Summary
Vi tilbyr en protokoll for imaging intracellulær pH i en epithelial stamcelleforskningen slektslinje i levende Drosophila ovarian vev. Vi beskriver metoder for å generere transgene fluer uttrykke en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bilde biosensor med kvantitative fluorescens imaging, standard kurver genererer og konvertere fluorescens intensitetsverdiene til pH-verdier.
Abstract
Endringer i intracellulær pH (pHi) spille en viktig rolle i regulering av mange cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, spredning og differensiering. Vanligvis bestemmes pHi dynamikken i kulturperler celler som er mottagelig for å måle og manipulere eksperimentelt pHi. Men har den siste utviklingen av nye verktøy og metoder gjort det mulig å studere pHi dynamikken i intakt, levende vev. For Drosophila forskning, en viktig utvikling var generasjonen av transgene linjen bærer en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Her beskriver vi en protokoll som vi rutinemessig bruker for bildebehandling live Drosophila ovarioles å måle pHi i epithelial hårsekken stilk cellen (FSC) avstamning i mCherry::pHluorin transgene vill-type linjer; men kan metodene som er beskrevet her enkelt tilpasses for andre vev, inkludert fløyen plater og øye epitel. Vi beskriver teknikker for å uttrykke mCherry::pHluorin i FSC avstamning, opprettholde ovarian vev under live bildebehandling, og anskaffe og analysere bilder for å få pHi verdier.
Introduction
Nyere studier viste en rolle for endringer i pHi under cellulære differensiering og dysplasia vivo1,,2. Disse studiene fant at pHi er bemerkelsesverdig konsekvent i celler av samme type på samme scene differensiering, men at den endres mens celler overgangen fra ett stadium til et annet. I noen tilfeller forstyrrer blokkerer endringene i pHi delvis differensiering, antyder at endringen i pHi er ikke bare en konsekvens av endringer i celle skjebne, men i stedet bidrar til å fremme endring i cellen skjebne, kanskje gjennom effekter på pH-sensitive regulatoriske proteiner eller kjemiske reaksjoner kreves for differensiering. Fremtidige studier har potensial til å avsløre mer innsikt i de mange forskjellige rollene av pHi dynamikken i vivo. Imidlertid er en av utfordringene med å studere pHi under differensiering i vivo å få nøyaktige målinger av pHi. I motsetning til andre funksjoner av differensiering, for eksempel endringer i mobilnettet morfologi og genuttrykk, er pHi en labil kjemiske egenskaper av cellen som ikke beholdes i celler som er fast og permeabilized med standard metoder. I tillegg kan pHi ikke være stabil i celler som er stresset eller døende som følge av eksperimentelle manipulasjon. Derfor er det viktig å holde cellene i live og så frisk som mulig når du måler pHi. Flere viktige fargestoffer er tilgjengelig som fungerer bra for måling pHi celler i kultur3, men i mange tilfeller de ikke er egnet for i vivo studier fordi de ikke trenge gjennom vevet dypt eller jevnt nok til å gi presise målinger .
For å omgå problemet med dårlig fargestoff penetrasjon, har vi og andre brukt en genetisk kodet sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, som kan uttrykkes i cellen typer av interesse og fotografert i levende vev. pHluorin er en variant av GFP med en høyere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som kaster mer lett på høyere pH; så total fluorescens intensiteten slippes ut fra en befolkning på pHluorin molekylene i cellen øker med økende pHi8. Viktigere er fluorescens lineær innenfor normalområdet cytosolic pHi verdier. I kontrast, fluorescens av mCherry (pKa ~ 4.5) er bokstaver pH endringer innen cytosolic. Disse to journalister kobles covalently sammen i en enkelt chimeric protein, kodet av en åpen leseramme, så de er alltid til stede i like mengder. Forholdet mellom pHluorin til mCherry fluorescens intensitet gir derfor en måling av pHi som er normalisert til sonde konsentrasjonen i hver celle. Forholdstallene kan deretter konverteres til anslag over pHi verdier ved hjelp av en standard kurven som genereres ved å få tak i pHluorin til mCherry prosenter fra vev som har vært equilibrated kjent pH-verdier.
Her beskriver vi metodene for å bruke mCherry::pHluorin til å måle pHi av epitelial FSC slektslinje i Drosophila eggstokken. Dette godt karakterisert vevet er brukt til å modellere mange ulike aspekter av epitelial biologi, for eksempel stamcelleforskningen selvtillit fornyelse og differensiering9,10,11, kollektive celle migrasjon12 , samt utvikling og vedlikehold av cellen polaritet13,14. Hårsekken epitel er produsert av to FSCs som befinner seg på fremre kant av vevet i en struktur som kalles germarium15,16. Disse cellene dele regelmessig voksen selvstendig fornye og produsere avkom, kalt prefollicle celler (PFK), som kan skrive inn nisje og bli en FSC eller skille ut en av tre forskjellige hårsekken celletyper: polar celler, stilk celler, eller hoveddelen hårsekken celler. Vi viste tidligere at i wildtype vev, pHi øker jevnt i de tidlige stadiene av differensiering, fra en pHi av ca 6.8 i FSCs 7.0 i pFCs, til 7.3 i hårsekken celler2. Blokkerer denne økningen av RNAi knockdown av en overalt uttrykt natrium/proton exchanger, DNhe2, alvorlig svekker pFC differensiering, mens øke pHi ved overuttrykte DNhe2 forårsaker en mild overflødig differensiering fenotypen. Disse funnene viser at pHi opprettholdes stabilt i tidlig FSC avstamning og at det kan være eksperimentelt økt eller redusert i vivo. Metodene som er beskrevet her kan brukes til å måle pHi i wildtype vev eller ulike former for mutant vev, inkludert RNAi knockdown eller overuttrykte med en Gal4 av interesse, og mitotisk kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: for å måle pHi i FSC avstamning, vi beregne forholdet mellom fluorescens intensiteter av pHluorin til mCherry i FSCs og pFCs hårsekken celler i fysiologiske forhold, og konvertere forholdstallene i pHi verdier med standard kalibrering kurver for hver celle type 7. Første, live bildebehandling eksperimenter utføres for å måle fluorescens intensiteter av pHluorin og mCherry i germaria deles opp i en buffer som inneholder NaHCO 3, som etterligner fysiologiske forhold 1 , 7. neste, standard kurver genereres ved å måle pHluorin og mCherry fluorescens bakgrunnsintensitetene i en Na +-gratis, K + buffer med ionophore nigericin justert til to ulike pH-verdier, 6.5 og 7.5. I nærvær av nigericin equilibrates pHi med pH i bufferen i plasma membranen, forårsaker pHi tilsvarer ekstracellulære pH. Til slutt, standard kurvene brukes til å konvertere pHluorin til mCherry forhold til anslagsvis pHi verdier.
1. pre-rettssaken: Forberedelse før måle pHi I Vivo
Merk: for å måle pHi i vivo, mCherry::pHluorin transgene må uttrykkes i celle type interesse. Nedenfor er noen vanlige måter å generere transgene pHluorin flyr i FSC avstamning. Genererer mCherry::pHluorin kloner er spesielt nyttig for å identifisere FSCs, som ligger på den fremre kanten av en FSC-klone. Vev bestemte mCherry::pHluorin er nyttig for å måle pHi over hele vevet og er også mer praktisk når kombinere med uttrykk for en RNAi eller transgene.
- Generasjon av transgene pHluorin flyr
- mCherry::pHluorin-merket FSC kloner
- å gjøre mCherry::pHluorin FSC kloner, krysse UAS-mCherry::pHluorin 1 til en Act-Gal4 flipout lager eller andre lager med en Flp/FRT induserbart Gal4.
- For å gjøre heatshock induserbart kloner, heatshock voksen F1s for 2 dager legge eclosion i tomme flasker 1t i et 37 ° C vannbad, fire ganger omtrent hver 12 h.
- For å sikre normal vekst og maksimale utbredelsen av oogenesis i denne perioden, opprettholde fluer ved å gi ferske våt gjær (omtrent like deler tørr baker ' s gjær og vann) daglig i minst 6 dager etter klone induksjon.
- Vev bestemte mCherry::pHluorin uttrykk
- krysser UAS-mCherry::pHluorin 1 til en hårsekken celle bestemt driver, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
- 3 dager etter fluer starter eclosing, samle og plassere dem i hetteglass med våt gjær, for minst 24 timer før disseksjon.
- mCherry::pHluorin-merket FSC kloner
- Gjør løsninger
Merk: det er viktig å forberede følgende bufferne ved eksperimentet fordi pH og stoff konsentrasjonen i bufferen kan endres over tid.- Forberede bikarbonat, nigericin og disseksjon buffere. Legge til komponenter i rekkefølgen oppført for å unngå dannelse av precipitates (se tabell 1 og tabell 2 tabell 3).
2. Prøve: Måle pHi i FSC avstamning
Merk: disseksjon, montering og live imaging trinnene for bikarbonat buffer og nigericin buffer betingelser må utføres to ganger: å bestemme mikroskopet innstillingene og en gang for å hente prøvedata. Se delen 2.2 nedenfor for mer informasjon.
- Disseksjon og montering
Merk: For materialer som kreves for å utføre dette trinnet se figur 1 og Tabell for materiale. For 3D utskriften montering chambers tilbys 3D skriverfiler som supplerende fil 1 og supplerende fil 2.- Disseksjon:
- forberede montering kammer ved å bruke et tynt belegg av vakuum fett flatere siden av 3D trykt montering kammer. Plasser den siden på en 22 x 40 mM dekkglassvæske å forsegle dekkglassvæske til montering chamber.
- Dissekere eggstokkene fra kvinnelige voksen fluer i 500 µL disseksjon buffer (bicarbonate eller nigericin buffer, tabell 3)
- bedøve 3-4 fluer med CO 2 gass og overføre flyr på et fly pad parfyme med CO 2 gass.
- Plukke opp en bedøvet fly med tang og sted i disseksjon media.
- Klemme thorax fly med en tang, mens slite på tuppen av buken til sin eggstokkene er utsatt.
- Etter frakobling eggstokkene fra andre organer, erte hverandre ovarioles med 22 1/2 sprøyte nåler. Nøye separat muskelen skjede fra eggstokkene og egen personlige ovarioles fra klyngen av ovarioles. En effektiv teknikk å isolere muskel skjede er å bruke en sprøyte nål holder klyngen av ovarioles på plass på fremre enden og hjerneslag nedover langs én ovarioles.
- Ruge dissekert eggstokkene i disseksjon medier for nøyaktig 10 min før du fortsetter til montering trinn slik at det er nok tid for pHi celleområdet til fullt equilibrate med pH i nigericin disseksjon media.
Merk: Kontroller at muskel skjede fjernes fra ovarioles. Muskel skjede kan attenuere fluorescens signalet, som gjør det vanskelig å identifisere individuelle celler ved hjelp av Concanavilin-A, og kan forårsake ovarioles flytte spontant under live bildebehandling.
- Montering
- Legg en liten dråpe disseksjon medier på glass dekkglassvæske inne i montering kammeret.
- Overføring atskilt ovarioles ved hjelp av pinsett.
- Skille senere stadium egg kamre fra germaria forbundet med tidligere scenen egg chambers, og prøve å sikre at den dissekert germaria er plassert i sentrum av disseksjon media drop.
- Legge til to små dråper neglelakk motsatte sider av en runde 12 mm dekkglassvæske og la det lufttørke for ca 10 s.
- Sted rundt dekkglassvæske på miste disseksjon medietyper som inneholder atskilt germaria slik at den siden med neglelakk vender og kontakter disseksjon media. Trykk ned på deler av kanten med neglelakk flat og sikre germaria i posisjon. Vi anbefaler å bruke eldre neglelakk fordi det smøres utover mindre over overflaten av dekkglassvæske som det sikres på plass.
- Fylle montering kammeret med ekstra disseksjon media. Tilstand tjenestespesifikke bufferen som ikke inneholder Concanavalin-en farge kan brukes til å fylle kammeret.
Merk: Den totale tiden tilbrakte dissekere og montering bør ikke overstige 15 min. Dette er viktig å minimere effekten av skade på vev og celle død.
- Disseksjon:
- Live bildebehandling:
Merk: I dette trinnet først samle bilder fra betingelsen bikarbonat og to nigericin forhold til å fastslå innstillingen riktig mikroskop; justere mikroskop behov og deretter samle bilder for eksperimentelle data. Bruke AC confocal mikroskop kan bildebehandling i 3 kanaler: GFP (475 eksitasjon/509 utslipp), mCherry (575 eksitasjon/610 utslipp), og langt rødt (633 eksitasjon/647 utslipp).
Merk: Mikroskop innstillinger: pixel intensiteten av bildene samlet vil kvantifiseres for å fastslå anslag over pHi, så det er viktig at intensitetsverdiene for signalet i hvert bilde er verken for lite eller mettet. Hvilket innhold som kan være fanget i et bilde er definert av bitdybde for bilde. 8-biters bilder er generert av standard i mange tilfeller, men vi anbefaler henter dataene som 16-bits bilder, som har et bredere dynamisk område. Det er viktig å sikre at crosstalk mellom fluorescerende kanaler minimeres, slik at innstillingene skal justeres slik at utslipp spektrum samlet fra hver fluorophore ikke overlapper. For å teste innstillingene, ta et testbilde ved hjelp av eksitasjon spekteret for GFP og samle i utslipp spektrum for mCherry og omvendt. Hvis innstillingene er justert riktig, bør det være noe signal uansett. Satt mikroskop innstillingene (dvs., spenning innstillinger på en laserskanning AC confocal, laser makt og pinhole størrelse) slik at pixel intensiteten av signalet i alle tre image sett er innenfor dynamisk spekter av bildefilen. For alle våre eksperimenter brukte vi et hvitt lys laserskanning AC confocal mikroskop med en 40 x mål for å kjøpe 16-bits bilder i 1024 × 1024-format, mens vi optimalisert spenning gevinst for hvert eksperiment etter behov. For eksempel i et eksperiment, vi setter spenningen gevinst for GFP, mCherry, og langt rødt som 37,8% 72.9% og 260%, henholdsvis.- Bilde ovarioles nigericin disseksjon buffer ved pH 6,5 og justere innstillingene slik at pixel intensiteter av pHluorin og mCherry bildene er lav, men ikke under grensene for påvisning av kameraet.
- Bildet et annet sett med ovarioles i nigericin disseksjon buffer ved pH 7.5 og justere innstillingene slik at pixel intensiteten av pHluorin og mCherry bildene er høy, men ikke mettet.
- Bilde eggstokkene i bikarbonat disseksjon buffer og sikre at pixel intensiteten av pHluorin og mCherry bildene ikke er mettet med de valgte innstillingene. Hvis pikslene er mettet, justere innstillingene etter behov.
Merk: Mikroskop innstillingen parametere kan variere basert på nøyaktig mikroskop oppsettet som brukes, og må være optimalisert for hvert eksperiment. Etter mikroskop innstillinger er angitt, endrer ikke dem for resten av eksperimentet. Innstillingene bør være konsekvent på tvers av kontroll og eksperimentelle forhold. Vår første pHi eksperimenter, vi generert 2 og 3 punkt nigericin kalibrering kurver og fant ingen signifikant forskjell mellom beregnede pHi bruke enten metoden. Men generelt, forventes tillegg av flere poeng i kalibreringskurven å forbedre nøyaktigheten. Derfor anbefaler vi genererer kurver med ulikt antall poeng å bestemme hvor mange kreves for et gitt sett av eksperimentelle forhold.
- Datainnsamling:
- utføre disseksjon, montering og imaging prøvene i bikarbonat og nigericin buffer forhold. Etter disseksjon og montering, maksimal tid imaging ett sett av prøver må ikke overstige 45 min for å sikre at fluorescens intensitet målingene er laget i live, sunt vev.
- For hver tilstand, hente bilder for minst 5 germaria.
3. Etter prøve: Image Analysis
- mål fluorescens bakgrunnsintensitetene i FSCs, pFCs, og hårsekken celler
- bakgrunn subtraksjon:
- Åpne ubehandlet bilder i FIJI med hver kanal i et eget vindu ( figur 4C).
- Bruk Rektangelverktøy til å tegne et område av interesse (ROI) i vinduet pHluorin kanal i en del av bildet uten signal.
- Valgfritt trinn: Angi nedre grense for terskelen piksler med intensitetsverdiene under bakgrunn ekskludert og sett den øvre grensen av terskelen til maksimum. Når terskelen er på denne måten, områdene i bildet uten signal er det meste blå og signalet er synlig ( figur 4A).
- Måle mener fluorescens intensiteten i Avkastningen. Hvis terskelen ble angitt i trinn 3, sørg for å sjekke den " grensen terskelen " i dialogboksen angi målinger.
- Trekke målt bakgrunn intensiteten fra hver kanal og stykke bildet med funksjonen trekk fra, i prosessen → matematikk menyen.
- Gjenta trinn 3.1.1.2-6 det mCherry kanal vindu bortsett fra at, i trinn 3.1.1.2, stedet for å trekke et nytt rektangel med rektangelverktøyet, bruke funksjonen Gjenopprett utvalg, finnes i Rediger → valgmenyen, legge til et rektangel med samme dimensjonen og posisjonen på bildet.
- Identifisere FSCs, pFCs og hårsekken celler:
- identifisere FSCs, pFCs, og hårsekken celler av morfologi og plassering ved hjelp av den Concanavalin-A flekker for å finne cellekantlinjene ( figur 2).
- FSCs er tynne trekantet celler i utkanten av germarium regionen 2a/2b grensen. Hvis mCherry::pHluorin er uttrykt i en FSC klone, FSC kan også bli identifisert som den fremre cellen av klone.
- pFCs er uregelmessig formet celler i regionen 2b, rett ved siden og nedstrøms FSCs.
- Hårsekken celler er firkantet eller kolonne celler som omgir bakterie celle cyste i regionen 3.
- Få fluorescens intensitet prosenter
- velge ett eller flere stykker der cellen rundt har høyeste fluorescens intensiteten i mCherry kanalen og sørge for at Concanavalin-A farging, sett i langt rødt kanalen, er foc oss innenfor den valgte sektoren.
- Trekke ROI rundt hver FSC og måle mener fluorescens intensiteten av pHluorin og mCherry i alle skiver valgt for målinger.
- Dele mener fluorescens intensiteten av pHluorin kanalen ved mener fluorescens intensiteten av mCherry kanalen til å beregne forholdet mellom pHluorin til mCherry fluorescens.
- bakgrunn subtraksjon:
- Derive pHi verdier og generere pseudocolored bilder
- Derive pHi verdier
- i alle tilfeller lineære regresjons-kurven skal genereres ved hjelp av eggstokkene fra flyr av samme genotype både eksperimentelle og kontroll forhold. Generere en lineære regresjons-kurven for hver celle ved hjelp av data fra to nigericin buffer betingelser ( Figur 3). I Excel kan dette gjøres ved å plotte dataene på en graf og legge en lineær trendlinje. Vekselsvis, se:
- Bruk stigningstallet og y-skjæringspunktet for lineære regresjons-kurven beregnet fra nigericin betingelsene og ligningen for en linje (y = mx + b) konvertere pHluorin til mCherry forholdet verdier beregnes fra prøvene i bikarbonat tilstanden til pH-verdier. I denne ligningen, erstatte skjemaet skråningen (y-aksen) b, satte forholdsverdien i x og løse for y.
- Generere en pseudocolored bilde gjenspeiler forholdet verdiene i FIJI.
- Følg fremgangsmåten ovenfor for bakgrunnen subtraksjon (trinn 3.1.1 og Figur 4).
- Del pHluorin kanal fra mCherry kanalen ved hjelp av funksjonen bildet kalkulator, frå prosessen. Pass på " Opprett nytt vindu " og " 32-biters (flyt) resultatet " boksene sjekkes begge. Endre oppslagstabellen (LUT), funnet på bilde-menyen termisk eller LUT valgfrihet. Se Figur 4 for andre passende alternativer.
- i dialogboksen Juster lysstyrken og kontrasten for (bildet → Juster → lysstyrke/kontrast), klikk det " sette " knappen. Sett Minimum vises verdien til 0 og maksimalt vises verdien for forholdet som best fanger data, vanligvis 1,0 til 2,0 ( figur 5).
- Derive pHi verdier
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi beskrevet prosessen å måle pHi i hårsekken epitel, som omfatter flere trinn. Først er eggstokkene dissekert fra flyr av aktuelle genotype bruker verktøy for dissekere og montering (figur 1). Ovarioles er da fotografert med kvantitative fluorescens mikroskopi og bildene analyseres for å få målinger av pHi. For hvert bilde identifiseres i celletyper interessepunkter som beskrevet i delen 3.1 (figur 2). Forholdet mellom fluorescens intensiteten i GFP og mCherry kanaler konverteres til pHi verdier ved hjelp av en standard kurve (figur 3A) som beskrevet i del 3.2. På denne måten, fant vi at pHi øker med differensiering i tidlig FSC avstamning, fra 6.8 i FSCs, 7.0 i prefollicle celler, til 7.3 i hårsekken celler (figur 3B). PHi verdiene av hver celle kan representeres grafisk, som i figur 3B, eller som et pseudocolored mikroskop-bilde som viser forskjellene i pHluorin til mCherry prosenter (Figur 4 og figur 5). I disse bildene vises forskjeller i pHluorin til mCherry prosenter som forskjeller i fargen, som definert av en LUT. Det er viktig å velge en LUT og maksimum og minimum verdiene for fargeområdet for å produsere et bilde som er representative for dataene. Men generelt, valg av LUT og området ikke vil gi utseendet av forskjellene som ikke finnes i bildet, kan en mindre egnet valg av LUTs utydeliggjøre pHi forskjeller i mikroskop-bilde (figur 5).
Figur 1: Materialer for disseksjon og montering Drosophila ovarioles. (A) et bilde viser: (1) neglelakk; (2) vakuum fett og kanne og Pipetter tips brukes for å bruke fett; (3) 23-gauge sprøyte nåler; (4) Dumont Inox tang, størrelse 5; (5) 3D trykt montering kammer; (6) 22 x 40 mM glass coverslips; (7) runde Glass Coverslips, 12 mm diameter, 0,13-0,16 mm tykkelse; og (8) 9-og glass dissekere parabolen. (B) en Nærbilde bilde av 3D trykt montering kammer. (C) et bilde viser et dissekert par wildtype eggstokkene. (D) et bilde viser godt atskilt ovarioles. (E) A bilde av 3D kammer med dissekert eggstokkene montert under en runde glass dekkglassvæske. De sorte prikkene er dråper neglelakk brukes til å holde den runde dekkglassvæske på plass. (F) et bilde av dissekert ovarioles under en runde glass dekkglassvæske etter montering. Den svarte boksen angir et område av bildet med en enkelt dissekert ovariole. Skala stolper representerer ca 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: identifisere FSCs, pFCs og hårsekken celler. To eksempler på germaria med UAS-mCherry::pHluorin og 10930-Gal4 farget med Concanavilin-A. En avkastning beskriver en FSC, en pFC og en hårsekken celle vises i hvert bilde. Mener fluorescens intensiteten i pHluorin og mCherry kanaler brukes til å beregne pHluorin til mCherry prosenter. Skala stolper representerer ca 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: pHi øker under differensiering i FSC avstamning. Representant resultater fra Ulmschneider et al. 2 viser: (A) en typisk lineær regresjon kurve brukes til å beregne pH-verdier fra pHluorin til mCherry forholdstall; og (B) den beregnede pHi verdier med 95% sikkerhet intervaller for FSCs, pFCs og hårsekken celler. Dette tallet er tilpasset etter tillatelse fra Ulmschneider et al. 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bruke FIJI for å generere en pseudocolored ratiometric bilde. (A) bilder viser resultatene på hvert trinn i bakgrunnen subtraksjon prosessen. Starter med et ubehandlet bilde (venstre panel), er det første trinnet å angi terskelen grensene piksler med intensitetsverdiene under bakgrunn er utelukket. Øvre grense for terskelen er satt til maksimum. FIJI vil farge ekskluderte bildepunktene blå, noe som resulterer i et bilde med en blå bakgrunn og en tydelig germarium (midten panel). Legg merke til at dette trinnet er valgfritt. Det andre trinnet er å trekke en avkastning i en del av bildet uten signal (røde firkanter i midten paneler), mål mener fluorescens intensiteten av Avkastningen, og trekker det beløpet fra hele bildet, noe som resulterer i en bakgrunn trukket bilde (høyre panel). Det tredje trinnet er å bruke funksjonen bildet beregning for å dele bildet i pHluorin kanalen med bildet på mCherry kanalen. Resultatet blir et bilde vises med grå oppslagstabellen og visningsverdiene bildet satt til span hele det dynamiske spekteret av bitdybden av bildet. Det siste trinnet er å justere bildet visningsinnstillingene for mer passende og velg en oppslagstabell. (B) Bildeeksempler viser resultatet av en beregning av bildet med minst Vis verdi satt til 0 og maksimal visningsverdien satt til 2,5 med fire forskjellige oppslagstabeller. Firkanten ved siden av hvert bilde viser fargene som brukes i det dynamiske området for hver oppslagstabellen. Legg merke til at for HiLo, 16 farge og termisk, brukes forskjellige farger for piksler med intensitetsverdien 0 eller maksimum (f.eksblå og røde, henholdsvis i HiLo). Dette gir en enkel visuell referanse av grensene for det dynamiske området, slik at betrakteren til å se at signalet er innenfor dynamisk område. (C) skjermen skudd viser alternativene valgt når en fil importeres til ImageJ bruker Bio-formater Import Plug-In. skala stolper representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Angi bildet visningsverdiene pseudocolored ratiometric bilder. Minimum og maksimum bilde visningsverdiene bør angis slik at signalet i bilder fra betingelsen bikarbonat og begge nigericin betingelsene er innenfor dynamisk spekter. For å illustrere dette punktet, to bilder fra hver av de tre forholdene vises med fire ulike bilde-skjerminnstillingene (0-0.5, 0-1, 0-2.5 og 0-5) med termisk oppslagstabellen. Legg merke til at for alle tre eksperimentelle forhold, når bildene vises med maksimal vises verdien angitt til 0,5, mye av signalet er på eller nær maksimum på kolorimetrisk skala, og når den er stilt til 5.0, mye av signalet er på eller nær minimum fargen imetric skala. I begge disse tilfellene, være ikke forskjellene i pHluorin mCherry forhold over vevet verdsatt lett slik at disse innstillingene ikke er ideelt. Maksimal visningsverdiene 1.0 eller 2,5 er mye mer passende. Med disse innstillingene forskjellene i prosenter over vevet kan lett bli verdsatt, og signalene i bilder fra alle tre eksperimentelle forhold vises i farger som er innenfor dynamisk spekter av kolorimetrisk skalaen. Skala stolper representerer ca 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode for å måle pHi celler i FSC avstamning innen wildtype vev. Denne protokollen er utviklet og raffinert de siste fem årene, siden vi først begynte å studere pHi i Drosophila ovarian vev. Under oppstarten har protokollen vært brukt med hell av flere etterforskere i vår lab og på minst fire forskjellige spinning plate og laserskanning mikroskop. Reproduserbarhet vår opprinnelige observasjon, at pHi øker som celler i FSC avstamning skille fra stilk cellen til pFC til hårsekken celle staten, over disse flere studier viser begge at denne biologiske fenomen er robust og at metodene er pålitelig. I vår erfaring er dette imidlertid en utfordrende prosedyre å mestre. Det krever nøye med detaljer på hvert trinn, og rask, svært dyktig gjennomføring av dissection, montering og imaging trinnene. Som nevnt i protokollen, disseksjon og montering prosedyren inneholder en 10 min incubation, men bør ikke overstige 15 min total og tenkelig prosedyren må fullføres i 45 minutter. Under ideelle forhold, Drosophila ovarioles kan opprettholdes i kultur for opptil 14 h17, men vi fant at vevet begynner å dø mye raskere i nigericin bufferne brukes til å generere standard kurvene. Våre retningslinjer for sikre at alle data er samlet vevet er fortsatt godt innenfor vinduet som det vises rask og morphologically normal. Dette etterlater ikke mye tid for hvert trinn, skjønt, så det er viktig å planlegge å sørge for at alt er klar til å gå fra ett trinn til neste. Faktisk er det mye mer effektivt Hvis to personer arbeider sammen på dissection, montering, og imaging prosedyrer, med én person utførelse av et trinn mens den andre personen forbereder neste trinn.
Siden pHi kan være følsomme for eksperimentell manipulasjoner må bilde av vev ex vivo, som temperatur og buffer komposisjon, er denne metoden best å identifisere relative endringer i pHi. Gitt at sonden består av to atskilte fluorescerende proteiner, fluorescens egenskapene som quantum avkastning, levetid og folding påvirkes forskjellig i ulike celletyper. Derfor er det viktig å inkludere prøver behandlet med nigericin buffer betingelsene og bruke dem til å generere en ny kalibreringskurven for hver celle i hver prøve. For å minimere flere kilder for variasjon, er holde alle vilkår konsekvent i løpet av imaging vektlagt. Prøver nigericin buffer forhold bør være forberedt og fotografert på samme dag som de i betingelsen bikarbonat buffer og forberedelse og image oppkjøpet av alle prøver bør holdes så konsekvent som mulig. Dette er viktig fordi pHi målingene er basert på en sammenligning mellom bildet, så eksperimentelle forskjeller som påvirker gjenkjenning av mCherry og pHluorin i ett eller flere av bildet kan redusere nøyaktigheten av pHi estimatene. Faktorer som endringer i innstillingen spenning photomultiplier rør (Hvis en laserskanning AC confocal) eller eksponeringstider (Hvis du bruker en roterende plate AC confocal) eller en skitten linse som reduserer mengden av lyset når kameraet klart påvirker resultatene . Men det finnes en myriade av andre mer subtil faktorer som kan variere fra dag til dag og kan også påvirke resultatene, for eksempel hvis fluene er velfødde, fluene, og hvor lenge lasere har vært på før bildebehandling. Forberede og tenkelig alle tre betingelser på samme dag minimerer disse forskjellene, og dermed gir de mest konsekvente resultatene. Spesielt, hver gang vi byttet til en ny mikroskop eller komponenter av mikroskopet ble oppgradert, det var nødvendig å reoptimize innstillingene på det nye utstyret. Dette resulterte ofte endre i gjennomsnittlige verdiene av individuelle målinger, men så lenge nye kalibrering kurver ble generert med hver prøve, endringene i utstyr hadde en minimal innvirkning på pHi estimatene. I tillegg styres relevante sammenligningen mellom ulike celletyper som er innenfor samme vev (f.eksFSCs, PFK og hårsekken celler) og dermed er internt ofte for eksperimentell variasjoner.
Selv om denne protokollen har fokusert på å måle pHi av wildtype vev, er metodene som kompatibel med standard Drosophila metoder for å manipulere genuttrykk, som uttrykk for RNAi eller en transgene UAS/Gal4 og mosaikk analyse. Siden mCherry::pHluorin er drevet av en UAS promoter, det vil alltid være co uttrykt med RNAi eller transgene, og MARCM18 kan brukes til å generere homozygous mutant kloner med mCherry::pHluorin som klonal markøren. For årsakene beskrevet ovenfor, bør wildtype vev analyseres som en kontroll sammen med hver rettssak med en mutant genotype. Til slutt, de generelle prinsippene beskrevet her kan brukes til bruk av mCherry::pHluorin å måle pHi i andre vev. Faktisk denne protokollen var tilpasset fra en protokoll for å bruke mCherry::pHluorin til å måle pHi i Drosophila øye7, og vi har brukt lignende metodikk for å image mCherry::pHluorin i larver hjernen. Total, verktøyene og metodene beskrevet her gir nye muligheter til å undersøke de mange ulike funksjonene i pHi i vivo i levende, intakt vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bryne Ulmschneider for bidrag til protokollen og Diane Barber forslag på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av en National Institute of Health grant GM116384 TG Nystul og DL frisør.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
