Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van rhodamine 123 CLIC4 knockdown-geïnduceerde HN4 cel apoptosis in vitrostudie te identificeren van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP). Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, werd de real-time verandering van de MMP opgenomen.
Abstract
Uitputting van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP, ΔΨm) wordt beschouwd als de vroegste gebeurtenis in de apoptotic cascade. Het komt zelfs voor nucleaire apoptotic kenmerken, met inbegrip van condensatie van de chromatine en DNA breuk. Zodra de MMP instortingen, cel apoptosis onherroepelijk begint zal. Een reeks van lipofiele kationische kleurstoffen kan de celmembraan passeren en statistische binnen de matrix van mitochondriën, en dienen als fluorescentie marker te evalueren van MMP verandering. Als één van de zes leden van de Cl- intracellulaire kanaal (CLIC) familie, deelneemt CLIC4 aan het proces van de apoptotic cel voornamelijk door middel van de mitochondriale pathway. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van MMP via het toezicht op de schommelingen van de fluorescentie van Rhodamine 123 (Rh123), via welke we apoptosis geïnduceerd door CLIC4 knockdown bestuderen. We bespreken de voordelen en beperkingen van de toepassing van confocale laser scanning en normale fluorescentie Microscoop in detail, en ook vergelijken met andere methoden.
Introduction
Rh123 is een fluorescentie kationogene kleurstof, die als indicator voor de transmembrane potentieel dient. Rh123 is in staat van doordringing van de celmembraan en het invoeren van de mitochondriale matrix afhankelijk van het potentiaalverschil van binnen en buiten de membraan-1. Apoptosis leidt tot schade van de mitochondriale membraan integriteit. De mitochondrion permeabiliteit overgang porie (MPTP) zal openen en leiden tot de ineenstorting van de MMP, die op zijn beurt tot de vrijlating van Rh123 aan de buitenkant van de mitochondriën leidt. Tot slot zal sterker groene fluorescentie signaal worden gedetecteerd onder fluorescentie Microscoop. Het is goed gedocumenteerd dat uitputting van de MMP en de verhoogde membraan permeabiliteit zijn vroege tekenen van cel apoptosis2. Daarom kunnen Rh123 worden toegepast op de opsporing van MMP verandering en het vóórkomen van cel apoptosis.
Als de 6 meest voorkomende carcinoom in de wereld verslechtert hoofd en nek kanker ernstig iemands gezondheid3. Hoewel vele benaderingen werden ontwikkeld in de afgelopen jaren, is klinische uitkomst van behandeling voor patiënten die lijden aan hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) nog steeds niet ideaal4. Verkennen van nieuwe therapeutische methoden kan het verbeteren van de behandeling voor HNSCC5. Ionenkanalen met tal van biologische processen weergegeven een belangrijke rol in de ontwikkeling van verschillende kankers6. Volledige of gedeeltelijke deelname van Cl- -kanalen zijn zeer betrokken bij de verschillende eigenschappen van neoplastische transformatie, inclusief de actieve migratie, hoge mate van verspreiding en invasiviteit. In dit licht is de CLIC, een roman eiwit familie, opgenomen als een veelbelovende klasse van therapeutische doelen voor6,7van de behandeling van de kanker. Recente studies is gebleken dat leden van de familie van de CLIC met inbegrip van CLIC1, CLIC4 en CLIC5, lokaliseren naar cardiale mitochondriale en het niveau van reactieve zuurstof soorten (ROS) is upregulated door CLIC5, met vermelding van de functionele rol van mitochondriale gelegen Cl - kanalen in de apoptotic reactie8. CLIC4, één van de leden van de familie van de CLIC (ook bekend als mtCLIC, P64H1 en RS43), heeft meest uitvoerig bestudeerd voor de apoptotic verordening eigenschappen in kankercellen en subcellular locatie inclusief endoplasmatisch reticulum, Golgi en mitochondrion in mens keratinocyten7,9,10. Het profiel van de expressie van CLIC4 werd geregeld door Tumornecrosefactor-α (TNF-α), P53 en externe prikkel. Overexpressie en Downregulatie van CLIC4 leiden tot een reactie van de apoptotic voornamelijk door middel van de mitochondriale traject begeleid met het gebrek aan evenwicht van Bcl-2 familie leden, activering van caspase cascade, en vrijlating van cytochroom C11, 12 , 13. Daarom MMP meting is cruciaal voor het verkennen van CLIC4-gerelateerde apoptosis en Rh123 dient als een ideale fluorescentie-indicator.
De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor de detectie van MMP te bestuderen CLIC4 knockdown-veroorzaakte apoptosis in HN4 cellen. Rh123 wordt gebruikt als een fluorescentie-sonde te observeren van de verandering van de MMP. Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, kan de real-time schommelingen van de MMP worden opgelost. We bespreken de voordelen en beperkingen van de toepassing van confocale laser scanning fluorescentie Microscoop in detail, en ook vergelijken met andere methoden. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere apoptosis-gerelateerde studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel cultuur en transfectie
-
Celcultuur
Opmerking: HN4, een cellijn van HNSCC, werd ontleend aan patiënten met HNSCC14.- Cultuur HN4 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) aangevuld met 10% foetale runderserum en antibiotica (100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine). Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2cellen.
-
Cel transfectie
- Één dag voor transfectie, plaat 5 x 10,5 cellen in 2 mL/goed van kweekmedium zonder antibiotica in 6-Wells-platen.
- Verdun 100 pmol CLIC4 siRNA of gecodeerde SiRNA in 250 µL van verminderde serum media, zachtjes. Verdun 5 µL liposoom reagens in de 250 µL van verminderde serum media en incubeer gedurende 5 min. combineren de verdunde siRNA met de verdunde liposoom reagens, meng zachtjes en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel toe aan elk putje met cellen en medium. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer schommelen. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 24 uur voordat u verdergaat met de volgende Rh123 labeling procedure. Het medium vervangen door normale groeimedium 4 h na transfectie.
2. Rh123 Labeling
Opmerking: Rh123 werd gebruikt voor het meten van de MMP in HN4 cellen1.
- Na CLIC4 siRNA behandeling (sectie 1), HN4 cellen in 6-Wells-platen worden gebruikt voor de volgende behandeling. Het bedrag van HN4 cellen in elk is goed genoeg om te herhalen van het experiment 10 keer op coverslips.
- Gebruik pincet om te zetten van cirkelvormige coverslips aan de onderkant van de nieuwe 12-Wells-platen. Het aantal platen wordt ingesteld volgens de proefopzet(Figuur 1).
- 150 µL van 100 µg/mL polylysine zetten in het midden van elke dekglaasje aan binnen de 12-Wells-platen en wacht 2 minuten aandacht besteden aan het niet zetten polylysine buiten de coverslips. Verwijder de polylysine door pipet grondig (Figuur 1B).
- Verwijder van het cultuurmedium van de cellen van de HN4 binnen de schotel en voeg 1 mL 0,25% trypsine als u wilt loskoppelen van de cellen. Na 6 min, voeg 2 mL gestolde voedingsbodem te neutraliseren de trypsine. Voorzichtig mengen de HN4 cellen door pipet voor 5 keer en zaad 2-6 х 104 cellen op de circulaire coverslips. Plaats in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 (Figuur 1C).
- Na een incubatieperiode van 8u, Incubeer de cellen van de HN4 met 2 µmol/L Rh123 voor 40 minuten bij 37 ° C. Meng voorzichtig de middellange en neergaande meerdere malen om ervoor te zorgen voor gelijkmatige verdeling van Rh123 in het medium (Figuur 1D).
- Bereid de oplossing van genoeg normale fysiologische zoutoplossing (NPSS); te maken van NPSS (in mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl21 CaCl2, 10 glucose en 5 HEPES, pH 7.4). Verwarm tot 37 ° C in een waterbad.
- Gebruik van pincet te verwijderen van de coverslips en wassen de resterende vloeistof via kort het plaatsen van de coverslips in de voorverwarmde NPBS buffer (Figuur 1E).
- Plaats de coverslips op de bodem van de 500 µL roestvrij stalen kamer (Zie Tabel van materialen) met een vervangbare 25 mm glas dekglaasje aan bodem verzegeld in plaats van een o-ring. Positiebepaling op tegen de aanscherping van de deksel van de kamer (Figuur 1E).
- Voeg toe 450 µL voorverwarmd NPSS buffer naar de geassembleerde kamer en zet het bad onder het gezichtsveld van de fluorescentie Microscoop of confocale laser scanning fluorescentie Microscoop (Figuur 1E).
3. opsporing van de MMP
-
Gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop
- Inschakelen van de fluorescentie Microscoop na instructies van de fabrikant.
Opmerking: Gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop werd bereikt met een mercury lamp glasvezelkabel lichtbron, een FITC-filter instellen voor Rh123 (480/40 excitatie filter, 505 LP dichroïde spiegel en 535/40 emissie filter) bij kamertemperatuur. 20 X doelstelling werd gebruikt voor het uitvoeren van live-cel imaging. - Open de imaging system-software en selecteer de knop "Nieuw" in de staaf van het bevel om te beginnen een nieuw experiment(Figuur 2).
- Pas de gezichtsveld en wordt de focus naar het vinden van de locatie van de cellen in wit licht.
- Uitschakelen van het licht en druk op de knop sluiten van wit licht. Klik op de "Focus"-knop van de opdrachtbalk en selecteer "Beginnen zich te concentreren" om over te schakelen op de fluorescentie. Zoek de locatie van de cellen opnieuw via microscoop met een 507 nm excitatie en 529 nm lange pass emissie golflengte (Set voordat het experiment). Pas het gezichtsveld en de focus opnieuw indien nodig (Figuur 2B).
- Selecteer een gezichtsveld met slechts 20 tot 30 gescheiden HN4 cellen. De wijziging van intracellulaire fluorescentie signaal voor elke cel zal nauwkeurig worden vastgelegd.
- Zodra een duidelijk gezichtsveld is bereikt, klikt u op "Nauwe focus" van de Focus-bar. Klik op "Acq One" van de opdrachtbalk te verwerven van een set van beelden. Klik op "Regions" van de opdrachtbalk en klik op de knop "OK" om de meting regio's bewerken.
Opmerking: Uit de regio bewerken bar, verschillende regio shapes kunnen worden gebruikt afhankelijk van de studie. - Te passen voor verschillende vormen van afzonderlijke cellen, selecteert u het gereedschap 'Trace Region' en cirkel van de regio van één enkele cel en dubbelklik wanneer u klaar bent. Herhaal de procedure totdat alle cellen zijn omcirkeld (Figuur 2C). Klik op "Done" en selecteer "Afbeeldingen opslaan" om te zoeken naar de opgeslagen locatie.
- Klik op "Zeroclock"en snel druk op F4 om te beginnen met de monitoring van de verandering van de intensiteit van de fluorescentie. De real-time record wijzigen van de intensiteit van de fluorescentie eens elke 5 s voor 5 min (Figuur 2D).
- Wanneer de basislijn stabiel wordt, voeg 50 µL NPSS gemengd met 0,5 µL van 100 mmol/L ATP aan de kamer via pipet. Vergeet niet om niet aanraken de kamer om te voorkomen dat het verwijderen van het gezichtsveld(Figuur 2).
Opmerking: De fluorescentie-afbeelding wordt geregistreerd voor 20 min en dan het experiment via handbediening kan eindigen. De tijdsduur is routinematig geregeld voor 20 min om de gehele observeren fluorescentie wijzigen. Handmatige bediening om te stoppen met vastleggen wordt echter toegepast wanneer onverwachte factoren de stabiliteit van de curve of beïnvloeden wanneer het gehele proces minder dan 20 min duurt.
- Inschakelen van de fluorescentie Microscoop na instructies van de fabrikant.
-
Confocale laser scanning fluorescentie Microscoop
- Zet de confocale laser scanning fluorescentie Microscoop na instructies van de fabrikant, en de meegeleverde software niet openen.
Opmerking: Hier, Rh123 werd opgewekt door een Argon laser vastgesteld op 488 nm en het uitgezonden signaal werd opgenomen over het bereik van 545-700 nm via toepassing van het filter TD488/543/633. - Klik op "Doel" onder het "Verwerven" menu om te Selecteer 63 X / 1.4 objectief van N.A. olie. Observeren van het model en een duidelijk gezichtsveld te vinden onder het licht veld.
- Druk op de "TL/IL" knop om te schakelen naar fluorescentie-modus en selecteer de juiste fluorescentie filters te vinden van de locatie van de cel onder de duisternis via Microscoop. Druk op "SLUITERTIJD" ter bescherming van het model wanneer observatie is voltooid.
- Onder het menu "Verwerven" geschikt bet kanaal aanpassen en klik op "Bereiken" om te activeren het vaste optische weglengte (Figuur 3A). Klik op het "Configuration" menu en kies "Laser" om de benodigde laser-type te bepalen. "Argon" wordt aanbevolen voor dit protocol (Figuur 3B).
- Klik op "Live" real-time beeld te krijgen en ervoor te zorgen dat het gezichtsveld bevat slechts 20 tot 30 gescheiden HN4 cellen. De wijziging van intracellulaire fluorescentie signaal voor elke cel zal nauwkeurig worden vastgelegd.
- Selecteer "xyt" in de acquisitie modus in het submenu "Overname" onder het menu "Verwerven" (Figuur 3C). 5 s en 20 min voor ingesteld tijdsinterval en de duur, respectievelijk. Klik op"Apply" wanneer alle parameters worden afgewikkeld.
- Onder het menu "Quantify" hulpprogramma "Polylijn tekenen" aan de cirkel het gebied van de opname van elke cel. Selecteer "Line profiel" en kies "Start" om uit te voeren van de observatie. Het opnemen van de real-time verandering van de intensiteit van de fluorescentie voor 5 min (Figuur 3D - E).
- Wanneer de basislijn stabiel wordt, voeg 50 µL NPSS gemengd met 0,5 µL van 100 mmol/L ATP aan de kamer via pipet. Vergeet niet om niet aanraken de kamer om te voorkomen dat het verwijderen van het gezichtsveld.
Opmerking: De fluorescentie-afbeelding wordt geregistreerd voor 20 min en vervolgens het experiment is voltooid.
- Zet de confocale laser scanning fluorescentie Microscoop na instructies van de fabrikant, en de meegeleverde software niet openen.
4. statistische analyse
-
Gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop
- Inschakelen van de fluorescentie Microscoop routinematig na van de gebruiksaanwijzing. Open de imaging system-software en selecteer de knop "Openen" in de staaf van het bevel te openen van een opgeslagen experiment. Klik op "Regions" van de 'Command Bar' en klik op "OK" knop om het bewerken van meting regio's.
- Selecteer het gereedschap "Trace regio" cirkel van de regio van één enkele cel en dubbelklik wanneer u klaar bent. Herhaal de procedure totdat alle cellen hebben is omcirkeld. Klik op "Done" en selecteer de "F4: vooruit" knop om het verkrijgen van een trace weergegeven: de intensiteit van de fluorescentie.
- Zodra voltooid, klik op de pijlknop-omlaag gelegen op de lagere juiste hoek van de grafiek en klik op "Toon grafiekgegevens" (Figuur 2F). Klik tweemaal op "OK" en kies de knop "Log" het openen van de interface van data processing software. Klik nogmaals op "Log Data" en vinden dat de records van real-time wisselingen in de intensiteit van de fluorescentie worden weergegeven op het werkblad.
Opmerking: Voor elke cel, veranderingen in MMP werden weergegeven als de verhouding van fluorescentie ten opzichte van de intensiteit vóór de toepassing van ATP of TG (F1/F0). De gegevens van de intensiteit van elke fluorescentie zijn het gemiddelde van 20-30 cellen. Gegevens voor Rh123 worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE. resultaten van 2 groepen werden getest door de tweezijdige onafhankelijke t -test en de P -waarde < 0.05 werd beschouwd als statistische significantie. Statistische analysesoftware werd toegepast op het gedrag van de statistische analyses in dit experiment.
-
Confocale laser scanning fluorescentie Microscoop
- Zet de Microscoop confocale laser en log in op de gebundelde software volgens de instructies van de fabrikant.
- Selecteer "Fire" te openen van een opgenomen experiment.
- Selecteer het gereedschap "Stack profiel" onder het menu "Quantify", kies "All in one" uit "Soort grafieken door kanalen en ROIs."
- Gebruik het "Draw vormgereedschap" cirkel cel regio's voor observatie.
- Selecteer de "Grafiek"-menu en klik op de rechter muisknop en kies "Export naar excel" de waarden van fluorescerende intensiteit aan een werkblad toevoegen. De volgende analyse komt overeen met de normale fluorescentie microscopen (Figuur 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de huidige studie, werd Rh123 toegepast om te ontdekken de MMP. Aanvankelijk, werden HN4 cellen gekweekt voor de volgende fluorescentie kleuring van experimenten. Pincet werden gebruikt om te zetten van cirkelvormige coverslips aan de onderkant van de 6-Wells-platen (Figuur 1A). De coverslips waren bedekt met polylysine voor 5 min en vervolgens de polylysine verwijderd via Pipet (Figuur 1B). Vervolgens werden de HN4 cellen trypsinized en uitgezaaid op de coverslips geplaatst in de bodem van 6-Wells-platen. Vervolgens de juiste hoeveelheid Rh123 werd toegevoegd en gemengd goed (Figuur 1C-D). Na het wassen met de voorverwarmde NPSS, was het dekglaasje aan samengevoegd tot het bekijken kamer. De juiste hoeveelheid NPSS werd toegevoegd voor de volgende experiment (Figuur 1E).
Nadat de procedure voor Rh123 kleuring, werden zowel de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en de confocal microscoop gebruikt om het opnemen van de real-time Rh123 fluorescentie met verschillende stappen en software. Voor de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop, was de beeldbewerkingssoftware ingeschakeld om het maken van een nieuw experiment. De sluiter is geopend om te laten zien het licht groene fluorescentie en de focus en de locatie werden aangepast om te verkrijgen van een passende gezichtsveld. Na het maken van een opname van de cel, werden de vormgereedschappen trace gebruikt om de tekenen van de regio van elke eencellige en noteer de fluorescentie-verandering. Zodra de basislijn werd stabiel, werd ATP toegevoegd in de zaal om te activeren van de mitochondriale membraan depolarisatie. In het experiment van confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, de gebundelde software werd geopend en een optische weglengte van geschikt was ingesteld. Nadat de lichtbron argon werd gekozen, aangepast we de focus en de positie van de kamer om een duidelijk beeld van de cel vormen op scherm. De "xyt" scan-modus werd geselecteerd en het "Draw vormgereedschap" werd toegepast om de cirkel van de cel regio om vast te leggen van de fluorescentie verandering binnen elke één cel. Om de ruwe data te analyseren, F0 was de waarde van intensiteit van de fluorescentie vóór de toepassing van de ATP en F1 was de maximumwaarde van de intensiteit van de fluorescentie na toepassing van ATP. F1/F0 werd gebruikt voor het beoordelen van de mitochondriale membraan depolarisatie (Figuur 2 en Figuur 3). Uit Figuur 4B en Figuur 5B, werden de niveaus van fluorescerende intensiteit verheven na de behandeling van ATP en verminderde terug naar de basislijn na ongeveer 10 min. Figuur 4C en Figuur 5C tonen duidelijk aan dat de piek van de intensiteit van de fluorescentie van Rh123 hoger in de groep onder de CLIC4 siRNA behandeling dan in de controlegroep was. Figuur 4 A en Figuur 5A Toon representatieve beelden van de fluorescerende verandering in elke fase. Vergeleken met de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop, verkregen de confocal microscoop een hogere kwaliteit van de afbeelding, toont celkern- en mitochondriën. Echter, bij het vergelijken van de gegevens uit de twee methoden, werden geen significante verschillen gevonden. Resultaten van fluorescentie en confocal microscoop aangetoond dat knockdown van CLIC4 versterkt ATP-geïnduceerde mitochondriale membraan depolarisatie in de HN4 cellen (Figuur 4 en Figuur 5).
Figuur 1 . Rh123 labeling. (A) pincet werden gebruikt om te zetten van cirkelvormige coverslips aan de onderkant van de 6-Wells-platen. (B) Coating coverslips met polylysine via pipet voor 5 min en tot slot zuig terug in de pipet te verwijderen van de polylysine. (C) HN4 cellen werden uitgezaaid op de coverslips aan de onderkant van de 6-Wells-platen. (D) een geschikte hoeveelheid Rh123 toevoegen en goed mengen. (E) de coverslips met voorverwarmde kerncentrales wassen en montage van de zaal met een geschikte hoeveelheid van de NPSS voor het volgende experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Stappen om te controleren van real-time schommelingen van de fluorescentie van de Rh123 door gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop. (A) Open een nieuw experiment. (B) beginnen zich te concentreren en kies een geschikte gezichtsveld onder fluorescentie. (C) gebruiken het "kennisregio's" tool van de opdrachtbalk observatie regio's bewerken. (D) Klik op "Nul klok" en snel druk op F4 om te beginnen met de monitoring van de verandering van de intensiteit van de fluorescentie. (E) toe te voegen ATP (100 µmol/L) mitochondriale membraan depolarisatie activeren nadat de basislijn wordt stabiel. (F) zodra het experiment is voltooid, klikt u op de pijl-omlaag gelegen op de lagere juiste hoek van de grafiek om gegevens te exporteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Stappen om real-time schommelingen van Rh123 fluorescentie te controleren door confocale laser scanning fluorescentie Microscoop. (A) Selecteer het kanaal bet en set een geschikt golflengtebereik onder het menu "Verwerven". (B) Selecteer de juiste laser-type van "Huidige beschikbare laser" en stel haar macht. (C) Kies van de "xyt" modus observeren en stel een aantal parameters opnemen. (D) Kies de opties "Stack profiel" en "All in One" van "Soort grafieken door kanalen en ROIs." (E) gebruik de tool "Draw veelhoek" cirkel de cel regio voor de real-time gegevens. (F) de waarden van fluorescerende intensiteit exporteren naar data processing software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Effect van CLIC4 knockdown op de ATP-geïnduceerde mitochondriale membraan depolarisatie opgelost door gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop in HN4 cellen. (A) representatieve beelden van fluorescentie schommelingen voor Rh123. representatieve sporen (B) en samengevatte gegevens (C) weergegeven: ATP (100 µmol/L)-geïnduceerde veranderingen in de HN4 cel MMP. De verandering in de membraanpotentiaal werd aangegeven door de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie vóór en na de toepassing van ATP. De verhoging van de verhouding vertegenwoordigt het potentiële depolarisatie van het membraan. De HN4 cellen zijn transfected met CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) of gecodeerde siRNA (Con siRNA). Waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs. controlegroep (Con siRNA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Effect van CLIC4 knockdown op ATP-geïnduceerde mitochondriale membraan depolarisatie opgelost door confocale laser scanning fluorescentie Microscoop in HN4 cellen. (A) representatieve beelden van fluorescentie schommelingen voor Rh123. representatieve sporen (B) en samengevatte gegevens (C) weergegeven: ATP (100 µmol/L)-geïnduceerde veranderingen in de HN4 cel MMP. De verandering in de membraanpotentiaal werd aangegeven door de verhouding van de dichtheid van de fluorescentie vóór en na de toepassing van ATP. De verhoging van de verhouding vertegenwoordigt het potentiële depolarisatie van het membraan. De HN4 cellen transfected waren met CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) of vervormd siRNA (Con siRNA). Waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs. controlegroep (Con siRNA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is goed gedocumenteerd dat Cl− kanalen zijn van essentieel belang bij het handhaven van de hemostase van het interne milieu en spelen een belangrijke rol in de celproliferatie en apoptosis15,16. De relatie tussen ion kanaal-gerichte interventie en apoptosis daarom van grote behoefte en betekenis te vinden van een beter therapeutische aanpak voor verschillende kankers17. Mitochondriën handhaven de normale biologische toestand van een cel en zijn functie zeer heeft betrekking op de membraan permeabiliteit en transmembraan potentieel. Afgezien van kanker, hebben accumuleren neuropathologische onderzoeken gedocumenteerd dat mitochondriale afwijkingen bijdragen tot neurologische symptomen zoals perceptief doofheid, cerebellaire ataxie, dementie, myopathie en hart-en vaatziekten , en epilepsie18,19. Al deze hebben het onderzoek in mitochondriale-gerichte interventie waarmee ter verbetering van klinische behandeling aangespoord. Rh123, een kleurstof mitochondrion-gerichte fluorescentie, kan de celmembraan, en dient als een universele fluorescentie sonde te detecteren MMP doordringen. In het begin staat van cel apoptosis, opening van MPTP verheft de permeabiliteit van de mitochondriale membraan waardoor Rh123 worden vrijgegeven buiten de mitochondriën en tenslotte sterker groene fluorescentie signaal kan worden gedetecteerd. Onder deze situatie, bilaterale ionen vrij distribueren en leiden tot de snelle daling van MMP veroorzaakt ontkoppeling van de keten van het elektronentransport en verminderde ATP productie, die sterk van invloed op de normale energievoorziening van de cellen. Bovendien, de opening van MPTP activeert de uitstroom van pro-apoptotic bioactieve stoffen met inbegrip van Cyt C, apoptose inducerende factor apoptotic protease activerende factor-1, en ROS en uiteindelijk leidt tot onomkeerbare apoptosis20,21 .
ATP veroorzaken mitochondriale membraan depolarisatie zoals aangetoond door verhoogde fluorescentie van Rh123. Door het vergelijken van ATP-geïnduceerde mitochondriale membraan depolarisatie van cellen onder verschillende behandelingen, is het mogelijk om te ontcijferen van de biologische functie van de verandering in de mitochondriën en de mate en de staat van apoptosis22. Zowel gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop kunnen bereiken real-time bewaking van MMP via opname van de wisselingen in de intensiteit van de fluorescentie van Rh123, maar de voordelen en tekortkomingen van beide methoden moeten worden beschouwd. De opnamen die zijn gemaakt door confocale laser scanning fluorescentie Microscoop is vergeleken met de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop, en hebben een hogere resolutie en kwaliteit. Daarom, meer subcellular details kunnen worden gevisualiseerd. Het vermindert bovendien de gevolgen voor de lichte cross-talk wanneer meerdere fluorescentie kleurstoffen worden gebruikt. Vandaar, de confocal microscoop kan juist opnemen de real-time fluorescentie wisselingen in de Rh123 en weerspiegelen de echte cellulaire topicale. Echter, onze methoden voor het controleren van MMP moeten continu opname voor een relatief lange tijd en een reeks cytotoxins, waaronder één zuurstof en ROS, kan worden geproduceerd onder de laserstraling leidt tot cel schade23. Bovendien veroorzaakt hoge laser intensiteit meestal vervagen van fluorescentie kleurstoffen tijdens de continue scanning24. Daarentegen, de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop beelden met hoge kwaliteit als de confocal microscoop kan niet nemen, maar het heeft geen van de bovengenoemde bijwerkingen en dus lange tijdopname mogelijk maakt. Door het vergelijken van onze gegevens uit zowel gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocal microscoop, geen duidelijk verschil kon worden gevonden, die aangeeft dat de gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop bekwaam genoeg is voor het toezicht op de schommelingen van de MMP, alsmede kosteneffectief en handiger data-analyse. HN4 cellen werden zaadjes op coverslips voordat het experiment. Hoewel polylysine wordt toegepast om de cellulaire bijlage, leidt een klein deel van de cellen nog los van de coverslips en de ruwe operatie tot de verslechtering van de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien, toe te voegen Rh123 of ATP in de zaal, moet worden gewaakt niet aanraken van de kamer en de coverslips.
Naast Rh123, DioC6, JC-1 en tetramethyl rhodamine methylester (TMRM) zijn fluorescentie kleurstoffen die kunnen worden gebruikt voor het detecteren van de MMP. In plaats van real-time opname via Microscoop, kan stroom cytometry ook deze taak volbrengen. Opname van de real-time verandering van de intensiteit van de fluorescentie met de Microscoop is echter meer geschikt om te ontdekken de cellulaire topicale en intuïtionistische afbeeldingen, genereren die meer betrouwbare resultaten oplevert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij vriendelijk dank de heer Chao Fang voor celkweek. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Natural Science Foundation van China (Grant nr. 81570403, 81371284); Anhui provinciale Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Outstanding Young Investigator van Anhui Medizinische Universität; Ondersteuning van programma voor uitstekende jonge talenten in de universiteiten van de oostelijke provincie Anhui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
