fönster ovanför bilaterala primära somatosensoriska corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgena möss med hjälp av 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.
Däggdjur hjärnan uppvisar markanta symmetri i sagittalplanet. Detaljerad beskrivning av neurala dynamics i symmetriska hjärnan hos vuxna däggdjur djur förblir dock svårfångade. I denna studie, beskriver vi en experimentell förfarande för mätning av kalcium dynamics genom dubbla optiska fönster ovanför bilaterala primära somatosensoriska corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgena möss med hjälp av 2-foton mikroskopi (2 P). Denna metod möjliggör inspelningar och kvantifieringar av neural aktivitet i bilaterala mus hjärnan en i taget i samma experiment för en långvarig period i vivo. Viktiga aspekter av denna metod som kan slutföras inom en timme, inkluderar minimalinvasiv kirurgi procedurer för att skapa dubbla optiska windows och användning av 2P imaging. Även om vi bara demonstrera tekniken i området S1, kan metoden tillämpas till andra regioner i den levande hjärnan att underlätta förtydligandet av strukturella och funktionella komplexiteten i hjärnans neurala nätverk.
Kalcium och dess reglering är viktiga i medla flera fysiologiska processer. Övervakning kalcium dynamics är användbara för att förstå hjärnans normala funktion samt sjukdomstillstånd av hjärnans sjukdomar 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s fluorescens är ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera spike nummer, timing, och frekvens, samt nivåer av synaptic ingång både in vitro- och in-vivo 9,10,11.
Däggdjur hjärnan uppvisar markanta symmetri i sagittalplanet. Även om senaste neurologisk forskning har belysa den kortikala remodeling och neuronal aktivitet utlöses av traumatisk hjärnan eller ryggmärgen skadan 6,7, roller som intakt vävnad av symmetriskt spelar motsvarande regioner i återhämtningen är fortfarande oklara.
I denna studie beskriver vi experimentella procedurer för att skapa bilateralt symmetriska optiska fönster för i vivo imaging. Med dessa optiska windows, beskriver vi mätning av kalcium dynamics från primära somatosensoriska cortices (S1) GCaMP6s transgena möss med 2P mikroskopi. I resultatavsnittet visar vi också i vivo dendritiska morfologi vid olika tidpunkter i regionen S1 i andra transgena möss med hjälp av 2 P imaging. Metoden observation angående nätverk dynamiken i de bilaterala S1-områdena är men ett inledande exempel hur dubbla öppna kraniala Windows hjälper neuroforskare sond lokala och symmetriska informationsbehandling i den vuxna däggdjur hjärnan i normal förhållanden eller i olika sjukdomen modellerar i vivo.
Två-foton imaging möjliggör samtidig mätning av aktiviteten hos många celler på en rimlig upplösning på upp till cirka 800 µm under hjärnan ytan. Vi integrerade 2P och en dubbla optiska fönstret teknik med genetiskt kodade GCaMP6s att observera kalcium dynamik i populationer av lager V neuronala somata ligger > 500 µm nedanför pia. Med ett öppet optiska fönster på varje sida av kraniet möjliggör metoden inspelningar av neural aktivitet i symmetriska däggdjur hjärnregioner för långvarig och stabil kalcium imaging i vivo. Viktiga aspekter av denna metod inkluderar minimalinvasiv kirurgi att skapa dubbla öppna skallen optiska windows prestanda och 2P avbildning av neuronal aktivitet i symmetriska S1 regioner.
Att undersöka nätverksaktivitet i bilaterala S1 regioner är ett exempel på hur dubbla kraniala windows kunde användas sond lokala och symmetriska informationsbehandling i den vuxna hjärnan i vivo. Denna metod kan också användas för att studera neuronal aktivitet (t.ex. med hjälp av Thy1 –GCaMP6s möss) och kortikala plasticitet B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J från intakt vävnad motsvarande symmetrisk regioner i återhämtning efter deafferentation på grund av en ensidig CNS-skada. Metoden kan också användas för att undersöka kortikal aktivitet som svar på perifer stimulering strategier såsom optogenetic, elektriska eller kemiska stimuli. Även om vi bara demonstrera tekniken i området S1, kunde detta tillvägagångssätt användas för att undersöka aktiviteter i andra symmetriska områden i den levande hjärnan såsom lager V nervceller i primära motoriska cortex (M1). Iakttagelser om omorganiseringen av regioner i hjärnan kan ge ett neuralt substrat för adaptiv motor beteende, som spelar en avgörande roll i postinjury återvinning av funktion. Det möjliggör också för kronisk mätning av genetiskt identifierade celler symmetriska aktivitet under uppförande i huvudet-fasta möss.
Tekniskt, utredare bör ägna stor uppmärksamhet åt kvaliteten och enhetligheten dubbla kraniala Windows. Tunnas-skalle kraniala fönster teknik 12 rekommenderas för nybörjare att öva. Taggarna är kalcium fack på grund av deras morfologi och lokala mekanismer för inflöde och extrudering. I denna studie använde vi B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J möss som exempel att demonstrera dendritiska ryggraden dynamics i vivo (figur 4). En öppen-dödskalle glas fönster installation kan orsaka hög ryggrad omsättning och reaktiva gliaceller reaktioner efter kirurgi 12. Däremot med tunnas-skalle fönster teknik, kan ryggar och dendriter väl bevaras.
Val av dimensioner och tjocklekar av optiska windows kommer att vara beroende av önskad synfältet, skalle krökning, skalle tjocklek och typ av imaging 13. Otillräcklig trycket av den optiska täckglas på dura kan orsaka förtjockning av dura, återväxt av skallen, och ökade hjärnan motion. Däremot kan övertryck av den optiska täckglas hindra kortikala blodflödet.
För optiska fönster montering, lim och bota ytterligare lager av täckglas en i taget med optisk självhäftande och lång våglängd UV-ljus. För att bidra till att stärka självhäftande limning, varma fönstret fabricerade (50 ° C i 12 h) i en inkubator. Lagra den optiska fönstret täckglas i 70% (vol/vol) etanol, och innan operationen, skölj den med steril koksaltlösning. Den optiska fönstret behöver undersökas för brister (t.ex. ett felaktigt belopp av optiska självhäftande eller felaktig justering) under ett stereoskop innan användning för att undvika fel. Om optiska limmet är för tunn, kan luftvolymer vara skrynkligt, vilket kan orsaka optiska avvikelser eller skyddsglaset lossnar vid implantation. Däremot kan för mycket optisk lim orsaka dataspill förbi kanterna på fönstret kraniala.
I sammanfattning, här beskriver vi en experimentell förfarande för mätning av kalcium dynamics eller dendritiska morfologi genom kraniala windows från 2 symmetriska primära somatosensoriska kortikala regioner i Thy1-GCaMP6s och Thy1– YFP transgena möss, respektive använda 2P mikroskopi. Denna teknik kan underlätta dissekera komplexa strukturella och funktionella förhållandet av neurala nätverk.
The authors have nothing to disclose.
Vi är mycket tacksamma mot Wenbiao Gan (Skirball Institute, Institutionen för fysiologi och neurovetenskap, New York University School of Medicine, USA) för utmärkt teknisk vägledning och Patti Raley, medicinsk redaktör (Institutionen för neurologisk kirurgi, Indiana University School of Medicine), för redigering manuskriptet. Vi tackar Dr. Jinhui Chen (Stark neurovetenskap Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) för att tillhandahålla B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J möss. Detta arbete var stöds delvis av stiftelsen av direktören av allmänt sjukhus av Jinan militära regionen av Chines PLA 2016ZD03 (XJL), och NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit granskning Award I01 BX002356 från den amerikanska Institutionen för veteraner Frågor, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ryggmärgen och hjärnan skada Research Foundation, Mari Hulman George kapitalfonder (XMX).
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |