Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol om anvendelse af rhodaminfilteret 123 til at identificere den mitokondrielle membran potentiale (MMP) og studere CLIC4 knockdown-induceret HN4 celle apoptose in vitro. Under fælles fluorescens mikroskop og konfokal laser scanning fluorescens mikroskop, blev real-time ændringen af MMP indspillet.
Abstract
Nedbrydningen af de mitokondrielle membran potentiale (MMP, ΔΨm) anses for den tidligste begivenhed i den apoptotiske kaskade. Det sker endda foran nukleare apoptotiske karakteristika, herunder kromatin kondens og DNA brud. Når MMP kollapser, celle apoptose vil indlede uigenkaldeligt. En serie af lipofile kationiske farvestoffer kan passere gennem cellemembranen og aggregere inde matrix af mitochondriet og tjene som fluorescens markør til at evaluere MMP ændring. Som en af seks medlemmer af Cl- intracellulære kanal (CLIC) familie, deltager CLIC4 i celle apoptotiske proces hovedsagelig gennem den mitokondrielle vej. Her beskriver vi en detaljeret protokol for at måle MMP via overvågning fluorescens udsving af rhodaminfilteret 123 (Rh123), hvorigennem vi studere apoptose induceret af CLIC4 knockdown. Vi diskutere fordele og begrænsninger i anvendelsen af Konfokal laser scanning og normal fluorescens mikroskop i detaljer, og også sammenligne det med andre metoder.
Introduction
Rh123 er en kationiske fluorescens dye, der tjener som en indikator for transmembrane potentiale. Rh123 er i stand til at trænge ind i cellemembranen og ind i mitokondriets matrix afhængigt af spændingsforskel på inde og udenfor membran1. Apoptose fører til beskadigelse af mitokondrielle membran integritet. Mitochondriet permeabilitet overgangen pore (MPTP) vil åbne og fører til kollaps af MMP, hvilket igen resulterer i frigivelse af Rh123 på ydersiden af mitokondrier. Endelig, stærkere grønne fluorescens signal registreres under fluorescens mikroskop. Det er veldokumenteret, at udtømning af MMP og forhøjede membran permeabilitet er tidlige tegn på celle apoptose2. Rh123 kan derfor anvendes til påvisning af MMP forandringer og forekomsten af celle apoptose.
Som de 6 mest almindelige karcinom i verden forringes hoved og hals kræft alvorligt en persons sundhed3. Selv om mange tilgange blev udviklet i de seneste år, er kliniske resultater af behandling af patienter med hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) stadig ikke ideelle4. At udforske nye terapeutiske metoder kan forbedre behandlingen for HNSCC5. Ionkanaler involverer mange biologiske processer vise en vigtig rolle i udviklingen af forskellige kræftformer6. Hel eller delvis deltagelse af Cl- kanaler er stærkt involveret i forskellige egenskaber af neoplastiske transformation herunder aktive migration, høj rate af spredning og invasiv. I lyset af dette, har CLIC, en roman protein familie, været opført som en lovende klasse af terapeutiske mål for kræft behandling6,7. Nylige undersøgelser har vist, at medlemmer af familien CLIC, herunder CLIC1, CLIC4 og CLIC5, lokalisere til hjerte mitokondrie og reaktive ilt arter (ROS) niveau er upregulated af CLIC5, som angiver den funktionelle rolle af mitokondrie-beliggende Cl - kanaler i apoptotiske svar8. CLIC4, en medlemmer af familien CLIC (også kendt som mtCLIC, P64H1 og RS43), har været mest grundigt undersøgt for sin apoptotiske forordning egenskaber i kræftceller og subcellulært placering herunder Golgi, endoplasmatiske reticulum og mitochondriet i menneskelige keratinocytter7,9,10. Profilen udtryk af CLIC4 blev reguleret af tumor nekrose faktor-α (TNF-α), P53 og eksterne stimuli. Overekspression og downregulation af CLIC4 udløse en apoptotiske svar hovedsagelig gennem den mitokondrielle vej ledsaget med ubalance af Bcl-2 familiemedlemmer, aktivering af caspase cascade og frigivelse af cytokrom C11, 12 , 13. derfor MMP måling er afgørende at udforske CLIC4-relaterede apoptose, og Rh123 fungerer som en ideel fluorescens-indikator.
Den nuværende undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til påvisning af MMP at studere CLIC4 knockdown-induceret apoptose i HN4 celler. Rh123 bruges som et fluorescens sonde til at observere ændringen af MMP. Under fælles fluorescens mikroskop og konfokal laser scanning fluorescens mikroskop, kan real-time udsving i MMP blive løst. Vi diskutere fordele og begrænsninger i anvendelsen af Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop i detaljer, og også sammenligne det med andre metoder. Denne protokol kan også anvendes til andre apoptose-relaterede studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur og Transfektion
-
Cellekultur
Bemærk: HN4, en HNSCC cellelinie, stammer fra patienter med HNSCC14.- Kultur HN4 celler i Dulbeccos ændrede Eagle medium (DMEM, 4,5 g/L glukose) suppleret med 10% føtal bovint serum og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin). Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2.
-
Celle Transfektion
- En dag før Transfektion, plade 5 x 105 celler i 2 mL/godt af næringssubstratet uden antibiotika i 6-godt plader.
- Fortyndes 100 pmol CLIC4 siRNA eller røræg SiRNA i 250 µL af reducerede serum medier, forsigtigt. Fortyndes 5 µL Liposom reagens i 250 µL af reducerede serum medier og inkuberes i 5 min. kombinere den fortyndede siRNA med fortyndet Liposom reagens, blandes forsigtigt, og Inkuber i 20 min. ved stuetemperatur.
- Tilsæt blandingen til hver godt indeholder celler og medium. Bland forsigtigt af vuggende plade og tilbage. Inkuber celler ved 37 ° C i en CO2 inkubator i 24 timer, før du fortsætter med følgende Rh123 mærkning procedure. Udskift mediet med normal vækstmediet 4 h efter Transfektion.
2. Rh123 mærkning
Note: Rh123 var udnyttet til at måle MMP i HN4 celler1.
- Efter CLIC4 siRNA behandling (afsnit 1), skal du bruge HN4 celler i 6-godt plader til følgende behandling. Mængden af HN4 celler i hver er godt nok til at gentage eksperimentet 10 gange på coverslips.
- Bruge pincet til at sætte cirkulære coverslips på bunden af nye 12-godt plader. Antallet af plader er indstillet ifølge den eksperimentelle design (fig. 1A).
- Lægge 150 µL af 100 µg/mL polylysine på midten af hver coverslip inde 12-godt plader og vente 2 min. være opmærksom ikke sætte polylysine uden for coverslips. Derefter fjerne polylysine af pipette grundigt (figur 1B).
- Fjern næringssubstratet af HN4 cellerne inde i skålen og tilsæt 1 mL 0,25% trypsin for at frigøre cellerne. Efter 6 min, tilsættes 2 mL næringssubstrat for at neutralisere trypsin. Forsigtigt blandes HN4 cellerne af pipette til 5 gange og frø 2-6 х 104 celler på den cirkulære coverslips. Sted i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 (figur 1C).
- Efter 8 h inkubation, inkuberes HN4 celler med 2 µmol/L Rh123 for 40 min ved 37 ° C. Forsigtigt blandes de mellemstore up-and-down flere gange for at sikre ligelig fordeling af Rh123 i medium (fig. 1D).
- Forberede nok normal fysiologisk saltvand løsning (NPSS); at gøre NPSS (udtrykt i mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glukose og 5 HEPES, pH 7,4). Forvarm til 37 ° C i et vandbad.
- Bruge pincet til at fjerne coverslips og vask de resterende flydende via kort placere coverslips i forvarmet NPBS buffer (figur 1E).
- Placere coverslips på 500 µL rustfrit stål kammerets bund (Se Tabel af materialer) med en udskiftelig 25 mm glas coverslip nederst forseglet på plads af en o-ring. Ordne det ved at stramme låget af salen (figur 1E).
- Tilføje 450 µL forvarmet NPSS buffer til de forsamlede kammer og sætte bad under det visuelle felt af fluorescens mikroskop eller Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop (figur 1E).
3. påvisning af MMP
-
Fælles fluorescens mikroskop
- Tænde fluorescens mikroskop efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Fælles fluorescens mikroskop blev udført med en mercury lampe fiberoptisk lys kilde, et FITC filter sat til Rh123 (480/40 excitation filter, 505 LP dichroic spejl og 535/40 emission filter) ved stuetemperatur. 20 X mål blev brugt til at udføre live-celle billeddannelse. - Åbn imaging systemsoftwaren og vælge knappen "Ny" på kommandolinjen til at begynde et nyt eksperiment (fig. 2A).
- Justere den visuelle felt og fokus til at finde placeringen af cellerne i hvidt lys.
- Sluk lyset og tryk på for at lukke hvidt lys. Klik på knappen "Fokus" fra kommandolinjen og vælg "Start fokus" at tænde fluorescens. Find placeringen af cellerne igen via mikroskop med en 507 nm excitations- og 529 nm lang pass bølgelængde (sæt før eksperimentet). Justere den visuelle felt og fokus igen hvis det er nødvendigt (figur 2B).
- Vælg en visuelle felt med kun 20 til 30 adskilt HN4 celler. Ændringen af intracellulære fluorescens signal til hver celle registreres nøjagtigt.
- Når et klart synsfelt er opnået, skal du klikke på "Tætte fokusering" fra baren fokus. Klik på "Acq One" på kommandolinjen til at erhverve et sæt af billeder. Klik på "Regioner" fra kommandolinjen og klik på knappen "OK" for at redigere måling regioner.
Bemærk: Fra værktøjslinjen Rediger Region forskellige region figurer kan bruges alt efter undersøgelsen. - Så det passer til forskellige former for individuelle celler, Vælg værktøjet "Trace Region" og cirkel regionen i en enkelt celle og dobbeltklikke på når du er færdig. Gentag proceduren, indtil alle celler er cirkel (figur 2C). Klik på "Gjort" og vælg "Gem billeder" til at finde den gemte placering.
- Klik på "Zeroclock"og hurtigt tryk på F4 for at starte overvågning ændringen af fluorescens intensitet. Rekord i real-time ændre fluorescens intensitet en gang hver 5 s til 5 min (figur 2D).
- Når den oprindelige plan bliver stabil, tilsæt 50 µL NPSS blandet med 0,5 µL af 100 mmol/L ATP til kammeret via pipette. Husk at ikke røre i salen for at undgå at fjerne det visuelle felt (figur 2E).
Bemærk: Fluorescens-billedet vil blive registreret i 20 min. og derefter eksperimentet kan ende via manuel betjening. Varigheden er rutinemæssigt bosatte sig i 20 min. for at observere hele fluorescens ændring. Manuel betjening til stop capture anvendes, når uventede faktorer påvirke stabiliteten af kurven, eller når hele processen tager mindre end 20 min.
- Tænde fluorescens mikroskop efter fabrikantens anvisninger.
-
Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop
- Tænd Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop efter producentens anvisninger, og Åbn den medfølgende software.
Bemærk: Her, Rh123 var ophidset af en Argon laser på 488 nm og det udsendte signal blev indspillet over vifte af 545-700 nm via anvendelsen af TD488/543/633 filter. - Klik på "Objektive" under menuen "Erhverve" at vælge 63 X / 1.4 N.A. olie mål linse. Observere modellen og finde et klart synsfelt under feltet lys.
- Tryk på "TL/IL" for at skifte til fluorescens tilstand og vælge de korrekte fluorescens filtre til at finde placeringen af cellen under mørke via mikroskop. Skub "SHUTTER" at beskytte modellen når observation er færdig.
- Under menuen "Erhverve" justere passende ydelse kanal og klik på "Opnå" for at aktivere den udlignede optiske sti (fig. 3A). Klik på menuen "Configuration" og vælge "Laser" til at bestemme typen nødvendige laser. "Argon" anbefales til denne protokol (fig. 3B).
- Klik på "Live" for at få real-time billede og sørg for det visuelle felt indeholder kun 20 til 30 adskilt HN4 celler. Ændringen af intracellulære fluorescens signal til hver celle registreres nøjagtigt.
- Vælg "xyt" i erhvervelse Mode i undermenuen "Tilegnelse" under menuen "Erhverve" (figur 3C). Sæt 5 s og 20 min for tidsinterval og varighed. Klik på"Anvend" når alle parametre udlignes.
- Under menuen "Tal", skal du bruge værktøjet "Tegne polylinje" til cirkel området optagelse i hver celle. Vælg "Line profil" og vælg "Start" for at foretage observation. Optage real-time ændringen af fluorescens intensitet i 5 min (figur 3D - E).
- Når den oprindelige plan bliver stabil, tilsæt 50 µL NPSS blandet med 0,5 µL af 100 mmol/L ATP til kammeret via pipette. Husk at ikke røre i salen for at undgå at fjerne det visuelle felt.
Bemærk: Fluorescens-billedet vil blive registreret i 20 min. og derefter eksperimentet er afsluttet.
- Tænd Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop efter producentens anvisninger, og Åbn den medfølgende software.
4. statistisk analyse
-
Fælles fluorescens mikroskop
- Tænde fluorescens mikroskop rutinemæssigt efter operatørens manual. Åbn imaging systemsoftwaren og vælge knappen "Åbn" på kommandolinjen til at åbne en gemt eksperiment. Klik på "Regioner" på kommandolinjen, og klik på "OK" knappen for at redigere måling regioner.
- Vælg værktøjet "Trace region" og cirkel regionen i en enkelt celle og dobbeltklikke på når du er færdig. Gentag proceduren, indtil alle cellerne har været cirkel. Klik på "Gjort" og vælg den "F4: fremad" knappen for at få et spor viser fluorescens intensitet.
- Når først færdig, klik på pil ned knappen placeret i nederste højre hjørne af grafen og klikke på "Vis diagramdata" (figur 2F). Klik på "OK" to gange og vælge knappen "Log Data" for at åbne grænseflade af databehandling software. Klik på "Log Data" igen og finde poster i realtid udsving af fluorescens intensitet vises på regnearket.
Bemærk: For hver celle, ændringer i MMP blev vist som forholdet mellem fluorescens i forhold til intensiteten før anvendelsen af ATP eller TG (F1/F0). Hver fluorescens intensitet data blev gennemsnittet af 20-30 celler. Data for Rh123 præsenteres som gennemsnit ± SE. resultaterne fra 2 grupper blev testet af den to-sidede uafhængige t test og P -værdi < 0,05 blev anset for Statistisk signifikans. Statistisk analyse software blev anvendt til at gennemføre de statistiske analyser i dette eksperiment.
-
Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop
- Tænd Konfokal laser mikroskop og logge ind på den medfølgende software efter fabrikantens anvisninger.
- Vælg "Brand" for at åbne en optaget experiment.
- Vælg værktøjet "Stable profil" under menuen "Tal", Vælg "alt i én" fra "Slags diagrammer af kanaler og ROIs."
- Brug polygonværktøjet "Draw" cirkel celle regioner for observation.
- Vælg menuen "Graf" og klik på højre museknap og vælge "Eksporter til excel" føje værdier af fluorescerende intensitet til et regneark. Følgende analyse er i overensstemmelse med normale fluorescens mikroskoper (figur 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den nuværende undersøgelse, blev Rh123 anvendes til påvisning af MMP. I første omgang, blev HN4 celler kulturperler for de følgende fluorescens farvning eksperimenter. Pincet blev brugt til at sætte cirkulære coverslips på bunden af 6-godt plader (fig. 1A). Coverslips var belagt med polylysine i 5 min og derefter polylysine fjernes via pipette (figur 1B). Derefter blev HN4 celler trypsinized og seedet på coverslips placeret i bunden af 6-godt plader. Næste, den passende mængde Rh123 blev tilføjet og blandes godt (figur 1C-D). Efter vask med den forvarmet NPSS, blev coverslip samlet ind i visning kammeret. Den passende mængde NPSS blev tilføjet til den følgende eksperiment (figur 1E).
Efter proceduren i Rh123 farvning bruges både almindelige fluorescens mikroskop og konfokal mikroskop til at registrere de real-time Rh123 fluorescens med forskellige trin og software. For fælles fluorescens mikroskop, var imaging-software slået til for at oprette et nyt eksperiment. Udløseren blev åbnet for at vise den grønne fluorescens lys og fokus og placering blev justeret for at opnå et passende synsfelt. Efter at have taget en celle billede, blev trace formværktøjerne brugt til at tegne regionen af hver enkelt celle og derefter optage fluorescens ændringen. Når den oprindelige plan blev stabil, var ATP føjet ind i kammeret til at udløse mitokondrielle membran depolarisering. I forsøget med Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop, den medfølgende software blev åbnet og en passende optiske sti blev angivet. Efter argon lyskilden blev valgt, justeret vi fokus og placeringen af herhen for at opnå en klar visuel celle figurer på skærmen. Scan-tilstand vises "xyt" blev valgt og værktøjet "Draw polygon" blev anvendt til at cirkel celle regionen for at optage fluorescens ændringen inden for hver enkelt celle. For at analysere de rå data, F0 var værdien af fluorescens intensitet før ATP ansøgning og F1 var den maksimale værdi af fluorescens intensitet efter ATP ansøgning. F1/F0 blev brugt til at vurdere den mitokondrielle membran depolarisering (figur 2 og figur 3). Fra figur 4B og figur 5B, var niveauer af fluorescerende intensitet forhøjet efter behandling af ATP og faldt tilbage til baseline efter ca 10 min. figur 4C og figur 5C klart viser, at toppen af fluorescens intensiteten af Rh123 var højere i gruppen under CLIC4 siRNA behandling end i kontrolgruppen. Figur 4 A og figur 5A Vis repræsentative billeder af fluorescerende ændringen i hver fase. Sammenlignet med almindelige fluorescens mikroskop, opnået Konfokal mikroskop en højere kvalitet af billedet, viser cellekerne og mitokondrier. Men når man sammenligner data fra de to metoder, ingen betydelige forskelle blev fundet. Resultater fra fluorescens og konfokal mikroskop demonstreret at knockdown af CLIC4 forbedret ATP-induceret mitokondrielle membran depolarisering i HN4 celler (figur 4 og figur 5).
Figur 1 . Rh123 mærkning. (A) pincet blev brugt til at sætte cirkulære coverslips på bunden af 6-godt plader. (B) belægning coverslips med polylysine via pipette til 5 min og endelig suges tilbage i pipette til at fjerne polylysine. (C) HN4 celler var seedet på coverslips i bunden af 6-godt plader. (D) tilføjer en passende mængde af Rh123 og blande godt. (E) vask coverslips med forvarmet Kernekraftværker og montage afdeling med en passende mængde af NPSS til den følgende eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Skridt til at overvåge real-time udsving i Rh123 fluorescens af fælles fluorescens mikroskop. (A) åbne et nyt eksperiment. (B) begynder at fokusere og vælge et passende synsfelt under fluorescens. (C) brug "Regioner" værktøj på kommandolinjen til at redigere observation regioner. (D) Klik på "Nul ur" og skubbe hurtigt F4 for at starte overvågning ændringen af fluorescens intensitet. (E) at tilføje ATP (100 µmol/L) til at udløse mitokondrielle membran depolarisering, efter den oprindelige plan bliver stabil. (F) når eksperimentet er færdig, skal du klikke på nedpilen beliggende på den nederste højre hjørne af grafen til at eksportere data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Skridt til at overvåge real-time udsving i Rh123 fluorescens af Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop. (A) Vælg ydelse-kanalen og sæt en egnet bølgelængdeområdet under menuen "Erhverve". (B) Vælg den korrekte laser fra "Nuværende tilgængelige laser" og indstille dens magt. (C) skal du vælge "xyt" observere tilstand og indstille en række optagelse parametre. (D) Vælg værktøjer "Stack profil" og "Alle i én" fra "Slags diagrammer af kanaler og ROIs." (E) Brug værktøj "Draw polygon" cirkel celle regionen for de realtidsdata. (F) eksporterer værdierne af fluorescerende intensitet til databehandling software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Effekten af CLIC4 knockdown på ATP-induceret mitokondrielle membran depolarisering løst af fælles fluorescens mikroskop i HN4 celler. (A) repræsentative billeder af fluorescens udsving for Rh123. repræsentant spor (B) og opsummerede data (C) viser ATP (100 µmol/L)-inducerede ændringer i cellen HN4 MMP. Ændringen i den membran potentiale blev anført af forholdet mellem fluorescens-intensiteten før og efter anvendelsen af ATP. Forholdet stigning repræsenterer membran potentielle depolarisering. HN4 cellerne blev transfekteret med CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) eller røræg siRNA (Con siRNA). Værdier er vist som gennemsnit ± SEM. n = 5. P < 0,05 kontra kontrolgruppen (Con siRNA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Effekten af CLIC4 knockdown på ATP-induceret mitokondrielle membran depolarisering løses af fluorescens laser scanning fluorescens mikroskop i HN4 celler. (A) repræsentative billeder af fluorescens udsving for Rh123. repræsentant spor (B) og opsummerede data (C) viser ATP (100 µmol/L)-inducerede ændringer i cellen HN4 MMP. Ændringen i den membran potentiale blev anført af forholdet mellem fluorescens tæthed før og efter anvendelsen af ATP. Forholdet stigning repræsenterer membran potentielle depolarisering. HN4 cellerne blev transfekteret med CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) eller scrambled siRNA (Con siRNA). Værdier er vist som gennemsnit ± SEM. n = 5. P < 0,05 kontra kontrolgruppen (Con siRNA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er veldokumenteret, at Cl− kanaler er afgørende for opretholdelsen af hæmostase af det indre miljø og spiller en vigtig rolle i celledelingen og apoptose15,16. Derfor forstå forholdet mellem ion-kanal-målrettet intervention og apoptose er stort behov og betydning til at finde en bedre terapeutisk tilgang til forskellige kræftformer17. Mitokondrier opretholde normale biologiske tilstand af en celle og dens funktion vedrører meget dets membran permeabilitet og transmembrane potentiale. Ud over kræft, har akkumulere Neuropatologisk undersøgelser dokumenteret at mitokondriel abnormiteter bidrage til myopathy, hjerte-kar-sygdom og neurologiske symptomer herunder sensorineural døvhed, cerebellare ataksi, demens , og epilepsi18,19. Alle disse har ansporet forskning i mitokondrie-målrettet intervention med til at rette op på klinisk behandling. Rh123, en mitochondriet-målrettet fluorescens dye, kan trænge ind i cellemembranen, og serverer som en universel fluorescens sonde til at opdage MMP. I den tidlige tilstand af celle apoptose, åbning af MPTP hæver den mitokondrielle membran permeabilitet så Rh123 til at blive frigivet uden for mitokondrierne, og endelig stærkere grønne fluorescens signal kan påvises. Under denne situation, bilaterale ioner distribuere frit og føre til hurtige dråbe af MMP forårsager afkobling af elektron transportkæden og nedsat ATP produktion, som alvorligt påvirker den normale energiforsyning af celler. Derudover, udløser åbningen af MPTP udstrømning af pro-apoptotiske bioaktive stoffer herunder Cyt C, apoptose fremkaldende faktor, apoptotiske protease aktiverende faktor-1, og ROS, og endelig fører til irreversible apoptose20,21 .
ATP kan fremkalde mitokondrielle membran depolarisering, som det fremgår af forhøjede fluorescens af Rh123. Ved at sammenligne ATP-induceret mitokondrielle membran depolarisering af celler under forskellige behandlinger, er det muligt at dechifrere den biologiske funktion af ændring i mitokondrierne og den grad og apoptose22. Både almindelige fluorescens mikroskop og konfokal laser scanning fluorescens mikroskop kan opnå tidstro overvågning af MMP via optagelse udsving i fluorescens intensiteten af Rh123, men fordele og ulemper ved begge metoder skal være overvejet. Sammenlignet med almindelige fluorescens mikroskop, har billeder taget af Konfokal laser scanning fluorescens mikroskop højere opløsning og kvalitet. Derfor kan flere subcellulært detaljer visualiseres. Derudover mindsker det virkningerne af den lette cross-talk, når flere fluorescens farvestoffer anvendes. Derfor kan Konfokal mikroskop netop optage real-time fluorescens udsving i Rh123 og afspejle den reelle cellulære bioactivity. Men vores metoder til at overvåge MMP har brug for løbende optagelse i en relativ lang tid og en række cytotoksiner, herunder enkelt ilt og ROS, kan fremlægges under laserstråling fører til celle skader23. Desuden forårsager høj laser intensitet normalt svækkelsen af fluorescens farvestoffer under den løbende scanning24. Derimod fælles fluorescens mikroskop kan ikke tage billeder med høj kvalitet som Konfokal mikroskop, men det har ikke de ovennævnte negative virkninger og dermed muliggør længe optagelse. Ved at sammenligne vores data fra både fælles fluorescens mikroskop og konfokal mikroskop, ingen indlysende forskel kunne findes, som angiver, at den fælles fluorescens mikroskop er kompetente nok til at overvåge udsving i MMP, samt omkostningseffektive og mere praktisk dataanalyse. HN4 celler var seedet på coverslips før forsøget. Selv om polylysine er anvendt til at øge den cellulære udlæg, fører en lille brøkdel af celler stadig løsrevet fra coverslips og ru operation til forringelse af cellernes levedygtighed. Derudover bør tilføjer Rh123 eller ATP ind i salen, sikres at ikke røre kammer og coverslips.
Udover Rh123, DioC6, JC-1 og tetramethyl rodamin methylester (TMRM) er fluorescens farvestoffer, der kan bruges til at registrere MMP. I stedet for real-tids optagelse via mikroskop, kan flowcytometri også udføre denne opgave. Men optagelse real-time ændringen af fluorescens intensitet med mikroskop er mere egnet til at opdage de cellulære bioactivity og generere intuitionistic billeder, giver mere pålidelige resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mr. Chao Fang for cellekultur. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation of China (Grant No. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Fremragende unge Investigator i Anhui medicinske universitet; Understøtter Program for fremragende unge talenter i universiteter af Anhui-provinsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
