Summary
כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר הוא מכשיר ממודר שנועדה אוריינט לרסן את הזחלים דג זברה. העיצוב מאפשרת חיתוך זנב ארוך טווח אוסף של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של ריפוי הפצע והתחדשות.
Abstract
הזחל דג זברה היא אורגניזם מודל חשוב ביולוגיה התפתחותית וגם ריפוי הפצע. עוד יותר, הזחל דג זברה היא מערכת חיה דימות ברזולוציה מיקרוסקופיים התופעות ביולוגית דינאמית במרחב ובזמן עם רזולוציה הסלולר יקר. עם זאת, השיטה המסורתית של כימוס agarose עבור הדמיה חיה לטרפד פיתוח זחל, רקמות לצמיחה מחודשת. לכן, כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר היה מיועד, מפוברק כהתקן פונקציונלית ממודר כדי להציב את הזחלים של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בזמן המתיר סנפיר סימטרית חיתוך בתוך המכשיר, הזנב ערככם עוקבות התפתחות וצמיחה re. התקן זה מאפשר ופצעו והדמיה לטווח ארוך תוך שמירה על יכולת הקיום. בהתחשב בכך כייר zWEDGI הוא 3D מודפס, ביכולת ההתאמה האישית של גיאומטריות שלה לעשות את זה בקלות שונה עבור יישומי הדמיה דג זברה מגוונות. יתר על כן, zWEDGI מציע שיתרונות רבים, כגון גישה הזחל במהלך ניסויים עבור ופצעו או היישום של ריאגנטים, הוקרב הכיוון של הזחלים מרובים עבור הדמיה יעיל, שימושית של המכשיר.
Introduction
יכולת ההתחדשות של דג זברה הזחלים רזבורה rerio להפוך אותם אורגניזם מודל אידיאלי בחינת הפצע התגובה, כמו גם לריפוי, לצמיחה מחודשת1,2,3,4. גישה למערך של דג זברה מהונדס קווים ושקיפות של דג זברה אנטומיים נוספים לשפר את השירות שלהם ללימודי אין ויוו של הפצע התגובה לאירועים, כמו גם לתהליכי הרגנרציה וקהילותיהם4. חקר תהליכים ביולוגיים אלה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה זריחה זמן לשגות ולכן תובע חיה הדמיה דג זברה התקן המאפשר תנועה מינימלית של הזחל דג זברה והיציבות גבוהה תוך שמירה על יכולת הקיום. . זה המפתח כי המכשיר מאפשר ופצעו יעיל בעת ריפוי, התחדשות להתרחש לא מושפע על ידי המכשיר
חיה הדמיה מייצב השיטה הרגילה הטבעה הזחל ב- agarose במהלך דימות בשידור חי מגבילה את הצמיחה, פצע התחדשות5 , עשוי להגדיל את שיעורי התמותה מאז מתחילים הזחלים להראות סימן לב לב מתח, רקמת נמק אחרי 4 שעות4. לכן, הסרת agarose מאזורים עניין לעתים קרובות יש צורך לאפשר להתפתחות התקינה, התחדשות6, לחשוף את הזחלים נזק פוטנציאלי כמו agarose זה לחתוך. יתר על כן, עם agarose טכניקת הטבעה, המשתמש חייב אוריינט הזחלים בזמן הקצר לפני agarose עפור5,6,7. במהירות מניפולציה הזחל לא רק דורש מיומנות של המשתמש, גם סיכון לפגיעה הזחל. למרות שיטות לייצב את הזחל עבור הדמיה חיה תוארו לעקוף חסרונות אלה, כמו אגר מחורץ בארות3 או divets8, שימוש סיליקון בוואקום משמנים ליצירת תא הדמיה עם צנרת PVC או אחרים חומרים6וסבב אבובים9, מרבית השיטות האלה הם עבודה אינטנסיבית, מבולגן, לעיתים קרובות ללא הניתן וגם לא מאפשרים מניפולציות סביבתיות (תרופות טיפולים, ופצעו וכו.) אחרי הדגים יש לטעון.
לכן, המכשיר zWEDGI (איור 1) תוכנן כדי להתגבר על חלק החסרונות של אגר הרכבה עבור הדמיה חיים לטווח ארוך של דג זברה הזחלים בזמן המתיר מניפולציה של הדגימה. ZWEDGI מורכב שלוש פתוח למחצה ממודר צ'יימברס (איור 1 א') כדי לאפשר טעינה, איפוק, ופצעו, הדמיה של 2-4 ימים לאחר ההפריה דג זברה הזחלים. המכשיר מפוברק מן Polydimethylsiloxane (PDMS), להציב על גבי בתגית כיסוי זכוכית 60 מ מ בתחתית צלחתי הדמיה. העיצוב המובאת כאן נועד ללימודי ריפוי הפצע, אולם השימוש העיצוב המודולרי וטכנולוגיות ייצור רגיל לעשות עיצוב zWEDGI לשינוי, נוטה מגוון פרוצדורות ניסיוני, במיוחד עבור שגרות זה מחייבים ריסון מינימלי עם מניפולציה ניסויית והדמיה לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: העיצוב zWEDGI הבסיס גובשה עבור הזחלים דג זברה 2-4 ימים לאחר ההפריה (dpf), עקוב אחר ההנחיות של מרכז המשאבים חיות מחקר באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.
1. הדפסת תלת-ממד של תבניות ועיצוב
- מודל PDMS רכיב של המכשיר עם הרצוי גיאומטריות ותכונות ב- 3D מידול תוכנה 5. ליצור הרכבה של תבנית ריקה ואת החלק PDMS וליצור תבנית שלילי עבור החלק PDMS על-ידי יצירת חלל ב כייר המתאים לחלק PDSM. לשמור את התבנית כקובץ .stl עבור הדפסת תלת-ממד ( איור 2, שלב 1.1).
הערה: קובץ בתבנית (.stl) stereolithography של עיצוב כייר המובאת כאן ( איור 1) זמין להורדה בכתובת https://morgridge.org/designs/.
תבניות - הדפסה באמצעות מדפסת תלת-ממד photopolymer ( איור 2, שלב 1.2). להכין תבניות מרובות בהדפסה אחת, אם אפשר, אז יותר מהתקן אחד שאפשר לעצב עם אצווה בודדת של PDMS.
הערה: הדוגמה המוצג הודפס במצב hi-res עם 0.075 ק מ מ קרן קוטר ו 0.05 מ"מ שכבת עובי, באמצעות שרף photopolymer 5.- בתבניות נקי בעזרת מברשת בסדר, אלכוהול מפוגל בקבוק ספריי, ולאחר באוויר דחוס כדי לשפשף בעדינות ולהסיר שרף משומרים. להסיר כל חומר מן האזורים microchannel.
- פוסט-לרפא את תבניות מנגנון התרופה פוסט UV עבור 60 דקות בכל צד כפי היכנע משומרים רעיל דג זברה הזחלים 10.
- חול לצד חלל התבנית עם נייר זכוכית 200 חצץ על משטח שטוח עד כל המשטחים איטום נמצאים נייר זכוכית (טעינת ערוץ גיאומטריות וההיקף עובש). בקלילות חול בנייר חצץ חול 400, 600, בהדרגה, כדי לייצר משטחים חלקים סומק על פני כל facings גיאומטריה ( איור 2, שלב 1.3). למדוד את העומק של החלל לאחר מלטש עם מחוון חיוג כדי לוודא כי זה קרוב העומק מעוצב.
- לנקות תבניות ולכסות דיסקים (בקוטר סנטימטר ¾ 1 x ¼ אינץ זכוכית בורוסיליקט עבה או אקריליק; כוס אחת לכסות לכל עובש) על-ידי הצבת קולי מלא מנקה במים למשך 30 דקות או על ידי שטיפה תחת מים זורמים.
- למצוץ יבש עם אוויר דחוס לנקות את שתי התבניות, מכסה עם אלכוהול איזופרופיל ואוויר דחוס מסוננים. השתמש ספסל נקי כמקום כדי לפברק את ההתקנים כדי למזער את הזיהום מפני פסולת באוויר. עזוב תבניות נקי ואת זכוכית מכסה הספסל נקי או מכוסה פטרי עד שהוא נדרש.
2. PDMS ייצור של מכשיר zWEDGI
- להפוך PDMS על ידי שפיכת 184 סיליקון elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) ביחס של 5:1 (בסיס activator) לתוך כוס פלסטיק. מערבבים היטב למשך 2 דקות עם מקל מעץ קרפט, תוך ערבוב את הג'ל על עצמה, כמו לישה לחם. לשימוש בתבניות 5, 10 גרם של בסיס ו- g 2 של מפעיל.
- דה-גז תערובת ב desiccator ואקום למשך 25-45 דקות עד כל הבועות נעלמו.
- למלא את חלל הבטן של כל התבניות מודפס 3D עם-0.75 מ ל PDMS בעזרת מזרק 10 מ"ל עד העובש מעט מלאה מניסקוס ( איור 2, שלב 2.1).
- דה-גז התבניות מלא למשך 45 דקות להסיר בועות נוספות שאולי נוצר בעת מילוי.
- להחיל דיסק כיסוי זכוכית מעל כייר מלא PDMS, לוחץ את הדיסק בזווית כדי למנוע בועות מלהיות לכוד ( איור 2, שלב 2.2). לאפשר PDMS עודף להיות מגורש כפי בעטיפת הדיסק זכוכית מוחל.
- שימוש קלאמפ רעשן קטן להחזיק את הדיסק כיסוי בחוזקה על העובש.
הערה: זה יוצר משטח שטוח, ברגע PDMS נרפאה ומייצרת דרך חורים איפה גיאומטריות מודפס 3D מיושר עם תגית כיסוי זכוכית. לחלופין, כדי להגדיל את מספר התקנים יכולים להירפא בבת אחת, לבנות מכשיר מהדק מרובה (למשל. איור 2, שלב 2.3). - לרפא את המתקן PDMS התבניות בחוזקה-100 o C בתנור למשך 90 דקות ( איור 2, שלב 2.4). מוציאים את התבניות מהתנור, להתקרר עד שהם ניתן לטפל בקלות. אם ההתקן clamping מתכת, להסיר את מכלול דיסק עובש ולכסות המלחציים כדי למנוע ממשיכים לרפא את PDMS עקב חום שיורי המתכת.
הערה: המכשיר היא הקלה ביותר להסרת העובש ואילו עדיין מעט חם לא נרפא לחלוטין. עם זאת, לאחר העובש יוסר מן התנור, התקליטור כיסוי יוסר, המכשיר יכול לשבת כמה ימים לפני שימשיך demolding. אם המכשיר הוא demolded זמן קצר לאחר הסרת מהתנור ריפוי, להניחו בצלחת פטרי מכוסה כדי למזער מזהמים בעוד הוא מאפשר לרפא לחלוטין.
3. פלזמה-מליטה zWEDGI על צלחת זכוכית
- מהדק התבנית המכילה את המכשיר PDMS בתוך מלחציים ספסל כך העובש ' s גיאומטריות פונים למעלה, במקביל לספסל תחנת עבודה.
- התחלה כדי להסיר את ההתקן PDMS על ידי שחרור הכרטיסיה למשוך PDMS של העובש באמצעות פינצטה שקצהו שטוח. העבודה בהיקף של העובש עם הפינצטה (כמו הסרת עוגה מתוך מחבת ( איור 2, שלב 3.1)).
- שימוש סינון אוויר דחוס, פינצטה להוציא בעדינות את המכשיר מחוץ העובש על ידי מחזיק לשונית משיכה ונשף אוויר תחת המכשיר. לעבוד לאט, ומאפשר באוויר כדי לעזור נפרד PDMS של כייר, לוקח טיפול מיוחד עם קצות הפינצטה סביב הסעיפים המנהרה דק.
- המקום את המכשיר PDMS במהופך על החלק הפנימי של השער של תבשיל bottomed זכוכית כך הפרוסות המנהרה הרחקה נוגעות הפלסטיק ( איור 2, שלב 3.2).
- למקם את השער צלחת עם הפוך zWEDGI, המנה המתאימה של bottomed זכוכית פלזמה מנקה עם הזכוכית הפנימית פונה כלפי מעלה ( איור 2, שלב 3.3).
- לפנות פלזמה ניקוי החדר עד הלחץ מגיע 500 mTorr. צריכת חשמל גבוהה
- סט בתדר רדיו (RF). לחשוף את המכשיר ואת המנה לתדר RF עבור 2 דק לאט לחץ האוויר התא ולחזור המכשיר ואת המנה ברדס חדר נקי.
- להסיר את ההתקן PDMS כיסוי המנה. נהפוך את zWEDGI PDMS לכיוון הנכון על הזכוכית על-ידי הצבת אותם בזהירות על המרכז טוב של המנה התחתון זכוכית ( איור 2, שלב 3.4)
- שימוש בקצה האחורי של הפינצטה, בקלילות לחץ כלפי מטה PDMS התקן כדי להבטיח בועות אוויר לא לכוד מתחת. הפעילו לחץ סביב גיאומטריות דקה הערוצים מיקרו, להחליק את PDMS את הקצוות ( איור 5C).
הערה: קשר מלא בין PDMS את הזכוכית מבטיחה הדבקות טובה יותר מפלזמה מליטה. המכשיר zWEDGI ניתן פלזמה בונדד על גבי תבניות צלחת זכוכית עם תחתית אחרות, כגון זכוכית עם תחתית 6-ובכן plate ( איור 2C). - מיקום כיסוי מעל המנה התקן לפני הסרת מהשכונה חדר נקי.
הערה: לאחר המכשירים תוקנו לזכוכית, הפרוטוקול ניתן להשהות עד שיהיו מוכנים לשימוש.
- שימוש בקצה האחורי של הפינצטה, בקלילות לחץ כלפי מטה PDMS התקן כדי להבטיח בועות אוויר לא לכוד מתחת. הפעילו לחץ סביב גיאומטריות דקה הערוצים מיקרו, להחליק את PDMS את הקצוות ( איור 5C).
4. ערוץ הכנה וזחלים טעינת
הערה: גידול כללי דג זברה נערך לכל דג זברה הספר, זמין באינטרנט ב- http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. דג זברה למבוגרים, העוברים היו נשמרים כפי שתואר לעיל 1. המתח פראי סוג AB שימש. בצע את המוסד ’ s פרוטוקול טיפול בעלי חיים עבור הפרטים המדויקים בנוגע לדרישות הדמיה הזחלים בשידור חי-
- יש לשטוף הערוצים עם מינימום של אתנול 70% 100 µL לכל ערוץ, באמצעות micropipette לשטוף דרך הרחקה מנהרה. הסר אתנול ולשטוף 2 או 3 פעמים עם מים מזוקקים כפול. לאפשר לאוויר יבש.
- למלא את הערוצים עם חלב רזה (בריכוז 1% מדולל במים) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי למזער את הדבקות של הזחלים coverslip זכוכית של המנה. ואז, בעדינות להטביע את המכשיר מספר פעמים ב זוגי מים מזוקקים לשטוף. לאפשר לאוויר יבש הפוך.
הערה: פרוטוקול אפשר לעצור כאן. זו הכנה של המכשיר zWEDGI ניתן לעשות מספר ימים לפני השימוש. החנות מכוסה בטמפרטורת החדר. - הכן 1% ההיתוך לנקודת השפל (LMP) agarose על ידי שילוב 100 µL 2% נמס LMP agarose עם 100 µL 2 x Tricaine (0.4 מ"ג/מ"ל Tricaine - אתיל 3-aminobenzoate) ב- E3 מאגר 11 מראש התחמם עד 38 o C. לשמור על 1% agarose/tricaine פתרון 38 o C בתוך גוש חם כדי למנוע ג'לי.
הערה: מיקרוסקופ multiphoton 11, להשתמש או דג זברה פיגמנט משולחים שאינם משתנים (כגון קספר 12) או לשמור על הזחלים ב- E3 המכיל 0.2 מ מ N-phenylthiourea כדי למנוע היווצרות פיגמנט 11 למינימום קליטת ליד אורכי הגל האינפרא-אדום על-ידי הפיגמנט.
התראה: N-phenylthiourea הוא רעיל. בצע את המוסד ' s כללים עבור סילוק.
הזחלים - Anesthetize ב E3 מאגר המכיל 0.2 מ"ג/מ"ל tricaine (Tricaine/E3) 11. המתן עד הזחלים הם ללא תנועה לא מגיב לגירוי מגע.
- רטוב מראש את הערוצים עם כמה microliters של Tricaine/E3.
- לבחור את זחל בודד באמצעות טיפ פיפטה דיזה רחב. להפקיד את הזחלים לתוך התעלה טעינה ( איור 3 א). באמצעות פיפטה עצה או כלי דומה, אוריינט הזחל בבית הבליעה הטעינה כך הצד הגבי פונה קצה ישר לתא הטעינה ואת פניהן הזנב לכיוון המנהרה הרחקה ( איור 3B).
- לסגת בקפידה נוזל מן החדר wounding, המאפשר הזחל לזרום לתוך המנהרה הרחקה ( איור 3C). הסר את רוב הנוזל תוך שמירה על לחות סביב הזחל ( דמות תלת-ממד). תהליך זה יכול להיות בסיוע הטיית המנה מעט לכיוון תא wounding.
- מקום 1% LMP agarose Tricaine/E3 (~ 38 o C) מעל הזחל ' זה הראש, מילוי החדר טעינה ( איור 3E). לאפשר agarose לגבש עם הזחל במצב תקין. להוסיף Tricaine/E3 תא wounding לפי הצורך כדי לשמור על לחות. חזור על פעולה זו טוען תהליך ביתר הערוצים 2.
- באמצעות מחט מזרק, הסר בזהירות את כל agarose אשר מחלחלים דרך המנהרה הרחקה אל החדר wounding ( איור 3F). הוסף tricaine נוספים/E3 אחד קצת יותר agarose (עבור ופצעו, הדמיה לטווח קצר, או פצע הטיפול בידוד) או כדי למלא את הצלחת תרבות (עבור הדמיה לטווח ארוך). החלף את המכסה מאכל תרבות כדי למנוע התאיידות. הזחלים ניתן עם תמונה בנקודה זו (unwounded) או פצועים.
5. הזחלים ופצעו, הדמיה
- באמצעות להב האזמל סטרילי, transect סנפיר הזנב האחורי מיתר הגב 11 בבית הבליעה wounding ( איור 3 G, H). להוסיף tricaine נוספים/E3 במידת הצורך ולהחליף את המכסה מאכל תרבות.
הערה: לחלופין, בהתאם של חלון הזמן התפתחותית של עניין, הזחלים יכולים להיות פצועים, מותר להתאושש ב E3 ומתוחזק בתוך אינקובטור (28.5 o C) עד למועד ההדמיה הרצויה, באיזה שלב הם ניתן לטעון לתוך ערוצים כמו המתואר לעיל-
הוספה - להתקין ההתקן zWEDGI עם ומורדמת הזחלים על גבי מיקרוסקופ הפוכה בשלב אשר יוכל להכיל את הצלחת התחתונה של זכוכית 60 מ מ. אתר את הזנב של הזחל בתעלה העליונה ביותר, סיבוב המנה לפי הצורך כדי לקבל את הזנב במיקום הרצוי. תמונה כנדרש לניסוי מסוים.
הערה: zWEDGI ישימה בהרחבה על מיקרוסקופ אור ברזולוציה גבוהה, כולל widefield פלורסצנטיות, סריקת מיקרוסקופ לייזר. ישנם מספר שיקולים פרמטר הדמיה הזחלים דג זברה, אך ספציפיות הדמיה הפרמטרים הם כלי, דוגמת הניסוי תלויות. כאן, זחל זנב היה עם תמונה של מבנה מותאם אישית מיקרוסקופ multiphoton 5 , 11 ניצול הפרמטרים הבאים: 40 X זמן עבודה מרחק מים טבילה אובייקטיבי, עירור 890 ננומטר לייזר, 445/20 ננומטר מסנן פליטה והרזולוציה 512 x 512.
6. סוף הניסוי
- להסיר המנה zWEDGI של מיקרוסקופ. המתת חסד הזחלים על-ידי הצבת את zWEDGI או על אמבט מים קרים או בבית 4 o C למשך 20 דקות לפחות, ולגשת להיעדרות של פעימות הלב ומחזור הדם.
הערה: מכיוון הזחלים נשמרים בתאים נפרדים, הזחלים ניתן בנפרד לשחזר בעדינות על ידי משיכה של אגר עם מלקחיים או פיפטה. ניתן להסיר את אגר אזור הראש, הזחל המשמש הליכים נוספים, כגון קיבוע של נוגדן מכתים או מעובד לחילוץ RNA או החלבון. - בעקבות ההסרה של הזחלים, אגר, לנקות את zWEDGI עם אתנול, מים מזוקקים, כפי שמתואר בשלב 4.1 והגדר הפוך אוויר יבש. החנות מכוסה במקום קריר, יבש. מעיל מחדש עם חלב רזה (שלב 4.2) כנדרש לפני השימוש הבא.
הערה: zWEDGIs יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים, עד PDMS מתחילה לגמור הזכוכית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS microfluidic המכשיר הוא מכשיר באופן פונקציונלי ממודר נועד להכיל ארבע פונקציות עיקריות (המפורטות להלן) המשויך הדמיה חיה של פין סימטרית ופצעו לריפוי, לצמיחה מחודשת של הזחלים דג זברה. PDMS נבחרה עבור ייצור zWEDGI כי זה לא רק זמינים, של תעשיית תקני עבור הביו, אלא גם עובד גם בתבניות. בנוסף, PDMS הופכת את המכשיר לשימוש חוזר הריק של קצוות קשים או חדים ברגע המכשיר נוצרת. ZWEDGI היתרי במיוחד 1) ההעמסה של הזחלים לתוך המכשיר, 2) הריסון על הכיוון הנכון עבור הדמיה, 3) ופצע של פין סימטרית, וכן הדמיה 4) מיקרוסקופית, תיאר בפירוט בהמשך.
טעינה
עיצוב zWEDGI מורכב 3 ערוצים, אחד שנועדו לרסן את זחל אחד (איור 1B). האוריינטציה טעינת ו הראשונית של הזחל, תא פתוח ההעמסה הוא 3 מ מ רחב (איור 1 א') כדי להתאים טיפ פיפטה דיזה גדול עבור הפקדת זחל (איור 3 א). עוד יותר, האורך והרוחב מספקים מספיק מקום כדי לאפשר מניפולציה עוקבות של הזחל לתוך לכיוון הנכון, עם הזנב לכיוון המנהרה הרחקה ואת הצד הגבי לכיוון החלק העליון (איור 3B).
איפוק
ברגע הזחל היה לטעון לתוך התעלה, שניתן יהיה הזנב-הראשון נמשך לתוך המנהרה מרסנת על ידי הסרה של נוזל מן החדר wounding או להסיט בעדינות למקום עם פיפטה עצה או כלי דומה (איור 3C). הגיאומטריה בצורת משפך לשכת טעינה (איור 1 א'), מ- 3 מ מ עד 0.45 מ מ, מנחה הזחל לתוך כיוון הדפסה לרוחב הרצוי (איור 3C). הכיוון של הזחל על צידה ומרסן את הזנב במקביל עם רצפת הזכוכית של המנה עבור שיפור הדמיה. בניגוד microfluidic ההתקנים שנעשו באמצעות סיליקון, גיאומטריות התבניות מודפס 3D לא צריך להיות עקבי בכיוון-z. לכן, המנהרה הרחקה מכוסה, צמצום ב ציר z כך גובה הפוסט הוא גדול יותר מאשר היציאה, 0.5 מ מ 0.3 מ מ גובה (איור 1B, מבט איזומטרי של tunnel). זו מתחדדת מקלה על הדרכתו של הזחל ושיטוח של הזנב לכיוון הזכוכית המכסה הדמיה לפני השטח. פונקציונליות זו מבטלת את הצורך של המשתמש להציב את הדגימה, בעוד agarose הוא התקשות.
נוזל יוסר מן החדר טעינה (איור 3D) ולא מוחלף agarose נקודת התכה נמוכה כדי לייצב את הראש בתוך הערוץ בזמן הזנב נשמר ערככם ב מאגר בתא wounding (איור 3E). בקלות ניתן להסיר את agarose מינימלי זה עלול לדלוף דרך המנהרה הרחקה מן החדר wounding (איור 3F). חוסר agarose בבית הבליעה wounding מאפשרת לצמיחה מחודשת ערככם ופיתוח של פין סימטרית5.
ופצעו
ברגע הזחל כבר טעון דרך המנהרה בראש מרוסן על-ידי agarose, הפרק סימטרית הינו זמין עבור חיתוך כי זה מבליטה אל החדר wounding. תא wounding חצי עיגול מוסט 1.9 מ מ סימטריות אופקי. זה מאפשר את הלהב האזמל שיוכנס מעל סנפיר סימטרית, מאפשרים די שטח עבור הלהב נמשך כלפי מטה על פני הזנב, transecting את הנוסח סימטרית (איור 3G). החלק הרחב ביותר של 7 מ מ בקוטר חצי המעגל מתרחשת איפה הזנב פצוע כדי להכיל תנועה זו. בנוסף המאפשר למשתמש פצע הזחל, עיצוב ממודר זה מספק את ההזדמנות כדי באזור הזנב5אזורי שהיישום של תרכובות. תכונה ייחודית זו של בידוד למחצה תאפשר בדיקה המותאמות לשפות אחרות של ההשפעות של תרופות שונות, חומרים כימיים או ביולוגיים על תהליך ריפוי הפצע.
הדמיה
המטרה של המכשיר zWEDGI הוא לאפשר רזולוציה גבוהה בהיר הדמיה מיקרוסקופיה של סנפיר סימטרית דג זברה, אינו מופרע על-ידי הטבעת agarose. מסיבה זו, ההתקן PDMS מודבקת על צלחת התחתון זכוכית זמינים מסחרית, כדי לספק את השטח איכות אופטית של מיקרוסקופ באמצעות עדשות נה גבוהה. כאן אנו מציגים תמונות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton עבור השני-הרמוני (SHG) הדמיה של סיבי קולגן בהסנפיר סימטרית כדי להדגים את יכולות הדמיה של zWEDGI. עם זאת, zWEDGI ניתן ליישם שיטות אחרות של מיקרוסקופ אור, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניצול תצורת הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. עם zWEDGI, בניגוד לשיטת agarose הטבעה עם הסרת עוקבות, סנפיר סימטרית יכולה בקלות לדימות במכשיר לפני ופצעו (איור 4A), פצוע בתוך המכשיר, ואז חזר מיד המיקרוסקופ על הפצע שלאחר הדמיה (איור 4B-E). עבודה קודמת לזהות שינויים בארגון סיבי קולגן במהלך תהליך ריפוי הפצע באמצעות SHG. 13 SHG יכול לשמש כדי לזהות סוגים מסוימים של מבנים מסודרות, ובהם קולגן fibrillar, ללא השימוש בתוויות אקסוגני. 14 תמונה איכות הסנפירים סימטרית חי עם תמונה ב- zWEDGI היה דומה לזה שהושג רקמות קבועה5 , אבל את zWEDGI מספקת מספר יתרונות. והכי חשוב, סנפיר סימטרית לריפוי, לצמיחה מחודשת תוכל להמשיך ללא מאת agarose הטמעה בעזרת דומה לזה של הזחלים גדל ערככם5דרגות זחל הישרדות. עוד יותר, כי ובפציעתם יכול להתבצע כאשר הזחל נמצא המכשיר, ניתן לאסוף תמונות מראש ופצעו פוסט-על הפרק סימטרית אותו (איור 4A). ZWEDGI היתרי האוסף של 3 נתונים תלת-ממדי לאורך זמן, מספקת תצוגה מקיפה יותר של השינויים הדינמיים המתרחשים במבנה של מטריצות (איור 4B). מאויר כאן SHG סיבים פצע הרפיה 3 ממדים, עוקב אחר ופצעו בתוך zWEDGI. לפני פציעתו, זיהה SHG סיבי קולגן להקרין כלפי חוץ מ מיתר הגב אל קצה הסנפיר, (איור 4A). זמן קצר לאחר ופצעו את המרחק בין קצה הסנפיר מכווצים את מרכז של thסנפיר e עולה עם הפצע הרפיה. הטבע תלת-ממד של איסוף הנתונים מאפשרת שחזור המרחבי, באמצעות תוכנת עיבוד כגון Imaris. שחזורים, אפשרויות הסיבוב עוקבות, להמחיש את ההתכווצות, הרפיה של הסנפיר מתרחשת לא רק במישור y x של אוסף תמונות (איור 4 B, C, D), אלא גם בציר z (איור 4 G-J, L-O, Q-T; משלימה סרטים 1, 2) כמו הזנב גורמת לשיטוח מ קורל כלפי מעלה של המדינה מכווצים. ZWEDGI ניתן להשתמש עם שיטות הדמיה אחרות במשך פרקי זמן ארוכים יותר, כגון שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית את התמונה הנוירונים במהלך הפיתוח סנפיר סימטרית מעל 24 h5. כי יחידות הרחקה של המכשיר מסודרים במקביל, ובכך מבטל את הצורך כדי לסובב את המכשיר כאשר איתור הזחלים, הגדרת המיקרוסקופ ונעה בין הדגימה מרובים עבור הדמיה ברורה, יכול להיות אוטומטי כדי לאסוף נתוני תמונות בצילום מואץ של הזחלים מרובים. כדי להרחיב במספר הדגימות כי אפשר לדימות, ניתן להניח את המכשיר zWEDGI PDMS לתוך תבניות זכוכית עם תחתית אחרות, כגון צלחת 6-טוב (איור 2C).
איור 1 : העיצוב הסופי מפרטים טכניים (א) מפרטים טכניים מראה כללי הפריסה של המידות של המכשיר zWEDGI, סימון בטרמינולוגיה של התאים באופן פונקציונלי ממודר. (B) מבט איזומטרי PDMS ההתקן הוסר מן העיפוש. (ג) שיבוץ מראה המנהרה, המדגיש את השינוי כניסה ויציאה של הגולן. (ד) מודל של זחל מרוסנות בתוך המכשיר. דמות שונה בעבר לאור סעיף5 עם הרשאת הדפסה מחדש מהיומן דג זברה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ייצור מפרטים טכניים (א) שלב 1 מתחיל עם עיצוב התבנית התקן ב- 3D מידול תוכנה (1.1) שלאחר מכן מודפס 3D (1.2). התבניות הם אור UV לריפוי ״הכל ואז לנקות אז גיאומטריות מורמות יש אפילו גובה (1.3). שלב 2 כרוך ממלא את התבניות שבהן מעורב, degassed PDMS (2.1) והחלת דיסק זכוכית מעל העובש-בשיפוע כדי למנוע השמנה בועות אוויר במכשיר PDMS (2.2). זכוכית ועובש הם כשכרטיס ביחד (2.3) עבור ריפוי בתנור ב 100oC במשך שעה לפחות (2.4). שלב 3 משתמש אוויר מסונן ולא שטוח שקצהו פינצטה כדי להסיר את ההתקן PDMS כייר (3.1). המכשיר ממוקם מכן בראש המכסה מאכל הדמיה (3.2) והוא פלזמה מטופלים (3.3), יחד עם רצפת הזכוכית, כדי לאפשר את PDMS לדבוק המנה התחתון זכוכית (3.4). (B) המכשיר zWEDGI סיים בונדד בקערת זכוכית התחתון ומוכנים לשימוש הדמיה. (ג) מספר התקנים zWEDGI ניתן להניח בצלחת זכוכית התחתון 6-ובכן לשם תמונה הזחלים רבים ב- אותו ניסוי. דמות שונה בעבר לאור סעיף5 עם הרשאת הדפסה מחדש מהיומן דג זברה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : וטעינה של פציעתו של זחל ב- zWEDGI (א) זחל טעון לתא הטעינה באמצעות פיפטה של wide-דיזה. (B) הזחל מכוון עם הצד הגבי מול החלק השטוח של הטעינה קאמרית משפך וזנב לכיוון המנהרה מרסנת. (ג) באמצעות שאיבה מהקצה פיפטה שנערך בכניסה לחדר wounding, הזחל הוא נשאב לתוך המנהרה, הצבתו בכיוון הנכון עבור הדמיה. (ד) נוזל יוסר מן החדר טעינה כדי לאפשר התוספת של agarose סביב אזור הראש לייצב את הזחל (E) . Agarose הוא בצבע אדום כאן להמחשה בלבד. Agarose מינימלי דליפות אל החדר wounding, ניתן להסיר בקלות כפי שמוצג (נ). (ז) בפצע ברגע הזחל מרוסנת בערוץ, להב סכין נוסף מעל הזחל והוא פרוס למטה על פני סנפיר סימטרית, האחורי מיתר הגב. (H) הזחל מוכן כעת לדימות שלאחר הפצע. קנה המידה של בר (A-H) = 1 מ מ; קנה המידה של בר (נ) = 1 מ מ; קנה המידה של בר (G) = 1 מ מ. דמות שונה בעבר לאור סעיף5 עם הרשאת הדפסה מחדש מהיומן דג זברה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תלת-ממד זמן multiphoton לשגות הדמיה של סיבי SHG, דג זברה סימטרית סנפיר, טרום ופצעו פוסט, ב zWEDGI. העיצוב zWEDGI מספק את היכולת של הדמיה ברזולוציה גבוהה, במקרה זה של ארגון סיבים SHG הקודם (פצע מראש) ובעקבות סימטרית למצ חיתוך (שלאחר הפצע). הנתונים נאספו כ z-ערימות במרווחים של 4 דקות. (A-E) מציג את SHG של סיבי הסנפיר סימטרית כמו תחזית של z-במחסן, לפני כן, בשעה ארבע מרווחי שלאחר חיתוך. Z-ההקרנה בוצעה באמצעות תוכנת ImageJ. 15 t = 0 הייתה ההתחלה של הדמיה, כ- 20 דקות לאחר חיתוך. זוגי החצים מצביעים על הגדלת המרחק של הקצה לקצה הפצע (קו לבן קצר) יחסיים למיקום מיתר הגב (קו לבן ארוך) במהלך הרפיה של הפצע בעקבות התכווצות הראשונית. (F-J). מוטה שחזור תלת-ממדית של הנתונים המקוריים. (K-O). עיבוד פני שטח של השחזור 3D מוטה שמוצג F-ג'יי (P-T). נופים צדדיים של עיבוד פני השטח שחזור תלת-ממד, הממחישות כיצד התכווצות והרפיה מתרחשים במרחב תלת-ממדי, אשר יכול להיות מוערך עם נתונים אלה נאספים באמצעות zWEDGI את שם הפרק סימטרית לא מוגבל בשל agarose. קנה המידה של בר (A-E) = 100 מיקרון; קנה המידה של בר (F-T) =100 מיקרון. הדמיות תלת-ממד בוצעו באמצעות תוכנת הדמיה. ראה גם משלימה סרטים 1 ו- 2. דמות שונה בעבר לאור סעיף5 עם הרשאת הדפסה מחדש מהיומן דג זברה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : השלבים הקריטיים של zWEDGI פבריקציה נוספת (א) כדי להבטיח אין טופס בועות או להילכד בהתקן כאשר מחבר חובק למעקה על הדיסק זכוכית, דגה לאחר PDMS נלקחה לתוך התבניות, הטה את הכוס clamping בעת החלתה PDMS ב כייר. בנוסף, למנוע PDMS "הברקה" מעל ההעמסה ולוודא ופצעו צ'יימברס, לחול העליון של המכשיר באופן יסודי כדי להבטיח המשטחים של גיאומטריות בעת ריקון מחבר חובק למעקה על הזכוכית. (B) כאשר המכשיר נרפאה מספיק בתנור, מציינים כיסי אוויר בין PDMS לבין עובש כי המכשיר יהיה קל להסיר. אם ההתקן אינו מסיר בקלות, זה ככל הנראה עקב התרופה אין די זמן או טמפרטורה או את התבנית עצמה היה לא שלמאחה UV-נרפא, וכתוצאה מכך שרף שיורית זיהום של PDMS. (ג) בשעת החלת את המכשיר על המנה בתחתית הכוס לאחר טיפול פלזמה, הפעילו לחץ קל בקצה האחורי של פינצטה, החל מ- האזורים המנהרה וכלפי לכיוון הקצה של המכשיר. אם המכשיר לא להיקשר טוב, כמצוין על-ידי כיסי אוויר בין ההתקן לבין הזכוכית, להאריך את משך הזמן ב בונדר פלזמה ולהבטיח כי יש אין אבק בין פני השטח PDMS וזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה סרט 1: מוטה 3עיבוד משטח של זמן multiphoton לשגות תמונות של סיבי SHG הנוסח סימטרית במהלך הרפיה שלאחר ופצעו. SHG של סיבי בהסנפיר סימטרית עם תמונה כמו zstacks לאורך זמן לאחר ופצעו (ההתחלה של הסרט הוא כ- 20 דקות לאחר פציעתו) ב- zWEDGI. Z-במחסן שוחזרו, השטח מעובד באמצעות תוכנת הדמיה. זנב נוטה להראות dimensionality שלוש. הקדמי הוא בצד שמאל. הסרט מקביל תמונות סטילס איור 4 (K-O). סרגל קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
משלימה את הסרט 2: מבט צד של עיבוד פני שטח תלת-ממד של זמן multiphoton לשגות תמונות של סיבי SHG הנוסח סימטרית במהלך הרפיה שלאחר ופצעו. SHG של סיבי בהסנפיר סימטרית עם תמונה כמו zstacks לאורך זמן לאחר ופצעו (ההתחלה של הסרט הוא כ- 20 דקות לאחר פציעתו) ב- zWEDGI. Z-במחסן שוחזרו, השטח מעובד באמצעות תוכנת הדמיה. מבט צד שמוצג כדי להדגיש לכידתו של שינויים דינמיים ציר z. הקדמי הוא בצד שמאל. הסרט מקביל תמונות סטילס איור 4 (P-T). סרגל קנה מידה = 40 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של המכשיר zWEDGI הוא לכידת תלת-ממד זמן לשגות הדמיה על ידי ייצוב המכוונת את הדגים בתוך המרחק עבודה קטן של מטרה מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. תוך עמידה מפרטים אלה עיצוב, זה גם שיפור מעל המסורתית מבוססת אגר הכנה עבור הדמיה בשידור חי. ישנם שלושה שלבים קריטיים (להלן) בייצור של zWEDGI, אשר, אם לא נעשה כראוי, עלולה לגרום מכשירים פגומים:
הכנת PDMS (איור 5A)
כדי למנוע בועות, דגה התבניות לאחר PDMS נוספה. בדוק כי כל הבועות חוסלו לאחר degassing שים לב ליישום של הדיסק זכוכית. יש להחיל את הדיסק זכוכית-בשיפוע כדי להבטיח כי האוויר לא להיות לכוד מתחת ובתוך את PDMS. אבק יכול להיות בעיה במהלך השלבים ברוב של התהליך. כדי למנוע אבק, להשלים כל שלב ניקוי יסודי ולאחסן חלקים בשכונה נקי בין השלבים. בדוק ליציקות שרף עודף עלולים ליצור משטח מחוספס לפני UV-אשפרה. כאשר מלטש, לוודא כי המגעים נייר גיאומטריות כל כדי להבטיח כי כל משטחים הם המים (איור 2, שלב 1.3). תמיד נקי עם אלכוהול איזופרופיל והאוויר לפני מילוי התבניות עם PDMS. שבו לסחוט את PDMS נוספת מחוץ כייר, להבטיח התפסים בחוזקה להחזיק כייר ו זכוכית מכסה ביחד (איור 2, שלב 2.3).
הסרת התקן עובש (איור 5B)
ודא התנור הוא לפחות 100 o C והפעם התרופה היא לפחות 1-1.5 שעה. אם PDMS לא נרפאה מספיק, זה יכול להיות קשה להסיר התבנית. אפשרויות אחרות עבור אי להסיר כוללים ערבוב לא ריאגנטים PDMS ארוכה מספיק, באמצעות יחסי שגוי של הבסיס, במינראליים או שרף שאריות שנותרו העובש לאחר 3D הדפסה אשר ואז מזהם את PDMS. בעת הסרת מהתנור, כיסי אוויר בין המכשיר לבין עובש (איור 5B) מציינים כי המכשיר יוסרו בקלות.
ההקפדה של PDMS צלחת עם תחתית זכוכית (איור 5C)
הדבקות המסכן צלחת זכוכית העלולות לנבוע אבק, אי-התאמות או לא מספיק אורך טיפול פלזמה. כאשר הצבת המכשיר על גבי הזכוכית, עצה המנה בזווית, מרכז PDMS על גבי המעגל זכוכית מוודא שזה לא נוגע את הקצוות היטב. אם התקן שאינו תואם, הקש בקפידה את המכשיר על גבי בתגית זכוכית בקצה האחורי של הפינצטה, החל באזור מנהרת עדין והקשה כלפי חוץ את הקצוות. אם ההתקן עדיין שאינו תואם, הניסוי על-ידי הגדלת הזמן ב הפלזמה מנקה, במרווחים של דקה אחת.
ואילו הזחלים ניתן לדימות במכשיר לפרקי זמן קצרים של הזמן (דקות) ללא שימוש אגר, לצורך לטווח ארוך לחיות הדמיה האזור סנפיר סימטרית, אגר מושם על הראש בבית הבליעה טעינה לאחר הדג היה טעון. למרות יישום זה של אגר אינו מופיע כדי להשפיע על הפצע ריפוי תגובה או הכדאיות של הזחלים5, זה יכול. להשפיע המחקר של אזורים נוספים הקדמי של הזחלים. אמנם הצלחנו רימות תמונה עבור עד 60 שעות עד אנחנו לא בדקתי אם הכדאיות להיות מושפעים יותר פעמים הדמיה. בנוסף, העיצוב המסוים המובאת כאן היה אופטימיזציה עבור גיל 2-4 ימים הפריה (dpf) פוסט הזחלים שוכב על צדם הזנב חיתוך, הדמיה ריפוי הפצע. שלבים התפתחותיים, כיווני ופרוטוקולים ניסיוני אחרים עשויים לדרוש שינויים בעיצוב. עם זאת, המודולריות פונקציונלי מכוונת של העיצוב מקל נוטה בקלות שינויים כאלה.
בנוסף, פבריקציה נוספת של התקן זה דורש גישה מדפסת תלת-ממד ו אחרים microfluidic חומרים, ציוד, כגון PDMS ופלזמה מנקה, פוטנציאלית הגבלת הנגישות של המכשיר משתמשים מסוימים. עם זאת, שיטה זו של ייצור תבנית נבחר מאז יכולות הדפסה 3D, יחד עם מיקרופלואידיקה פבריקציה נוספת, הופכים להיות נפוץ יותר בקמפוסים אקדמיים. בנוסף, ישנם ספקי שירות 3D הדפסה זמינים, ככל שהטכנולוגיה מתפתחת במהירות, העלות של מדפסות ירידות.
בהתחשב ממודר עיצוב ופונקציונליות שלה, zWEDGI מציע שיפורים הטכניקה הנוכחית עבור זמן לשגות אוסף תמונה באמצעות אגר הטבעה. ראשית, agarose לא תוחם אזור הזנב zWEDGI, התרת ריפוי הפצע והתחדשות כדי התקדמות חסרת מעצורים בזמן ההישרדות של הזחלים ב zWEDGI משולה מוטבע בקרות והסגנונות5. שנית, השימוש של הדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה כדי לבדות התבניות מאפשר את zWEDGI שיהיה ייחודי גיאומטריות משופע כדי להציב הזחל בשלושה מימדים ביחס המטוס הדמיה. זה מסיר את התלות בזמן של מניפולציה הזחלים לכיוון הנכון כפי אגר מתקשה. חשוב התועלת של עיצוב zWEDGI עיצוב החדר פתוח שלישי זה מתיר את הזנב ואזורים ראש יהיה נגיש עבור מניפולציה ניסויית. זה עניין ספציפי עבור לימודי ריפוי הפצע, אבל זה גם הופך zWEDGI כלי שעשוי להיות שימושי עבור אחרים מניפולציות. העיצוב compartmental של המכשיר, יתר על כן, מספק ההזדמנות ליישום האזורי של תרכובות במהלך ניסויים. מבודדת למחצה המכשיר הראש לכיוון הזנב בגלל המבדלת דיפוזיה של מאגר (בבית הבליעה wounding), agarose (בבית הבליעה הטעינה)5, ומאפשרת יישום של תרכובות תוך כדי לימוד ריפוי הפצע או ביולוגיים אחרים תהליכים. בנוסף, כי הזחלים הם רכובים בערוצים נפרדים, זחל בודדים ניתן לזהות ולאחזר ההדמיה שלאחר עיבוד נוסף כגון טיהור RNA או החלבון או נוגדן תיוג. בסופו של דבר, כי המכשיר מורכב PDMS זה התאחד למנה bottomed זכוכית, המכשיר לשימוש חוזר ברגע הזחלים הוסרו.
ב. להתקדם, עיצוב מודולרי וקלות פבריקציה נוספת של zWEDGI ישאיל עצמו היטב כדי שינוי עבור פונקציונליות שונה. כיום, גיאומטריות compartmental בנויים במיוחד עבור ופצעו ואת ההדמיה הניסויים המתוארים, ומעניק לו יישום רחב עבור הדמיה חיה של ריפוי הפצע. עם זאת, הזחל שוכן ישירות על הכוס, כך שום חומר (קרי PDMS), אשר עלול להפריע הדמיה, קיים בין הזחל לבין השטח הדמיה. לכן, אזורים אחרים של הזחלים, כגון תא המטען, טפלld יהיה נגיש עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשנות את העיצוב של העובש מודפס 3D של zWEDGI בקלות כדי להתאים אחרים שלבים התפתחותיים, נטיות שונות של זחל, מגוון טיפולים. תכונות אלה לכן שזה כלי רב ערך עבור לכידת זמן לשגות מיקרוסקופיה של אירועים על מגוון רחב של סולמות זמן. השימוש בתבניות צלחת התחתון אחרות זכוכית העשויה לאפשר שטח עבור ערוצים יותר והתקנים PDMS גדולים יותר. בהתחשב הגדלת הנגישות טכניקות ייצור הדפסת תלת-ממד, הקלות עוקבות של שינוי למגוון פרוטוקולים ניסיוני, zWEDGI עשויה להיות כלי רב עוצמה בתחום של מיקרוסקופיית הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר הפרוייקט העיקרי למימון ממכון Morgridge המעבדה ומחקר עבור אופטיות ומכשור חישובית. אנו גם להכיר מימון NIH # R01GM102924 (AH ו- KWE). ח', JMS, ר', AH, KWE נוצר ועוצב על המחקר. ח', JMS ביצע ניסויים כל עם תמיכה DL, KP, ר'. ח', JS, ר', AH KWE תרמו הכתיבה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
