Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para a aplicação de rodamina 123 para identificar o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e estudar CLIC4 induzida por nocaute HN4 celular apoptose em vitro. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, registou-se a mudança em tempo real do MMP.
Abstract
Depleção do potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) é considerada o evento mais antigo em cascata apoptótica. Mesmo ocorre antes do nucleares apoptotic características, incluindo a condensação da cromatina e quebra de DNA. Uma vez que os colapsos MMP, apoptose celular iniciará irreversivelmente. Uma série de corantes catiônicos lipofílicos pode passar através da membrana celular e agregar dentro da matrix da mitocôndria e servir como marcador de fluorescência para avaliar mudança MMP. Como um dos seis membros da família canal intracelular (CLIC), o Cl– CLIC4 participa no processo de apoptose celular, principalmente através da via mitocondrial. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir MMP através de monitoramento a flutuação de fluorescência de rodamina 123 (Rh123), através da qual estudamos a apoptose induzida por nocaute de CLIC4. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal varredura e microscópio de fluorescência normal em detalhe e também compará-lo com outros métodos.
Introduction
Rh123 é um corante catiônico de fluorescência, que serve como um indicador para o potencial transmembrana. Rh123 é capaz de penetrar a membrana celular e inserindo a matriz mitocondrial, dependendo da diferença de potencial dentro e fora da membrana1. Apoptose leva a danos da integridade da membrana mitocondrial. O poro de transição de permeabilidade de mitocôndria (MPTP) abrirá e ao colapso do MMP, que por sua vez, resulta na liberação de Rh123 para fora das mitocôndrias. Finalmente, sinal mais forte fluorescência verde será detectado sob microscópio de fluorescência. Está bem documentado que a depleção do MMP e permeabilidade da membrana elevados são sinais precoces de celular apoptose2. Portanto, o Rh123 pode ser aplicada para a detecção de mudança MMP e a ocorrência de apoptose celular.
Como o 6ª carcinoma mais comum no mundo, câncer de cabeça e pescoço deteriora gravemente saúde3 uma pessoa. Embora muitas abordagens foram desenvolvidas nos últimos anos, resultados clínicos do tratamento para pacientes que sofrem de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é ainda não é o ideal4. Explorar novos métodos terapêuticos pode melhorar o tratamento para HNSCC5. Canais iônicos envolvendo inúmeros processos biológicos exibem um papel importante no desenvolvimento de diferentes tipos de câncer6. Participação parcial ou total dos canais de Cl– são altamente envolvidos em várias propriedades de transformação neoplásica, incluindo migração ativa, alta taxa de proliferação e invasão. Neste contexto, o CLIC, uma família de proteínas romance, foi listado como uma promissora classe de alvos terapêuticos para o tratamento de câncer6,7. Estudos recentes têm revelado que membros da família CLIC, incluindo CLIC1, CLIC4 e CLIC5, localizar a cardíaca mitocondrial e o nível de (ROS) de espécies reativas de oxigênio é upregulated por CLIC5, indicando o papel funcional de mitocondrial-localizado Cl - canais na resposta apoptótica8. CLIC4, um membros da família CLIC (também conhecido como mtCLIC, P64H1 e RS43), tem sido mais extensivamente estudada pelas suas propriedades de regulamento de apoptose em células cancerosas e Localização subcellular incluindo mitocôndria, retículo endoplasmático e Golgi em humanos queratinócitos7,9,10. O perfil de expressão de CLIC4 foi regulamentado pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), P53 e estímulo externo. Superexpressão e downregulation de CLIC4 provocar uma resposta de apoptotic principalmente através da via mitocondrial, acompanhada com o desequilíbrio dos membros da família Bcl-2, ativação da cascata das caspases e liberação de citocromo C11, 12 , 13. portanto, medição de MMP é crucial para explorar a apoptose relacionadas com CLIC4, e Rh123 serve como um indicador de fluorescência ideal.
O presente estudo descreve um protocolo detalhado para a detecção de MMP para estudar CLIC4 induzida por nocaute apoptose nas células HN4. Rh123 é usado como uma sonda de fluorescência para observar a mudança do MMP. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, a flutuação em tempo real do MMP pode ser resolvida. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal microscópio de fluorescência em detalhe e também compará-lo com outros métodos. Este protocolo também pode ser aplicado a outros estudos relacionados ao apoptosis.
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Protocol
1. cultura e transfecção de células
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Cultura celular
Nota: O HN4, uma linha de celular HNSCC, derivou-se de pacientes com HNSCC14.- Células de cultura HN4 em de Dulbecco modificado Eagle suplementado (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL). Incube as células a 37 ° C com 5% de CO2.
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Transfecção celular
- Um dia antes de transfeccao, placa 5 x 105 células em 2 mL/bem do meio de cultura sem antibióticos em placas 6-boas.
- Dilua 100 pmol CLIC4 siRNA ou mexido SiRNA em 250 µ l de mídia soro reduzida, suavemente. Diluir o reagente de lipossoma 5 µ l em 250 µ l de mídia soro reduzida e incubar durante 5 min. Combine o siRNA diluído com o reagente diluído em lipossomas, misture delicadamente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
- Adicione a mistura de bem contendo células e médio. Misture delicadamente agite-a placa de volta-e-vem. Incube as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 para 24 h antes de prosseguir com o seguinte procedimento de rotulagem de Rh123. Substitua o meio meio de crescimento normal 4 h depois do transfection.
2. Rh123 de rotulagem
Nota: O Rh123 foi utilizado para medir a MMP em células de HN41.
- Após o tratamento de siRNA CLIC4 (secção 1), use HN4 células em placas de 6-poços para o tratamento a seguir. A quantidade de células HN4 em cada bem é o suficiente para repetir o experimento 10 vezes em lamelas.
- Use uma pinça para colocar lamelas circulares na parte inferior da novas 12-poços de placas. O número de placas é definido de acordo com o projeto experimental (Figura 1A).
- Coloque 150 µ l de 100 µ g/mL polylysine no meio de cada lamela dentro as placas 12-poços e aguarde 2 min. Preste atenção para não colocar a polylysine fora as lamelas. Em seguida, Retire cuidadosamente o polylysine por pipeta (Figura 1B).
- Remover o meio de cultura das células HN4 dentro do prato e adicionar tripsina de 0,25% 1 mL para desprender as células. Depois de 6 min, adicione 2 mL de meio de cultura para neutralizar a tripsina. Misture suavemente as células HN4 por pipeta para 5 vezes e sementes 2-6 х 104 células em lamelas a circular. Coloque em uma incubadora a 37 ° C com 5% CO2 (Figura 1C).
- Após a incubação de 8 h, Incube as celulas de HN4 com 2 µmol/L Rh123 por 40 min a 37 ° C. Misture suavemente os médios altos e baixos, várias vezes para garantir uma distribuição uniforme de Rh123 no meio (Figura 1D).
- Prepare-se bastante normal fisiológico (NPSS); tornar NPSS (em mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glicose 10 e 5 HEPES, pH 7,4). Pré-aqueça a 37 ° C em banho-maria.
- Use uma pinça para remover as lamelas e lave o restante líquido através de colocação brevemente as lamelas para o buffer NPBS pré-aquecido (Figura 1E).
- Coloque as lamelas na parte inferior da câmara de aço inoxidável de 500 µ l (veja a Tabela de materiais) com um fundo de lamela de vidro 25mm substituível selada no lugar por um-Ring. Corrigi-lo apertando a tampa da câmara (Figura 1E).
- Adicione 450 µ l pré-aquecido tampão NPSS à câmara montada e colocar o banho sob o campo visual do microscópio de fluorescência ou laser confocal microscópio de fluorescência (Figura 1E).
3. detecção do MMP
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Microscópio de fluorescência comum
- Ligue o microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante.
Nota: O microscópio de fluorescência comum foi realizado com uma mercúrio abajur fibra óptica fonte de luz, um filtro FITC definido para Rh123 (filtro de excitação de 480/40, 505 espelho dicroico LP e filtro de emissão 535/40) à temperatura ambiente. Objectivo de X 20 foi usado para executar a imagem latente da viver-pilha. - Abra o software de sistema de imagem e selecione o botão "New" da barra de comando para iniciar uma nova experiência(Figura 2).
- Ajuste o campo visual e foco para encontrar o local das células em luz branca.
- Apague a luz e aperte o botão para fechar a luz branca. Clique no botão da barra de comando "Foco" e selecione "Iniciar com foco" para ligar a fluorescência. Encontrar a localização das células novamente através do microscópio com uma excitação 507 de nm e emissão de passe longo 529 nm comprimento de onda (conjunto antes do experimento). Ajuste o campo visual e foco novamente se necessário (Figura 2B).
- Selecione um campo visual que contém células de HN4 separadas somente 20 a 30. A mudança do sinal de fluorescência intracelular para cada célula será gravada com precisão.
- Uma vez que o campo visual é alcançado, clique em "Concentrar-se perto" da barra de foco. Clique em "Acq One" da barra de comando para adquirir um conjunto de imagens. Clique em "Regiões" da barra de comando e clique no botão "Okey" para editar a regiões de medição.
Nota: Na barra Editar região, formas diferentes de região podem ser usadas dependendo do estudo. - Para caber para diferentes formas de células individuais, selecione a ferramenta "Região de rastreamento" e círculo da região de uma única célula e dê um duplo clique quando terminar. Repita o procedimento até que todas as células estejam dentro de um círculo (Figura 2C). Clique em "Concluído" e selecione "Salvar imagens" para encontrar o local salvo.
- Clique em "Zeroclock"e rapidamente pressione F4 para iniciar o monitoramento da mudança da intensidade de fluorescência. Registo do tempo real mudança de intensidade de fluorescência uma vez a cada 5 s por 5 min (Figura 2D).
- Quando a linha de base torna-se estável, adicionar 50 µ l NPSS misturado com 0,5 µ l de 100 mmol/L ATP à câmara através de pipeta. Lembre-se de não tocar a câmara para evitar a remoção do campo visual(Figura 2).
Nota: A imagem de fluorescência será gravada por 20 min e em seguida o experimento pode acabar através de operação manual. O tempo de duração é rotineiramente resolvido por 20 min para observar toda a mudança de fluorescência. No entanto, operação manual para parar a captura é aplicada quando inesperados fatores influenciam a estabilidade da curva, ou quando o processo todo leva menos de 20 min.
- Ligue o microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante.
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Microscópio de fluorescência digitalização laser confocal
- Ligue o laser confocal microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, abra o software empacotado.
Nota: Aqui, Rh123 estava animado por um laser de argônio em 488 nm e o sinal emitido foi gravado na faixa de 545-700 nm, através da aplicação do filtro TD488/543/633. - Clique em "Objetivo" no menu "Adquirir" para selecionar 63 X / 1.4 N.A. óleo da lente objetiva. Observar a amostra e encontrar um campo visual limpo sob o campo de luz.
- Aperte o botão "TL/IL" alternar para modo de fluorescência e selecione os filtros de fluorescência correto para encontrar o local da célula sob a escuridão através de microscópio. Empurre o "SHUTTER" para proteger a amostra quando for concluída a observação.
- Sob o menu de "Adquirir", ajuste adequado canal de PGTO e clique em "Alcançar" para ativar o caminho óptico estabelecido(Figura 3). Clique no menu "Configuração" e escolha "Laser" para determinar o tipo de laser necessária. "Argônio" é recomendado para este protocolo (Figura 3B).
- Clique em "Live" para obter a imagem em tempo real e certifique-se de que o campo visual contém apenas 20 a 30 células de HN4 separadas. A mudança do sinal de fluorescência intracelular para cada célula será gravada com precisão.
- Selecione "xyt" no modo de aquisição no submenu "Aquisição" no menu "Adquirir" (Figura 3C). Conjunto 5 s e 20 min para o intervalo de tempo e duração, respectivamente. Clique em"Apply" quando todos os parâmetros são resolvidos.
- Sob o menu "Quantify", use a ferramenta de "Desenhar polilinha" para um círculo no local de gravação de cada célula. Selecione "Linha perfil" e escolha "Start" para realizar a observação. Grave a mudança em tempo real da intensidade de fluorescência por 5 min (Figura 3D - E).
- Quando a linha de base torna-se estável, adicionar 50 µ l NPSS misturado com 0,5 µ l de 100 mmol/L ATP à câmara através de pipeta. Lembre-se de não tocar a câmara para evitar a remoção do seu campo visual.
Nota: A imagem de fluorescência será gravada por 20 min e então o experimento é concluído.
- Ligue o laser confocal microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, abra o software empacotado.
4. análise estatística
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Microscópio de fluorescência comum
- Ligue o microscópio de fluorescência, rotineiramente, seguindo o manual do operador. Abra o software de sistema de imagem e selecione o botão "Abrir" da barra de comando para abrir um experimento salvo. Clique em "Regiões" da barra' comando' e clique "Okey" botão para editar as regiões de medição.
- Selecione a ferramenta "Região de rastreamento" e círculo da região de uma única célula e dê um duplo clique quando feito. Repita o procedimento até que todas as células têm sido circuladas. Clique em "Concluído" e selecione o "F4: forward" botão para obter um rastreamento mostrando a intensidade de fluorescência.
- Uma vez terminado, clique no botão de seta para baixo localizado no canto inferior direito do gráfico e clique em "Mostrar dados de gráfico" (Figura 2-F). Clique duas vezes o "Okey" e escolha o botão "Dados de Log" para abrir a interface do software de processamento de dados. Clique novamente em "Dados de Log" e encontrar que os registros de tempo real de flutuação da intensidade de fluorescência aparecem na planilha.
Nota: Para cada célula, alterações no MMP foram exibidas como a razão de fluorescência em relação a intensidade antes da aplicação do ATP ou TG (F1/F0). Cada dados de intensidade de fluorescência foram a média de 20-30 células. Dados para Rh123 são apresentados como média ± SE. resultados dos 2 grupos foram testados pelo teste bicaudal independentes t e P valor < 0,05 foi considerado como significância estatística. Software de análise estatística foi aplicado para realizar as análises estatísticas neste experimento.
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Microscópio de fluorescência digitalização laser confocal
- Ligue o microscópio confocal laser e logar o software empacotado seguindo as instruções do fabricante.
- Selecione "Fogo" para abrir um experimento gravado.
- Selecione a ferramenta "Pilha de perfil" no menu "Quantify", escolha "tudo em um" de "Gráficos de classificação por canais e ROIs."
- Use a ferramenta "Draw polygon" para regiões de célula de círculo para observação.
- Selecione o menu "Graph" e clique no botão direito do mouse e escolha "Exportar para excel" para adicionar os valores de intensidade fluorescente para uma planilha. A seguinte análise é consistente com microscópios de fluorescência normal (Figura 3-F).
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Representative Results
No presente estudo, aplicou-se Rh123 para detectar o MMP. Inicialmente, HN4 as células foram cultivadas por fluorescência seguinte experiências de coloração. Pinça foram usada para colocar lamelas circulares no fundo do poço-6 placas (Figura 1A). As lamelas foram revestidas com polylysine por 5 min... e então o polylysine removido através da pipeta (Figura 1B). Então as células HN4 foram trypsinized e semeadas sobre as lamelas colocadas na parte inferior das placas 6-poços. Em seguida, a quantidade adequada de Rh123 foi adicionada e misturada bem (Figura 1C-D). Após a lavagem com o NPSS pré-aquecido, lamela foi montada na câmara de visualização. A quantidade adequada de NPSS foi adicionada para o experimento seguinte (Figura 1E).
Após o procedimento de coloração Rh123, o microscópio de fluorescência comum e o microscópio confocal foram utilizadas para gravar a fluorescência de Rh123 em tempo real com diferentes passos e software. Para o microscópio de fluorescência comum, foi ativado o software de imagem para criar uma nova experiência. O obturador foi aberto para mostrar a luz de fluorescência verde e o foco e a localização foram ajustados para obter um campo visual apropriado. Depois de tomar uma imagem de célula, as ferramentas de rastreamento de forma foram usadas para desenhar a região de cada célula e em seguida, gravar a alteração de fluorescência. Uma vez que a base tornou-se estável, ATP foi adicionado na câmara para acionar a despolarização da membrana mitocondrial. No experimento de laser confocal microscópio de fluorescência, o pacote de software foi aberto e um caminho óptico adequado foi definido. Depois que a fonte de luz de argônio foi escolhida, nós ajustamos o foco e a posição da câmara para obter uma imagem clara das formas na tela do celular. O modo de varredura "xyt" foi seleccionado e a ferramenta "Draw polygon" aplicou-se para a região de celular para gravar a alteração de fluorescência em cada célula do círculo. Para analisar os dados brutos, F0 foi o valor da intensidade de fluorescência, antes da aplicação do ATP e F1 foi o valor máximo da intensidade de fluorescência após a aplicação de ATP. F1/F0 foi usado para avaliar a despolarização da membrana mitocondrial (Figura 2 e Figura 3). Da Figura 4B e Figura 5B, os níveis de intensidade fluorescente eram elevados após o tratamento de ATP e diminuição de volta para a linha de base após aproximadamente 10 min. 4 figuraC e Figura 5C demonstram claramente que o pico de intensidade da fluorescência das Rh123 foi maior no grupo sob o tratamento de siRNA CLIC4 do que no grupo controle. Figura 4 A e Figura 5A mostrar imagens representativas da mudança fluorescente em cada estágio. Comparado com o microscópio de fluorescência comum, o microscópio confocal obtidos uma maior qualidade de imagem, mostrando as mitocôndrias e núcleo celular. No entanto, ao comparar os dados dos dois métodos, sem diferenças significativas foram encontradas. Resultados de fluorescência e confocal microscópio demonstraram esse nocaute de despolarização de membrana mitocondrial induzida por ATP CLIC4 reforçada nas células HN4 (Figura 4 e Figura 5).
Figura 1 . Rotulagem Rh123. (A) pinças foram usadas para colocar lamelas circulares na parte inferior das placas 6-poços. (B) revestimento lamelas com polylysine através de pipeta para 5 min e finalmente sucção para pipeta para remover o polylysine. (C) HN4 células foram semeadas nas lamelas na parte inferior das placas 6-poços. (D) adição de uma quantidade adequada de Rh123 e misturando bem. (E) lavar as lamelas com NPP pré-aquecido e montagem da câmara com uma quantidade adequada de NPSS para o experimento seguinte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Passos para monitorar em tempo real flutuação de fluorescência Rh123 por microscópio de fluorescência comum. (A) abrir uma nova experiência. (B) começar a se concentrar e escolher um campo visual adequado sob fluorescência. (C) usando as "regiões" ferramenta da barra de comando para editar as regiões de observação. (D) clique em "Zero relógio" e rapidamente pressione F4 para iniciar o monitoramento da mudança da intensidade de fluorescência. (E) adição de ATP (100 µmol/L) para acionar a despolarização da membrana mitocondrial após a linha de base torna-se estável. (F) quando o experimento estiver concluído, clique na seta para baixo localizada no canto inferior direito do gráfico para exportar dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Passos para monitorar em tempo real flutuação de fluorescência Rh123 pelo laser confocal microscópio de fluorescência. (A) Seleccione o canal de PGTO e definir um intervalo de comprimento de onda adequado sob o menu de "Adquirir". (B) Selecione o tipo correto do laser do laser disponível"atual" e defina o seu poder. (C) escolher o "xyt" modo de observar e definir uma série de parâmetros de gravação. (D) escolher as ferramentas "Perfil de pilha" e "All in One" de "Gráficos de classificação por canais e ROIs." (E) uso o ferramenta "Draw polígono" ao círculo da região de célula para os dados em tempo real. (F) os valores de intensidade fluorescente de exportação de software de processamento de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Efeito de CLIC4 nocaute na despolarização da membrana mitocondrial induzida por ATP resolvido pelo microscópio de fluorescência comum nas células HN4. (A) de imagens representativas de flutuação de fluorescência para Rh123... traços representativos (B) e dados resumidos (C) mostrando ATP (100 µmol/L)-induzida por alterações na célula HN4 MMP. A mudança no potencial de membrana foi indicada pelo quociente da intensidade da fluorescência antes e após a aplicação do ATP. O aumento da proporção representa a despolarização de potenciais de membrana. As células de HN4 foram transfectadas com CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) ou mexido siRNA (Con siRNA). Os valores são mostrados como a média ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs grupo controle (Con siRNA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Efeito de CLIC4 nocaute na despolarização da membrana mitocondrial induzida por ATP resolvido por laser confocal microscópio de fluorescência em células de HN4. (A) de imagens representativas de flutuação de fluorescência para Rh123... traços representativos (B) e dados resumidos (C) mostrando ATP (100 µmol/L)-induzida por alterações na célula HN4 MMP. A mudança no potencial de membrana foi indicada pela relação entre a densidade de fluorescência antes e após a aplicação do ATP. O aumento da proporção representa a despolarização de potenciais de membrana. As células de HN4 foram transfectadas com CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) ou mexidos siRNA (Con siRNA). Os valores são mostrados como a média ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs grupo controle (Con siRNA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Está bem documentado que o Cl− canais são essenciais na manutenção da hemostasia do ambiente interno e desempenham um papel importante na proliferação celular e apoptose15,16. Portanto, compreender a relação entre a intervenção orientada para o canal de íon e apoptose é de grande necessidade e importância de encontrar uma melhor abordagem terapêutica para vários cânceres17. As mitocôndrias mantenham estado biológico normal de uma célula e sua função altamente refere-se à sua permeabilidade da membrana e o potencial transmembrana. Além de câncer, acumula neuropatológicas investigações têm documentado que anormalidades mitocondriais contribuam para miopatia, doença cardiovascular e sintomas neurológicos, incluindo a surdez neurossensorial, ataxia cerebelar, demência e epilepsia18,19. Todos estes têm estimulado a pesquisa em intervenção mitocondrial-alvo com o qual deseja amenizar o tratamento clínico. Rh123, um corante de fluorescência mitocôndria-alvo, podem penetrar a membrana celular e serve como uma sonda universal de fluorescência para detectar MMP. No estado precoce de apoptose celular, abertura do MPTP eleva a permeabilidade de membrana mitocondrial permitindo Rh123 ser lançado fora da mitocôndria e finalmente o sinal mais forte fluorescência verde pode ser detectado. Sob esta situação, íons bilaterais distribuem livremente e originar a queda rápida das MMP causando dissociação da cadeia de transporte de elétrons e diminuição da produção de ATP, que afeta severamente o fornecimento de energia normal de células. Além disso, a abertura do MPTP aciona o efluxo de compostos bioativos de pro-apoptotic incluindo Cyt C, apoptose, induzindo o fator apoptótico protease ativando factor-1 e ROS e finalmente leva a apoptose irreversível20,21 .
ATP pode induzir despolarização da membrana mitocondrial, como demonstrado por fluorescência elevada de Rh123. Comparando a despolarização da membrana mitocondrial induzida por ATP das células sob diferentes tratamentos, é possível decifrar a função biológica da mudança de mitocôndrias e o grau e o estado de apoptose22. Tanto o microscópio de fluorescência comum e laser confocal microscópio de fluorescência podem alcançar um monitoramento em tempo real de MMP através de gravação a flutuação da intensidade de fluorescência da Rh123, mas vantagens e deficiências de ambos os métodos precisam ser considera-se. Comparado com o microscópio de fluorescência comum, as imagens capturadas por laser confocal microscópio de fluorescência tem maior resolução e qualidade. Portanto, podem ser visualizados mais detalhes subcellular. Além disso, diminui os impactos da Cruz-palestra luz quando são utilizados vários corantes de fluorescência. Daí, o microscópio confocal precisamente pode gravar a flutuação de fluorescência em tempo real de Rh123 e refletem a bioatividade celular real. No entanto, nossos métodos para monitorar MMP precisam gravar continuamente por um longo tempo relativo e uma série de citotoxinas, incluindo o único oxigênio e ROS, pode ser produzida sob a radiação laser, levando a danos de nível23. Além disso, a intensidade do laser de alta geralmente provoca desvanecimento de fluorescência corantes durante a varredura contínua24. Por outro lado, o microscópio de fluorescência comum não pode tirar fotos com alta qualidade, como o microscópio confocal, mas não tem os efeitos adversos acima mencionados e, portanto, possibilita a gravação de longo tempo. Comparando nossos dados do microscópio de fluorescência comum e microscópio confocal, nenhuma diferença óbvia pode ser encontrada, que indica que o microscópio de fluorescência comum é competente o suficiente para o monitoramento da flutuação do MMP, bem como análise de dados mais conveniente e econômica. HN4 células foram semeadas em lamelas antes do experimento. Embora polylysine é aplicado para aumentar o celular acessório, uma pequena fração das células ainda retirado as lamelas e áspera operação leva para o comprometimento da viabilidade celular. Além disso, adicionando Rh123 ou ATP na câmara, deve ter cuidado para não tocar a câmara e as lamelas.
Além de Rh123, DioC6, JC-1 e tetrametil rodamina metil éster (TMRM) são corantes de fluorescência que podem ser usados para detectar o MMP. Em vez de gravação em tempo real através do microscópio, citometria de fluxo também pode realizar essa tarefa. No entanto, a mudança em tempo real da intensidade da fluorescência de gravação com o microscópio é mais adequado para descobrir a bioatividade celular e gerar imagens intuicionista, dando resultados mais confiáveis.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gentilmente agradecemos Sr. Chao Fang para cultura de células. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação ciência Natural da China (Grant no. 81570403, 81371284); Fundação de Anhui Provincial de ciências naturais (Grant No. 1408085MH158); Excelente jovem investigador da universidade médica de Anhui; Programa de apoio para excelentes jovens talentos nas universidades da província de Anhui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
