Summary
Ce protocole décrit un roman en trois dimensions in vitro model, où les cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales sont élevées ensemble afin d’aider à l’examen et la compréhension des interactions entre les deux types cellulaires.
Abstract
Génie tissulaire a acquis une reconnaissance considérable en raison de la forte demande pour les remplacements de la cornée humaine avec environ 10 millions de personnes dans le monde souffrent de perte de vision cornéen1. Pour répondre à la demande de cornées humaines viables, des progrès significatifs dans le tissu en trois dimensions (3D) génie a2,3,4. Ces cornée modèles allant des systèmes monocouche simple aux modèles multicouches, menant à 3D pleine épaisseur cornéenne équivalents2.
Cependant, l’utilisation de la 3D corné tissulaire dans le contexte des modèles in vitro de maladies étudiées à date n’a pas de ressemblance avec la structure multicouche du tissu cornéen 3D, la fonction et la mise en réseau des différents types de cellules (c.-à-d., nerf, épithélium, stroma et l’endothélium)2,3. En outre, la demande pour les modèles de tissus in vitro cornée a augmenté dans le but de réduire l’expérimentation animale pour les produits pharmaceutiques. Ainsi, des modèles plus sophistiqués sont nécessaires afin de mieux correspondre aux besoins physiologiques humaines, les systèmes et le développement d’un modèle qui est plus pertinent à la population de patients est absolument nécessaire. Étant donné que plusieurs types de cellules de la cornée sont touchés par les maladies et les dystrophies musculaires, tels que le kératocône, kératopathie diabétique et Fuchs, ce modèle comprend un modèle 3D de co-culture de fibroblastes cornéens humaines primaires (CS) de donneurs sains et les neurones de la lignée de cellules SH-SY5Y. Cela nous permet pour la première fois étudier les interactions entre les deux types de cellules dans le tissu de la cornée humain. Nous croyons que ce modèle pourrait potentiellement disséquer les mécanismes sous-jacents liés à des interactions stroma-nerf de maladies de la cornée qui présentent des dommages de nerf. Ce modèle 3D reflète la nature fondamentale d’anatomique et physiologique du tissu cornéen in vivo et peut servir à l’avenir comme un outil pour étudier les défauts cornéens ainsi que l’efficacité des divers agents de dépistage avant l’expérimentation animale.
Introduction
Dans le corps humain, la cornée est un tissu plus densément innervé. Les nerfs sont responsables pour des sensations variées comme le toucher, la douleur, température et ont également un rôle essentiel dans la guérison des plaies, réflexes de cligner des yeux, déchirer la production et la sécrétion5,6,7. Dans la cornée, stromales troncs nerveux proviennent du plexus limbique et entrer dans le stroma cornéen périphérique radialement. L’organisation nerveuse stromales est parallèle aux lamelles de collagène et elles davantage créer une branche en petits fascicules comme ils aller de l’avant vers le stroma superficiel5,8. Les fibres nerveuses plus pénétrer la couche épithéliale et ainsi, innervation est largement étalée dans l’épithélium de la cornée et le stroma. Par conséquent, une innervation a un rôle essentiel dans l’état sain et malade de la cornée. Dans ce protocole, nous révélons la promotion d’un modèle nouveau 3D in vitro , qui est le premier du genre à simuler les interactions de stroma-nerf in vivo . La lignée SH-SY5Y a été utilisée pour cette étude, car il est une des lignes plus établis, bien caractérisés, utilisés pour étudier la croissance neuronale. La lignée SH-SY5Y a été décrite pour produire les deux adhérentes de substrat (type S) et les cellules neuroblastiques (type N) qui peut subir la transdifférenciation9. Ainsi, même si cette lignée cellulaire provient d’une sélection de triple sous-clone successives de cellules de type N, il contient également un petit nombre de cellules de type S capables de subir une différenciation dans les neurones grâce à l’utilisation de retinoic acid et encéphales Neurotrophic factor9. Ceci fournit un outil qui peut conduire à une meilleure compréhension des cornée complications associées de la rétinopathie diabétique (DM) et d’autres maladies oculaires. En raison des difficultés liées à l’obtention et la culture de neurones provenant de patients atteints de maladie oculaire, ce modèle 3D en vitro fournit des conséquences majeures en étudiant les interactions neuronales et la signalisation avec le stroma cornéen.
Conditions de malades affectent souvent divers tissus du corps à très grande échelle, menant à une qualité de vie compromise. Dystrophies oculaires sont des complications fréquentes, souvent associées aux maladies systémiques et conduire à la perte d’acuité visuelle ou une perte de vision voire permanente. Études approfondies sont souvent indispensables pour une meilleure compréhension de la maladie ainsi que les effets au niveau cellulaire basal. Afin d’étudier les effets de ces maladies, les différents modèles in vivo et in vitro ont été développés avec l’aide d’applications en génie tissulaire. Applications d’ingénierie du tissu cornéen ont suscité grand intérêt dans des domaines variés des sciences10,11,12,13,14, mais il y a des limitations majeures subsistent pendant application effective, y compris cornée greffe rejets, infections et cicatrices10,11,12,13,14. Il existe plusieurs études qui ont avec succès développé et mis en place diverses in vitro modèles3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Les modèles 3D in vitro sont les plus prometteurs et d’un grand intérêt scientifique. Les modèles 3D sont connus pour mieux refléter l’in vivo événements cellulaires et physiologiques qui sont essentiels au cours de la fibrose et enroulé de guérison15,27,28,29. Ces modèles in vitro jouent un rôle essentiel dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des différentes pathologies dont les complications cornéennes. Malgré le rôle essentiel de l’innervation en fonctions de la cornée, peu d’efforts accompli pour promouvoir la prolifération des nerfs périphériques au sein des constructions tissulaire cornéenne2,3. Toutefois, les constructions de cellule projet 3D en vitro imitent le tissu cible afin de réaliser la fonctionnalité désirée de tissu.
Kératopathie diabétique est une application évidente pour le modèle décrit ici les défauts neuronale, il y a plusieurs autres maladies de la cornée qui peuvent bénéficier d’un modèle humain in vitro y compris dystrophies kératocône et Fuchs. Notre modèle 3D se dégage de cette perspective et propose le développement d’une représentation in vitro de tissu cornéen pour évaluer l’administration de médicaments et de la sécurité des nouveaux médicaments oculaires.
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Protocol
Ce protocole suit les directives de la Commission de révision de l’Université d’Oklahoma Health Sciences Center/institutionnel (CISR #4509). Toutes les parties du protocole a rencontré les principes de la déclaration d’Helsinki. Cornée échantillons ont été prélevés de développement National et Research Institute (NDRI) et la Banque des yeux Lions Oklahoma.
1. isolement de cellules primaires
- Dès réception des échantillons de tissus cornée humaine, transférer les tissus dans un 21,5 cm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile (SPD) (1 x).
- Gratter et enlever l’épithélium cornéen en positionnant la cornée dôme face vers le haut. Afin d’assurer l’élimination complète, gratter la couche épithéliale soigneusement à l’aide d’une lame de rasoir à un angle de 45°. Ensuite, retournez la cornée dôme face vers le bas et grattez soigneusement l’endothélium du stroma avec une lame de rasoir à un angle de 45° pour assurer l’élimination complète. Laver le tissu stromal avec le SPD.
- Couper les tissus stromales en petits morceaux, à l’aide d’une lame chirurgicale du numéro 10, gardant les morceaux stromales mouillés lors de tous les temps à l’aide de SPD. Ramasser stromales morceaux avec une pince stérile et la place dans une fiole de la culture du T25 sans médias (4 ou 5 morceaux de tissu de 2 x 2 mm par flacon).
- Laissez les explants d’adhérer au fond de la fiole à 37 ° C pendant environ 30-40 min. Une fois collé, ajouter lentement le minimum indispensable milieu Eagle (EMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % antibiotique/antimycosique au ballon sans déranger les explants.
- Placer délicatement le ballon dans l’incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2. Laisser les explants jusqu'à ce que les cellules commencent à isoler et migration dans le ballon. Après environ 2 à 4 semaines, les cellules devraient atteindre 100 % confluence. À la confluence de 100 %, les cellules de passage en enlevant les milieux de culture de tissu et laver les cellules avec le SPD.
- Ajouter la trypsine aux cellules et puis les incuber à 37° C. Après environ 5 min, Découvre les cellules sous microscopie pour confirmer qu’ils ont détaché et puis arrêter la protéolyse en ajoutant les supports neufs.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL pour centrifugation à 1 000 x g. éliminer le surnageant soigneusement sans déranger le culot et suspendre les cellules en EMEM frais 10 % BF 1 % aux antibiotiques. Compter les cellules et les graines environ 1 x 106 cellules en flacon de culture T75 pour poursuivre son expansion avec EMEM frais 1 % FBS 1 % aux antibiotiques.
2. primaire CS Culture et assemblage de constructions 3D
- Montage 3D constructions d’explants auparavant cultivés en EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, passage et comte cs.
- Graines environ la 1 x 106 cellules/puits de primaires CS sur inserts membrane en polycarbonate avec pores 0,4 µm des constructions 3D, ainsi que de 1,5 mL de EMEM frais 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique jusqu’au sommet de la construction. Ajouter un autre 1,5 mL de ces mêmes médias au fond de chaque construction.
- Après 24 h d’ensemencement de la cellule, la culture des cellules avec EMEM 10 % BF 1 % antibiotique/antimycosique, stimulée par l’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamine C) de 0,5 mM par ajoutant 1,5 sur le dessus et 1,5 mL sur la partie inférieure de chaque construction.
- Maintenir les cultures dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 semaines et fournir les supports neufs, tous les deux jours pendant toute la période témoin. Aucun autre passage n’est nécessaire.
3. différenciation et des cultures de cellules
- Après 3 semaines, ajoutez 8 x 103 cellules/puits de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y sur le dessus de la 3D déjà assemblé construit contenant 1,5 mL de la EMEM contenant 10 % BF, 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 1 % antibiotique/antimycosique et 0,5 mM Acid (vitamine C).
- Laissez les cellules de neuroblastome SH-SY5Y de croître sur le dessus les cellules stromales de la cornée pendant au moins 24 h avant d’initier la différenciation cellulaire.
- Initier la différenciation des cellules SH-SY5Y en stimulant les cellules avec EMEM contenant 1 % FBS et 1,5 mL de 10 µM acide rétinoïque sur le dessus de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape de l’acide rétinoïque doit être exécutée dans l’obscurité.
- Continuer à la culture des cellules dans les médias de cette différenciation pendant 5 jours.
- Lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, passer les cellules à 1,5 mL de milieu sans sérum contenant 2 nM de Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) et 1 % antibiotique/antimycosique ajouté à la EMEM, en ajoutant au début de la construction. Ajouter 1,5 mL de la EMEM FBS 1 % antibiotique/antimycosique 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acide à 10 % (vitamine C) vers le bas de la construction. Veuillez noter que l’étape BDNF doit être exécutée dans l’obscurité.
- La culture des cellules pour 2 jours supplémentaires avant le traitement pour une analyse ultérieure, comme il est indiqué dans le tableau 1.
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Representative Results
La figure 1 présente une image représentative étape par étape du travail 3D in vitro modèle. Lors de la première étape, les cellules sont isolées de cornées humaines. Puis, ils sont cultivés sur une membrane en polycarbonate et stimulés par la vitamine C pour assembler une matrice 3D automatique sécrétée. Ce système de construction 3D induit la synthèse d’un multicouche cellulaire in vivo-comme matrice stromal. Par la suite, les cellules de neuroblastome sont semés sur le dessus les cellules stromales suivis en lançant la différenciation des cellules neuronales. Cela conduit à la co-culture des cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales dans le modèle 3D en vitro . La figure 2 est l’image de microscopie électronique (met) de transmission de grossissement élevé de la construction 3D auto-assemblés (Figure 2 a) montrant la membrane en polycarbonate et les cellules du stroma cornéens boutonnée sur le dessus, qui sécrètent une matrice auto-assemblés suivie par (Figure 2 b) des cellules neuronales différenciées ensemencé sur le dessus, montrant un arrangement neuronale de cellules stromales. Les flèches sur l’image montrent des cellules neuronales. Compte tenu de la diaphonie directe entre le stroma cornéen et les cellules neuronales, nous pensons que les joueurs clés qui affectent la régulation des cornée défauts existent dans la couche de stroma. Par conséquent, ce modèle présente un homme neuronal en vitro modèle différenciation SH-SY5Y neuroblastome cellules dans une morphologie neuronale durable en les associant à notre modèle 3D précédemment établie de la matrice extracellulaire (ECM) cultivant avec divers facteurs de différenciation. Ainsi, nous croyons que ce modèle permettra aux futures études des différences morphologiques et moléculaires entre ECM sain et malade. Nous croyons que ce modèle roman 3D in vitro aidera à disséquer des aspects cruciaux des interactions stroma cornéen-nerf associées à une pathologie cornéenne et ouvrir la voie pour le développement de nouvelles thérapeutiques.
Figure 1 : illustration Image montrant le modèle 3D en vitro co-culture de manière graduelle. Cette image montre l’isolement des cellules de la cornée humaine et des cellules stromales ensemencé sur une membrane en polycarbonate, situé dans la construction 3D, cultivées en EMEM et stimulé avec vitamine c. En outre, les cellules neuronales différenciées sont indiqués pour l’ensemencement sur le dessus les cellules stromales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Image TEM fort grossissement du système 3D in vitro . Arrangement de cellules stromales (A) sur le dessus de la membrane en polycarbonate. (B) ensemencée différencié des cellules neuronales sur le dessus les cellules stromales. Barreaux de l’échelle = 500 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Techniques d’analyse | Répercussions possibles |
| Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction | Enquêter sur les marqueurs de collagène (Col I, III Col et Col V), marqueur fibrotique alpha-Smooth muscle actine (α-SMA) et des médiateurs clés en DM comme facteur de croissance insuline-1 (IGF-1) et il est le récepteur (IGF1-R) |
| Microscopie électronique à transmission | Des changements structurels sont étudiées comme des fibrilles de collagène et les interactions cellule-ECM |
| Immunofluorescence | Utilisation d’anticorps spécifiques chimiquement conjugué à un colorant fluorescent pour enquêter sur les antigènes cellulaires |
Tableau 1 : Techniques d’analyse.
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Discussion
Plusieurs études ont surtout portés sur le développement de divers modèles animaux peuvent aider à développer une meilleure compréhension des maladies de la cornée ainsi que découvrir des traitements. Toutefois, une valeur significative pour les humains de ces études n’a pas été vérifiée. A ce jour, différents modèles in vitro ont été mis au point et largement étudiés en raison de leur importance clinique remarquable. Notre modèle établie antérieurement 3D in vitro est un système novateur qui significativement contribue au progrès de la science médicale dans la recherche de vision et montre la capacité Immaculée de récapitulant en vivo événements in vitro28 , 29 , 30. le présent protocole vise à développer la prochaine génération de ce modèle in vitro cornée qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de complications associées aux maladies de la cornée comme diabétique kératopathie, kératocône et Fuchs. Ces progrès pourraient fournir des bases solides à la découverte de nouveaux traitements qui sont indispensable sur le plan clinique.
Ce modèle peut aider à identifier les différentes altérations structurales et cellulaires prenant place en DM et autres maladies de la cornée. Ceci fournit des conséquences majeures, y compris la possibilité pour le dépistage de ces maladies à un stade initial pour aider avec la gestion de la maladie. Le modèle proposé ici est simple, mais il est très innovant. L’un des principaux avantages est que les cellules du stroma cornéens sont autorisés à sécréter et assembler leur propres ECM au lieu d’être tête de série dans un environnement artificiel. En outre, les nerfs sont permis de différencier aux interactions de nerf stroma cornéen avec plus de précision modèle. Par conséquent, cette méthode offre la possibilité d’étudier le stroma cornéen humain et réseau de nerfs, ainsi que les cellules qui se trouvent dans l’environnement de stroma. Cette plate-forme culturelle permettra de nouvelles études des interactions cellule-cellule et cellule-matrice complexes qui influent sur les Etats malades de la cornée. Cette approche de modèle 3D en vitro est prévue pour fournir amélioré et roman aperçu le mécanisme de la maladie, particulièrement par rapport aux cours classiques culture des systèmes ou des modèles animaux.
La génération décrite ce modèle 3D en vitro ouvrira la voie pour futurs traitements thérapeutiques et de découvertes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier sincèrement le Dr Ben Fowler pour son aide technique avec les expériences TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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