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Cancer Research

CLIC4 पछाड़ना-प्रेरित HN4 सेल Apoptosis इन विट्रो में अध्ययन करने के लिए Mitochondria झिल्ली क्षमता का पता लगाने

Published: July 17, 2018 doi: 10.3791/56317
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2Department of Orthopedics, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University

Summary

यहाँ हम mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी) की पहचान और अध्ययन CLIC4 पछाड़ना-प्रेरित HN4 सेल apoptosis इन विट्रो मेंrhodamine १२३ के आवेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । कॉमन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एमएमपी के रीयल-टाइम चेंज को रिकॉर्ड किया गया ।

Abstract

mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी, ΔΨm) की कमी अपोप्तोटिक झरना में जल्द घटना माना जाता है । यह क्रोमेटिन संघनित्र और डीएनए टूटना सहित नाभिकीय अपोप्तोटिक विशेषताओं से भी आगे होता है । एक बार एमएमपी पतन, सेल apoptosis अचल शुरू होगा । lipophilic cationic रंजक की एक श्रृंखला mitochondrion के मैट्रिक्स के अंदर कोशिका झिल्ली और कुल के माध्यम से पारित कर सकते हैं, और एमएमपी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिदीप्ति मार्कर के रूप में सेवा. सीएल- intracellular चैनल (CLIC) परिवार के छह सदस्यों में से एक के रूप में, CLIC4 मुख्य रूप से mitochondrial मार्ग के माध्यम से सेल अपोप्तोटिक प्रक्रिया में भाग लेता है । यहाँ हम Rhodamine १२३ (Rh123) के प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव की निगरानी के माध्यम से एमएमपी को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके माध्यम से हम apoptosis CLIC4 द्वारा प्रेरित पछाड़ना का अध्ययन करते हैं । हम लाभ और विस्तार में फोकल लेजर स्कैनिंग और सामांय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के आवेदन की सीमाओं पर चर्चा, और यह भी अंय तरीकों के साथ तुलना करें ।

Introduction

Rh123 एक cationic प्रतिदीप्ति डाई है, जो transmembrane क्षमता के लिए एक संकेतक के रूप में कार्य करता है । Rh123 कोशिका झिल्ली मर्मज्ञ और अंदर और बाहर झिल्ली1के संभावित अंतर के आधार पर mitochondrial मैट्रिक्स में प्रवेश करने में सक्षम है । Apoptosis mitochondrial झिल्ली अखंडता की क्षति की ओर जाता है । mitochondrion पारगम्यता संक्रमण ताकना (MPTP) खोलने के लिए और एमएमपी, जो Rh123 के mitochondria के बाहर करने के लिए जारी में परिणामों में बारी के पतन के लिए नेतृत्व करेंगे । अंत में, मजबूत हरी प्रतिदीप्ति संकेत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाया जाएगा । यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि एमएमपी और ऊंचा झिल्ली पारगम्यता की कमी सेल apoptosis2के प्रारंभिक लक्षण हैं । इसलिए, Rh123 एमएमपी परिवर्तन और कक्ष apoptosis की पुनरावृत्ति का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।

दुनिया में 6 सबसे आम कार्सिनोमा के रूप में, सिर और गर्दन के कैंसर गंभीर रूप से एक व्यक्ति के स्वास्थ्य3बिगड़ती है । हालांकि कई दृष्टिकोण हाल के वर्षों में विकसित किए गए, सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) से पीड़ित रोगियों के लिए उपचार के नैदानिक परिणाम अभी भी4आदर्श नहीं है । नए चिकित्सकीय तरीकों की खोज5HNSCC के लिए उपचार में सुधार कर सकते हैं । कई जैविक प्रक्रियाओं को शामिल आयन चैनल अलग6कैंसर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका प्रदर्शित करते हैं । सीएल चैनल की आंशिक या कुल भागीदारी अत्यधिक सक्रिय प्रवास, प्रसार और इनवेसिव की उच्च दर सहित नवोत्पादित परिवर्तन के विभिन्न गुणों में शामिल हैं । इस के प्रकाश में, CLIC, एक उपंयास प्रोटीन परिवार, कैंसर के इलाज के लिए चिकित्सकीय लक्ष्य के एक होनहार वर्ग के रूप में सूचीबद्ध किया गया है6,7। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि CLIC1, CLIC4, और CLIC5 सहित CLIC परिवार के सदस्यों, कार्डियक mitochondrial और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के स्तर को स्थानीयकृत CLIC5 द्वारा किया जाता है, mitochondrial के कार्यात्मक भूमिका का संकेत-सीएल स्थित - अपोप्तोटिक जवाब में चैनल8. CLIC4, CLIC परिवार के एक सदस्य (भी mtCLIC, P64H1, और RS43 के रूप में जाना जाता है), सबसे बड़े पैमाने पर कैंसर की कोशिकाओं और अपोप्तोटिक, Golgi endoplasmic सहित सेलुलर स्थान में अपनी जालिका विनियमन संपत्तियों के लिए अध्ययन किया गया है, और मानव में mitochondrion keratinocytes७,९,१०. CLIC4 की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल ट्यूमर परिगलन कारक द्वारा विनियमित किया गया था-α (TNF-α), P53, और बाहरी उत्तेजना. और CLIC4 के downregulation व्यक्त एक अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया मुख्य रूप से mitochondrial मार्ग के माध्यम से Bcl के असंतुलन के साथ साथ-2 परिवार के सदस्यों को ट्रिगर, caspase झरना के सक्रियकरण, और cytochrome सी11की रिहाई, 12 , 13. इसलिए, एमएमपी माप CLIC4 से संबंधित apoptosis का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है, और Rh123 एक आदर्श प्रतिदीप्ति संकेतक के रूप में कार्य करता है ।

वर्तमान अध्ययन HN4 कोशिकाओं में CLIC4 पछाड़ना-प्रेरित apoptosis अध्ययन करने के लिए एमएमपी का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है । Rh123 एमएमपी के परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए एक प्रतिदीप्ति जांच के रूप में प्रयोग किया जाता है । कॉमन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत, एमएमपी के वास्तविक समय में उतार-चढ़ाव का समाधान हो सकता है । हम लाभ और विस्तार में फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के आवेदन की सीमाओं पर चर्चा, और यह भी अन्य तरीकों के साथ तुलना. इस प्रोटोकॉल को भी अन्य apoptosis से संबंधित अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

1. सेल कल्चर और अभिकर्मक

  1. सेल संस्कृति
    नोट: HN4, एक HNSCC सेल लाइन, HNSCC14के साथ रोगियों से व्युत्पंन किया गया था ।
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम में संस्कृति HN4 कोशिकाओं (DMEM, ४.५ g/L ग्लूकोज) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (१०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin) । 5% सह2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
  2. सेल अभिकर्मक
    1. एक दिन पहले अभिकर्मक, प्लेट 5 x 105 कोशिकाओं में 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से प्लेटों में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति माध्यम की ।
    2. पतला १०० pmol CLIC4 सिरना या तले हुए सिरना में २५० µ एल के कम सीरम मीडिया, धीरे । कम सीरम मीडिया के २५० µ एल में 5 µ l liposome एजेंट पतला और 5 मिनट के लिए गर्मी. पतला liposome एजेंट के साथ पतला सिरना गठबंधन, धीरे मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए गर्मी ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं और मध्यम करने के लिए मिश्रण जोड़ें । थाली वापस रॉक और आगे से धीरे मिश्रण । निंनलिखित Rh123 लेबलिंग प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले 24 घंटे के लिए एक सह2 मशीन में ३७ ° c में कोशिकाओं को मशीन । मध्यम को सामान्य विकास के साथ बदलें मध्यम 4 अभिकर्मक के बाद एच ।

2. Rh123 लेबलिंग

नोट: Rh123 HN4 कोशिकाओं में एमएमपी को मापने के लिए उपयोग किया गया था1.

  1. CLIC4 सिरना उपचार (खंड 1) के बाद, निम्नलिखित उपचार के लिए 6-well प्लेट्स में HN4 कोशिकाओं का उपयोग करें । प्रत्येक कुआं में HN4 कोशिकाओं की मात्रा coverslips पर प्रयोग 10 बार दोहराने के लिए पर्याप्त है ।
  2. नई 12-खैर प्लेटों के तल पर परिपत्र coverslips डाल करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें । प्रायोगिक डिजाइन (चित्रा 1ए) के अनुसार प्लेटों की संख्या निर्धारित है ।
  3. डाल १५० µ l के १०० µ g/मब polylysine के बीच पर हर coverslip के बीच में 12-अच्छी तरह से प्लेटें और प्रतीक्षा 2 min. polylysine के बाहर coverslips नहीं डाल करने के लिए ध्यान देना । फिर polylysine को अच्छी तरह से pipettor करके निकाल दें (figure 1B).
  4. डिश के अंदर HN4 कोशिकाओं के कल्चरल मीडियम को निकालें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 एमएल ०.२५% trypsin जोड़ें । 6 मिनट के बाद, trypsin बेअसर करने के लिए 2 एमएल संस्कृति माध्यम जोड़ें । धीरे से HN4 कोशिकाओं को pipettor द्वारा 5 बार और बीज 2-6 х 104 कोशिकाओं के लिए परिपत्र coverslips पर मिश्रण । एक मशीन में 5% सह2 (चित्रा 1सी) के साथ ३७ ° c में प्लेस ।
  5. 8 घंटे की मशीन के बाद, HN4 कोशिकाओं को 2 µmol/L Rh123 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४० मिनट के लिए मशीन । मध्यम (चित्रा 1डी) में Rh123 का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए धीरे से मध्यम और नीचे कई बार मिश्रण ।
  6. तैयार पर्याप्त सामांय शारीरिक खारा समाधान (NPSS); NPSS बनाने के लिए (mmol/L में): १४० NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 ग्लूकोज, और 5 HEPES, पीएच ७.४). एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए कचौरी ।
  7. coverslips निकालने के लिए चिमटी का उपयोग करें और coverslips को पहले से गरम NPBS बफ़र (चित्रा 1ई) में रखने के माध्यम से शेष तरल को धो लें ।
  8. ५०० µ एल स्टेनलेस स्टील चैंबर के तल पर coverslips प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) एक बदली 25 मिमी ग्लास coverslip नीचे एक ओ द्वारा जगह में बंद के साथ-अंगूठी । चैंबर (चित्रा 1ई) के ढक्कन कस कर इसे ठीक करें ।
  9. जोड़ें ४५० µ एल पहले से ही इकट्ठे चैंबर को NPSS बफर और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र के तहत स्नान डाल (चित्रा 1ई) ।

3. एमएमपी का पता लगाना

  1. आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
    1. निर्माता के निर्देशों के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को चालू करें ।
      नोट: आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक पारा लैंप fiberoptic प्रकाश स्रोत के साथ पूरा किया गया था, कमरे के तापमान पर Rh123 (480/40 उत्तेजना फिल्टर, ५०५ LP dichroic मिरर और 535/40 उत्सर्जन फिल्टर) के लिए एक FITC फिल्टर सेट । 20X उद्देश्य लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    2. इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर खोलें और आदेश पट्टी से "नया" बटन का चयन करने के लिए एक नया प्रयोग शुरू (चित्रा 2ए) ।
    3. सफेद रोशनी में कोशिकाओं के स्थान को खोजने के लिए दृश्य क्षेत्र और ध्यान समायोजित करें ।
    4. लाइट बंद करें और सफेद लाइट बंद करने के लिए बटन पुश करें । कमांड बार से "फोकस" बटन पर क्लिक करें और प्रतिदीप्ति पर स्विच करने के लिए "फोकस शुरू" का चयन करें । एक ५०७ एनएम उत्तेजना और ५२९ एनएम लंबे पास उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ माइक्रोस्कोप के माध्यम से फिर से कोशिकाओं के स्थान का पता लगाएं (प्रयोग करने से पहले सेट) । दृश्य क्षेत्र को समायोजित करें और अगर जरूरत (चित्रा 2ख) फिर से ध्यान केंद्रित ।
    5. केवल 20 से 30 अलग HN4 कक्षों वाले दृश्य फ़ील्ड का चयन करें । प्रत्येक कोशिका के लिए intracellular प्रतिदीप्ति सिग्नल का परिवर्तन सही दर्ज किया जाएगा ।
    6. एक स्पष्ट दृश्य क्षेत्र हासिल किया है एक बार, फोकस पट्टी से "बंद ध्यान केंद्रित" पर क्लिक करें । छवियों का एक सेट प्राप्त करने के लिए आदेश पट्टी से "Acq एक" पर क्लिक करें । आदेश पट्टी से "क्षेत्र" पर क्लिक करें और मापन क्षेत्रों को संपादित करने के लिए "ठीक" बटन पर क्लिक करें.
      नोट: क्षेत्र पट्टी संपादित करें से, विभिन्न क्षेत्र आकृतियों का अध्ययन के आधार पर उपयोग किया जा सकता है ।
    7. व्यक्तिगत कोशिकाओं के विभिन्न आकारों के लिए फिट करने के लिए, "ट्रेस क्षेत्र" उपकरण का चयन करें और एक एकल सेल के क्षेत्र और जब समाप्त डबल क्लिक करें । प्रक्रिया दोहराएं जब तक सभी कक्षों को घेरे (चित्रा 2सी) । "पूर्ण" क्लिक करें और सहेजे गए स्थान को ढूँढने के लिए "छवियाँ सहेजें" चुनें.
    8. "Zeroclock" पर क्लिक करें और जल्दी प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिवर्तन की निगरानी शुरू करने के लिए F4 धक्का. रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता के वास्तविक समय परिवर्तन एक बार हर 5 5 मिनट के लिए एस (चित्रा 2डी) ।
    9. जब आधार रेखा स्थिर हो जाता है, जोड़ें ५० µ l NPSS ०.५ µ एल के साथ मिश्रित १०० mmol/l एटीपी के चैंबर के माध्यम से pipettor. दृश्य क्षेत्र (चित्रा 2ई) को हटाने से बचने के लिए चैंबर स्पर्श नहीं करने के लिए याद रखें ।
      नोट: प्रतिदीप्ति छवि 20 मिनट के लिए दर्ज किया जाएगा और फिर प्रयोग मैनुअल आपरेशन के माध्यम से समाप्त कर सकते हैं । समय अवधि नियमित रूप से 20 मिनट के लिए तय की है ताकि पूरे प्रतिदीप्ति परिवर्तन का निरीक्षण । हालांकि, कैप्चर रोकने के लिए मैन्युअल कार्रवाई लागू किया जाता है जब अनपेक्षित कारक स्थिरता वक्र या जब पूरी प्रक्रिया से कम 20 मिनट लेता है को प्रभावित करते हैं ।
  2. फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर मुड़ें, और बंडल सॉफ्टवेयर खोलें ।
      नोट: यहां, Rh123 एक आर्गन ४८८ एनएम पर सेट लेजर से उत्साहित है और उत्सर्जित संकेत ५४५ की सीमा पर दर्ज किया गया था-७०० एनएम TD488 के आवेदन के माध्यम से/
    2. 63X/1.4 एनए तेल उद्देश्य लेंस का चयन करने के लिए "मोल" मेनू के अंतर्गत "उद्देश्य" पर क्लिक करें । नमूना निरीक्षण और प्रकाश क्षेत्र के तहत एक स्पष्ट दृश्य क्षेत्र लगता है ।
    3. प्रतिदीप्ति मोड में स्विच और माइक्रोस्कोप के माध्यम से अंधेरे के तहत सेल के स्थान को खोजने के लिए सही प्रतिदीप्ति फिल्टर का चयन करने के लिए "TL/IL" बटन पुश. अवलोकन समाप्त हो गया है जब नमूना की रक्षा के लिए "शटर" पुश.
    4. "मोल" मेनू के तहत, उपयुक्त PMT चैनल को समायोजित और क्लिक करें "प्राप्त" बसे ऑप्टिकल पथ को सक्रिय करने के लिए (चित्रा 3ए). "विंयास" मेनू पर क्लिक करें और "लेजर" का चयन करने के लिए आवश्यक लेजर प्रकार का निर्धारण । "आर्गन" इस प्रोटोकॉल (चित्रा 3बी) के लिए सिफारिश की है.
    5. रीयल-टाइम छवि प्राप्त करने के लिए "लाइव" क्लिक करें और सुनिश्चित कर लें कि विज़ुअल फ़ील्ड में केवल 20 से 30 अलग HN4 कक्ष हैं. प्रत्येक कोशिका के लिए intracellular प्रतिदीप्ति सिग्नल का परिवर्तन सही दर्ज किया जाएगा ।
    6. "प्राप्ति" मेनू (चित्रा 3C) के अंतर्गत "अधिग्रहण" सबमेनू में अधिग्रहण मोड में "xyt" का चयन करें । सेट 5 एस और समय अंतराल और अवधि के लिए 20 मिनट, क्रमशः । जब सभी पैरामीटर सुलझाएं "लागू करें" पर क्लिक करे ।
    7. "यों तो" मेनू के अंतर्गत, प्रत्येक कक्ष की रिकॉर्डिंग क्षेत्र को वृत्त करने के लिए "ड्रा Polyline" उपकरण का उपयोग करें । "रेखा प्रोफ़ाइल" का चयन करें और अवलोकन आचरण करने के लिए "प्रारंभ" चुनें । 5 मिनट (चित्रा 3डी-ई) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के वास्तविक समय परिवर्तन रिकॉर्ड.
    8. जब आधार रेखा स्थिर हो जाता है, जोड़ें ५० µ l NPSS ०.५ µ एल के साथ मिश्रित १०० mmol/l एटीपी के चैंबर के माध्यम से pipettor. कक्ष दृश्य फ़ील्ड को निकालने से बचने के लिए स्पर्श नहीं करने के लिए याद रखें ।
      नोट: प्रतिदीप्ति छवि 20 मिनट के लिए दर्ज किया जाएगा और फिर प्रयोग पूरा हो गया है ।

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
    1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर बारी नियमित रूप से ऑपरेटर के मैनुअल के बाद । इमेजिंग सिस्टम सॉफ़्टवेयर खोलें और एक सहेजे गए प्रयोग को खोलने के लिए आदेश पट्टी से "खोलें" बटन का चयन करें । "क्षेत्र" आदेश पट्टी से क्लिक करें और माप क्षेत्रों को संपादित करने के लिए "ठीक" बटन पर क्लिक करें ।
    2. "ट्रेस क्षेत्र" उपकरण का चयन करें और एक एकल सेल और डबल क्लिक करें जब किया के क्षेत्र चक्र । प्रक्रिया दोहराएं जब तक सभी कक्षों को प्रवृत्त नहीं किया गया है । "पूर्ण" क्लिक करें और प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाने वाले ट्रेस प्राप्त करने के लिए "F4: अग्रेषित करें" बटन चुनें.
    3. एक बार समाप्त होने पर, ग्राफ़ के निचले दाएँ कोने पर स्थित नीचे तीर बटन पर क्लिक करें और "ग्राफ़ डेटा दिखाएँ" (चित्रा 2F) पर क्लिक करें. दो बार "ठीक" क्लिक करें और डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के इंटरफेस को खोलने के लिए "लॉग डेटा" बटन चुनें । "लॉग डेटा" फिर से क्लिक करें और प्रतिदीप्ति तीव्रता के वास्तविक समय अस्थिरता के रिकॉर्ड को खोजने के स्प्रेडशीट पर दिखाई देते हैं ।
      नोट: प्रत्येक कक्ष के लिए, एमएमपी में परिवर्तन एटीपी या टीजी (F1/F0) के आवेदन से पहले तीव्रता के सापेक्ष प्रतिदीप्ति के अनुपात के रूप में प्रदर्शित किए गए । प्रत्येक प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा 20-30 कोशिकाओं के औसत थे । Rh123 के लिए डेटा मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । 2 समूहों से परिणाम दो पूंछ स्वतंत्र टी परीक्षण और पी मान < 0.05 सांख्यिकीय महत्व के रूप में माना जाता था द्वारा परीक्षण किया गया । सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस प्रयोग में सांख्यिकीय विश्लेषण के संचालन के लिए लागू किया गया था ।
  2. फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
    1. फोकल लेजर माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और निर्माता के निर्देशों का पालन बंडल सॉफ्टवेयर में प्रवेश करें ।
    2. एक रिकॉर्ड प्रयोग खोलने के लिए "आग" का चयन करें ।
    3. "मात्रा" मेनू के अंतर्गत "स्टैक प्रोफ़ाइल" टूल का चयन करें, चैनल और ROIs द्वारा क्रमबद्ध चार्ट्स से "सभी में एक" चुनें.
    4. अवलोकन के लिए सर्कल सेल क्षेत्रों के लिए "बहुभुज ड्रा" उपकरण का उपयोग करें ।
    5. चुनें "ग्राफ" मेनू और सही माउस बटन पर क्लिक करें, और चुनें "एक्सेल में निर्यात" एक स्प्रेडशीट के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता के मूल्यों को जोड़ने के लिए । निम्नलिखित विश्लेषण सामान्य प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा ३एफ) के अनुरूप है.

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, एमएमपी का पता लगाने के लिए Rh123 लागू किया गया था । प्रारंभ में, HN4 कोशिकाओं निंनलिखित प्रतिदीप्ति धुंधला प्रयोगों के लिए संस्कृति थे । चिमटी 6-well प्लेट्स (चित्रा 1ए) के तल पर परिपत्र coverslips डाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया । coverslips 5 मिनट के लिए polylysine के साथ लेपित थे और फिर pipettor के माध्यम से हटा polylysine (चित्रा 1बी) । इसके बाद HN4 कोशिकाओं को trypsinized गया और 6-वेल प्लेटों के नीचे रखे coverslips पर बीज लगाया गया । अगले, Rh123 की उचित मात्रा में जोड़ा गया था और अच्छी तरह से मिलाया (चित्रा 1सी-डी). कचौरी के NPSS से धोने के बाद coverslip को देखने वाले चैंबर में इकट्ठे हो गए । NPSS का उचित मात्रा में निंनलिखित प्रयोग के लिए जोड़ा गया था (चित्रा 1ई) ।

Rh123 दाग की प्रक्रिया के बाद, दोनों आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और फोकल माइक्रोस्कोप अलग कदम और सॉफ्टवेयर के साथ वास्तविक समय Rh123 प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया । कॉमन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए एक नया प्रयोग बनाने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर चालू किया गया था । शटर हरी प्रतिदीप्ति प्रकाश दिखाने के लिए खोला गया था और ध्यान और स्थान के लिए एक उपयुक्त दृश्य क्षेत्र प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया । एक सेल छवि लेने के बाद, आकार ट्रेस उपकरण हर एक सेल के क्षेत्र आकर्षित और फिर प्रतिदीप्ति परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किया गया । आधारभूत एक बार स्थिर हो गया, एटीपी चैंबर में जोड़ा गया mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण को ट्रिगर करने के लिए । फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के प्रयोग में, बंडल सॉफ्टवेयर खोला गया था और एक उपयुक्त ऑप्टिकल पथ निर्धारित किया गया था. आर्गन प्रकाश स्रोत चुना गया था के बाद, हम ध्यान और कक्ष की स्थिति स्क्रीन पर सेल आकार का एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए समायोजित । "xyt" स्कैन मोड का चयन किया गया था और प्रत्येक एकल कक्ष के भीतर प्रतिदीप्ति परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए कक्ष क्षेत्र को वृत्त करने के लिए "बहुभुज आरेखित करें" उपकरण लागू किया गया था । रॉ डेटा का विश्लेषण करने के लिए, F0 एटीपी आवेदन के पहले प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्य था और F1 एटीपी आवेदन के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता का अधिकतम मूल्य था । F1/F0 mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण (चित्रा 2 और चित्रा 3) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 4बी और चित्रा 5बीसे, फ्लोरोसेंट तीव्रता के स्तर एटीपी के उपचार के बाद बुलंद किया गया और के बारे में 10 मिनट के बाद आधारभूत वापस कमी आई. चित्रा 4सी और चित्रा 5सी स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि Rh123 के प्रतिदीप्ति तीव्रता के शिखर नियंत्रण समूह में उस से CLIC4 सिरना उपचार के तहत समूह में अधिक था । चित्र 4 एक और चित्रा 5प्रत्येक चरण में फ्लोरोसेंट परिवर्तन केएक शो प्रतिनिधि छवियां । आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ तुलना में, फोकल माइक्रोस्कोप छवि की एक उच्च गुणवत्ता प्राप्त की, कोशिका नाभिक और mitochondria दिखा । हालांकि, जब दो विधियों में से डेटा की तुलना, कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिले । प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोप से परिणामों का प्रदर्शन किया कि CLIC4 की पछाड़ना संवर्धित एटीपी प्रेरित mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण HN4 कोशिकाओं में (चित्रा 4 और चित्रा 5).

Figure 1
चित्रा 1 . Rh123 लेबलिंग. (क) चिमटी को ६-वेल प्लेटों के नीचे गोलाकार coverslips लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया. (ख) 5 मिनट के लिए pipettor के माध्यम से polylysine के साथ कोटिंग coverslips और अंत में pipettor में वापस चूषण polylysine को दूर करने के लिए । (ग) HN4 कोशिकाओं को coverslips पर ६-वेल प्लेटों के नीचे की तरफ वरीयता दी गई थी. (घ) Rh123 की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ना और अच्छी तरह से मिलाना. (ङ) पहले से गरम NPPS के साथ coverslips धुलाई और निम्नलिखित प्रयोग के लिए NPSS के एक उपयुक्त मात्रा के साथ चैंबर कोडांतरण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा Rh123 प्रतिदीप्ति के वास्तविक समय के उतार-चढ़ाव की निगरानी करने के लिए कदम । (a) एक नया प्रयोग खोलें । (ख) ध्यान केंद्रित शुरू करने और प्रतिदीप्ति के तहत एक उपयुक्त दृश्य क्षेत्र का चयन करें । (ग) अवलोकन क्षेत्रों को संपादित करने के लिए आदेश पट्टी से "क्षेत्रों" उपकरण का उपयोग करना. (घ) "शूंय घड़ी" पर क्लिक करें और जल्दी से प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिवर्तन की निगरानी शुरू करने के लिए F4 धक्का । (ङ) आधारभूत के बाद mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण को ट्रिगर करने के लिए एटीपी (१०० µmol/ (च) प्रयोग समाप्त होने के बाद, डेटा निर्यात करने के लिए ग्राफ़ के निचले दाएँ कोने पर स्थित नीचे तीर पर क्लिक करें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा Rh123 प्रतिदीप्ति के वास्तविक समय में उतार-चढ़ाव की निगरानी करने के लिए कदम । (क) PMT चैनल का चयन करें और "मोल" मेनू के तहत एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य सीमा निर्धारित किया है । (ख) "वर्तमान उपलब्ध लेजर" से सही लेजर प्रकार का चयन करें और अपनी शक्ति निर्धारित किया है । (ग) "xyt" मेटाबॉलिज्म मोड चुनें और रिकॉर्डिंग पैरामीटर्स की एक श्रृंखला सेट करें । (D) "स्टैक प्रोफ़ाइल" और "सभी एक में" से "चैनल और ROIs द्वारा सॉर्ट चार्ट्स" टूल चुनें । (ङ) रीयल-टाइम डेटा के लिए कक्ष क्षेत्र को वृत्त करने के लिए उपकरण "बहुभुज आरेखित करें" का उपयोग करना । (च) डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता के मूल्यों का निर्यात करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . एटीपी प्रेरित mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण HN4 कोशिकाओं में आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा हल पर CLIC4 पछाड़ना का प्रभाव । (क) Rh123 के लिए प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव का प्रतिनिधि चित्र. प्रतिनिधि अंश (ख) और संक्षेप में दिए गए आंकड़ों (ग) एटीपी दिखा रहा है (१०० µmol/L)-HN4 सेल एमएमपी में प्रेरित परिवर्तन । प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात से पहले और एटीपी के आवेदन के बाद झिल्ली क्षमता में परिवर्तन संकेत दिया गया था । अनुपात में वृद्धि झिल्ली संभावित ध्रुवीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । HN4 कोशिकाओं CLIC4siRNA (CLIC4 सिरना) या तले हुए सिरना (Con सिरना) के साथ transfected थे. मूल्यों मतलब ± SEM. n = 5 के रूप में दिखाया गया है । *P < 0.05 बनाम नियंत्रण (Con सिरना) समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . CLIC4 पछाड़ना के एटीपी पर प्रभाव-प्रेरित mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण HN4 कोशिकाओं में फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा हल । (क) Rh123 के लिए प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव का प्रतिनिधि चित्र. प्रतिनिधि अंश (ख) और संक्षेप में दिए गए आंकड़ों (ग) एटीपी दिखा रहा है (१०० µmol/L)-HN4 सेल एमएमपी में प्रेरित परिवर्तन । प्रतिदीप्ति घनत्व के अनुपात से पहले और एटीपी के आवेदन के बाद झिल्ली क्षमता में परिवर्तन दर्शाया गया था । अनुपात में वृद्धि झिल्ली संभावित ध्रुवीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । HN4 कोशिकाओं CLIC4 सिरना (CLIC4 सिरना) या तले हुए सिरना (Con सिरना) के साथ transfected थे. मूल्यों मतलब ± SEM. n = 5 के रूप में दिखाया गया है । *P < 0.05 बनाम नियंत्रण (Con सिरना) समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि सीएल− चैनल आंतरिक वातावरण के रक्तस्तम्भन को बनाए रखने और सेल प्रसार और apoptosis15,16में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने में आवश्यक हैं । इसलिए, आयन चैनल के बीच संबंधों को समझना-लक्षित हस्तक्षेप और apoptosis बड़ी जरूरत है और महत्व के विभिंन कैंसर17के लिए एक बेहतर चिकित्सीय दृष्टिकोण खोजने के लिए है । Mitochondria एक कोशिका के सामान्य जैविक राज्य को बनाए रखने और अपने कार्य अत्यधिक अपनी झिल्ली पारगम्यता और transmembrane क्षमता से संबंधित है. कैंसर के अलावा, neuropathological जांच जमा है कि mitochondrial विषमताओं मायोपथी, हृदय रोग, और sensorineural बहरापन, अनुमस्तिष्क गतिभंग, मनोभ्रंश सहित स्नायविक लक्षण के लिए योगदान प्रलेखित है , और मिर्गी18,19. इन सभी mitochondrial में अनुसंधान प्रेरित है-लक्षित हस्तक्षेप जिसके साथ नैदानिक उपचार उंनति के लिए । Rh123, एक mitochondrion-लक्षित प्रतिदीप्ति डाई, कोशिका झिल्ली घुसना कर सकते हैं, और एमएमपी का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक प्रतिदीप्ति जांच के रूप में कार्य करता है । सेल apoptosis के प्रारंभिक राज्य में, MPTP के उद्घाटन Rh123 mitochondria और अंत में मजबूत हरी प्रतिदीप्ति संकेत पता लगाया जा सकता है के बाहर जारी किया जा करने के लिए अनुमति mitochondrial झिल्ली पारगम्यता तरक्की । इस स्थिति के तहत, द्विपक्षीय आयनों स्वतंत्र रूप से वितरित और एमएमपी की तेजी से गिरावट के लिए नेतृत्व इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के युग्मन पैदा करने और एटीपी उत्पादन, जो गंभीर रूप से कोशिकाओं के सामान्य ऊर्जा की आपूर्ति को प्रभावित करता है की कमी हुई. इसके अतिरिक्त, MPTP के उद्घाटन प्रो-अपोप्तोटिक Cyt सी, apoptosis उत्प्रेरण कारक, अपोप्तोटिक को सक्रिय करने के कारक-1, और ROS, और अंत में अपरिवर्तनीय apoptosis20,21 की ओर जाता है सहित सक्रिय यौगिकों के बहिर्वाह ट्रिगर .

एटीपी mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण के रूप में Rh123 के ऊंचा प्रतिदीप्ति द्वारा प्रदर्शित प्रेरित हो सकता है । विभिन्न उपचार के तहत कोशिकाओं के एटीपी प्रेरित mitochondrial झिल्ली ध्रुवीकरण की तुलना करके, यह mitochondria में परिवर्तन के जैविक समारोह और apoptosis22की डिग्री और राज्य को समझने के लिए संभव है । दोनों आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप Rh123 की प्रतिदीप्ति तीव्रता के उतार-चढ़ाव रिकॉर्डिंग के माध्यम से एमएमपी की वास्तविक समय की निगरानी को प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन लाभ और दोनों तरीकों की कमियों की जरूरत है माना जाता. आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ तुलना में, फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा कब्जा कर लिया छवियों उच्च संकल्प और गुणवत्ता की है. इसलिए, अधिक सेलुलर विवरण visualized किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यह प्रकाश पार बात के प्रभावों को कम करती है जब एकाधिक प्रतिदीप्ति रंजक उपयोग किया जाता है । इसलिए, फोकल माइक्रोस्कोप ठीक Rh123 के वास्तविक समय प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव रिकॉर्ड कर सकते हैं और वास्तविक सेलुलर की गतिविधियों को प्रतिबिंबित करते हैं । हालांकि, हमारे तरीकों की निगरानी एमएमपी लगातार एक रिश्तेदार लंबे समय के लिए रिकॉर्डिंग की जरूरत है और cytotoxins की एक श्रृंखला, एक ऑक्सीजन और ROS सहित, लेजर कोशिका क्षति के लिए अग्रणी विकिरण के तहत उत्पादन किया जा सकता है23। इसके अलावा, उच्च लेजर तीव्रता आम तौर पर लगातार स्कैनिंग24के दौरान प्रतिदीप्ति रंजक के लुप्त होने का कारण बनता है । इसके विपरीत, आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप फोकल माइक्रोस्कोप की तरह उच्च गुणवत्ता के साथ छवियों को नहीं ले जा सकते हैं, लेकिन यह aforementioned प्रतिकूल प्रभाव नहीं है और इस तरह लंबे समय रिकॉर्डिंग संभव बनाता है. दोनों आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और फोकल माइक्रोस्कोप से हमारे डेटा की तुलना करके, कोई स्पष्ट अंतर पाया जा सकता है, जो इंगित करता है कि आम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एमएमपी के उतार-चढ़ाव की निगरानी के लिए पर्याप्त सक्षम है, साथ ही लागत प्रभावी और अधिक सुविधाजनक डेटा विश्लेषण । प्रयोग से पहले coverslips पर HN4 कोशिकाओं को वरीयता दी गई. हालांकि polylysine सेलुलर लगाव बढ़ाने के लिए लागू किया जाता है, कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश अभी भी coverslips और किसी न किसी आपरेशन से अलग कोशिका व्यवहार्यता की हानि की ओर जाता है । इसके अलावा, चैंबर में Rh123 या एटीपी जोड़ने, देखभाल चैंबर और coverslips स्पर्श नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए ।

इसके अलावा Rh123, DioC6, जे. सी.-1, और tetramethyl rhodamine मिथाइल एस्टर (TMRM) प्रतिदीप्ति रंजक है जो एमएमपी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । माइक्रोस्कोप के माध्यम से वास्तविक समय रिकॉर्डिंग के बजाय, प्रवाह cytometry भी इस कार्य को पूरा कर सकते हैं । हालांकि, माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता के वास्तविक समय परिवर्तन रिकॉर्डिंग और अधिक विश्वसनीय परिणाम देने, सेलुलर गैर गतिविधि की खोज और intuitionistic छवियों उत्पन्न करने के लिए अधिक उपयुक्त है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कृपया सेल संस्कृति के लिए श्री चाओ फेंग धंयवाद । यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट No. ८१५७०४०३, ८१३७१२८४) से अनुदान द्वारा समर्थित था; अनहुई प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउण्डेशन (अनुदान सं. 1408085MH158); अनहुई चिकित्सा विश्वविद्यालय के बकाया युवा अन्वेषक; अनहुई प्रांत के विश्वविद्यालयों में उत्कृष्ट युवा प्रतिभाओं के लिए सहायक कार्यक्रम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HNSCC cells ATCC CRL-3241
Polylysine Thermo Fisher Scientific P4981
Specific siRNA for human CLIC4 Biomics NM_013943 (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent  Thermo Fisher Scientific L3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede Thermo Fisher Scientific R22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) Gibco 11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin Gibco 10099141
Trypsin-EDTA Solution Beyotime C0201
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240062
Laser Scanning Confocal Microscopy Leica Microsystems GmbH LEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope Nikon N/A
Metaflour, V7.5.0.0 Universal Imaging Corporation N/A
Leica application suite, v2.6.0.7266 Leica Microsystems GmbH N/A
Microsoft office Excel 2007 Microsoft N/A
Sigma Plot 12.5 Systat Software N/A
Attofluor Cell Chamber Thermo Fisher Scientific A7816

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३७ Mitochondrial झिल्ली क्षमता rhodamine १२३ फोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप क्लोराइड intracellular चैनल 4 apoptosis सिर और गर्दन स्क्वैमस कार्सिनोमा
CLIC4 पछाड़ना-प्रेरित HN4 सेल Apoptosis <em>इन विट्रो में</em> अध्ययन करने के लिए Mitochondria झिल्ली क्षमता का पता लगाने
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Lu, J., Wu, L., Wang, X., Zhu, J., Du, J., Shen, B. Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro. J. Vis. Exp. (137), e56317, doi:10.3791/56317 (2018).

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