Kvantificering af mikroorganismer ved lave koncentrationer ved hjælp af digitale holografiske mikroskopi (DHM)
Summary
Digitale holografiske mikroskopi (DHM) er en volumetrisk teknik, der tillader imaging prøver 50-100 X tykkere end brightfield mikroskopi på sammenlignelige opløsning, med fokusering udført post-processing. DHM bruges her til at identificere, tælle, og tracking mikroorganismer på meget lav tætheder og sammenlignet med optisk tæthed målinger, kimtal og direkte count.
Abstract
Præcist afsløre og tælle sparsomme bakteriel prøver har mange anvendelser i mad, drikkevarer, farmaceutiske forarbejdningsindustri, i medicinsk diagnostik og for livet påvisning af robot missioner til andre planeter og måner af solsystemet. I øjeblikket tælles sparsomme bakteriel prøver efter kultur plating eller epifluorescensmikroskop mikroskopi. Kultur plader kræver lange inkubation gange (dage til uger), og epifluorescensmikroskop mikroskopi kræver omfattende farvning og koncentration af prøven. Vi viser her, hvordan off-axis digitale holografiske mikroskopi (DHM) til at optælle bakterier i meget fortyndet kulturer (100-104 celler/mL). Først, opførelsen af den brugerdefinerede DHM er drøftet, sammen med detaljerede instruktioner om at bygge et billigt instrument. Principperne om holografi er drøftet, og en statistisk model bruges til at anslå, hvor lang tid videoer bør være at opdage celler, baseret på karakteristika for instrumentets optiske ydeevne og koncentrationen af den bakterielle løsning (tabel 2) . Video påvisning af celler på 105, 104, 103og 100 celler/mL er demonstreret i realtid ved hjælp af un-rekonstruerede hologrammer. Genopbygning af amplitude og fase billeder er vist ved hjælp af en open source-softwarepakke.
Introduction
Bestemmelse af nøjagtige bakteriel tæller i meget fortyndet prøver er afgørende i mange applikationer: et par eksempler er vand og mad kvalitet analyse1,2,3; påvisning af patogener i blod, cerebrospinalvæske eller sputum4,5; produktion af farmaceutiske produkter, herunder sterilt vand6; og miljømæssige samfund analyse i oligotrophic miljøer som det åbne hav og sedimenter7,8,9. Der også stigende interesse for påvisning af mulige bevarede mikrobielle liv på de iskolde måner af Jupiter og Saturn, især Europa10,11 og Enceladus12,13, 14, som er kendt for at have undergrunden flydende oceaner. Fordi ingen mission siden Viking i 1978 har forsøgt at finde bevarede liv på en anden planet, har der været begrænset udvikling af teknologier og instrumenter for bakteriel identifikation og tælling under plads missioner15.
Traditionelle metoder til kimtal finde kun bestemmelse celler, som kan repræsentere et mindretal af arter i miljøet stammer, undertiden < 1%16. Plader kræver dage eller uger af inkubation for maksimal succes, afhængigt af stammen. Epifluorescensmikroskop mikroskopi har stort set erstattet plade tæller som guldstandarden for hurtig og præcis mikrobielle optælling. Nukleinsyre-syre-mærkning fluorescerende farvestoffer såsom 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI), SYBR Green eller acridin orange der binder sig til nukleinsyrer er typisk farvestoffer brugt17,18,19 , selvom mange undersøgelser bruger fluorescerende indikatorer for Gram log20,21,22,23,24. Ved hjælp af disse metoder uden forudgående koncentration trin fører til detektionsgrænser (LoDs) ~ 105 celler pr. mL. Forbedringer i LoD er muligt ved hjælp af filtrering. En flydende er vakuum-filtreret på en membran, som regel polycarbonat og ideelt sort at reducere baggrund. Lav-baggrund farvestoffer såsom DNA pletter nævnt ovenfor kan anvendes direkte til filter25. For præcis optælling af øjet, ~ 105 celler er påkrævet per filter, hvilket betyder, at prøver mere fortyndet end ~ 105 celler pr. mL, betydelig prøve diskenheder skal indsamles og filtreret. Laser-scanning enheder er blevet udviklet for systematisk udforske alle regioner af filteret og dermed mindske antallet af celler, der kræves for at tælle, at skubbe detektionsgrænser ned til ~ 102 celler pr. mL26. Men disse er ikke tilgængelige i de fleste laboratorier, og kræver avancerede hardware såvel som software der tillader ekspert bekræftelse, der observeres partikler er bakterier og ikke snavs.
For reference, begynder voksne med sepsis normalt viser symptomer på < 100 celler/mL af blodet, og spædbørn på < 10 celler/mL. En blod draw fra en voksen tager 10 mL, og fra spæd, 1 mL. PCR-baserede metoder er hæmmet af tilstedeværelsen af menneskelige og ikke-patogene flora DNA og PCR-hæmmende komponenter i blod27,28. Trods en række nye teknikker fortsat kulturer guldstandarden til diagnosticering af infektioner i blodet, især i mere landlige områder eller udviklingslande. Til påvisning af liv på andre planeter, kan termodynamiske beregninger vurdere energi budget for liv og dermed den forventede mulige biomasse. 1 – 100 celler/mL forventes at være termodynamisk rimelig Europa29. Det kan let ses fra disse numre, registrering af et meget lille antal celler i store mængder af vandig opløsning er et vigtigt uløste problem.
I dette papir, vi vise påvisning af Serratia marcescens og Shewanella oneidensis (wild-type og ikke-motile mutant) i koncentrationer på 105, 104, 103og 100 celler/mL ved hjælp af en off-axis digitale holografiske mikroskop (DHM). Den vigtigste fordel ved DHM over traditionelle lysmikroskopi er den samtidige imaging af en tyk sample volumen med høj opløsning – i denne implementering i prøve salen var 0,8 mm tyk. Disse prøve afdelingerne blev bygget af den bløde-litografi af Polydimethylsiloxan (PDMS) fra en præcision-bearbejdet aluminium støbeform med en tolerance på ± 50 µm. Dette repræsenterer en ca 100-fold forbedring i dybde af felt over high-power lysmikroskopi. DHM indeholder også kvantitative fase oplysninger, giver mulighed for målinger af lysvej (produkt af brydningsindekset og tykkelse). DHM og lignende teknikker har været anvendt til overvågning af bakteriel og gær cellecyklus og beregning af bakteriel tør masse30,31,32; spredning forskelle kan endda bruges til at differentiere bakteriestammer33.
Det instrument, vi bruger er skræddersyet specielt til brug med mikroorganismer, som tidligere udgivne34,35, og dens design og konstruktion er vist og diskuteret. Vandige opløsninger er løbende leveret til en 0,25 µL volumen prøve salen via sprøjten pumpe; strømningshastigheden er bestemt af kamera billedhastighed for at sikre billeddannelse af hele prøven volumen. En statistisk beregning forudsiger antallet af prøven diskenheder, der skal være afbildet for at afsløre et betydeligt antal celler i en given koncentration.
For celle-opdagelse ansøgninger var genopbygning af hologrammer i amplitude og fase billeder ikke påkrævet; analyse blev udført på den rå hologram. Dette sparer betydelige beregningsmæssige ressourcer og diskplads: en 500 Mb hologram video vil være 1-2 Tb når rekonstrueret. Dog vi diskutere genopbygning gennem dybde af prøven til at bekræfte, at hologrammer repræsenterer den ønskede arter. Et vigtigt træk ved DHM er dens evne til at overvåge både intensitet og fase af billederne. Organismer, der er næsten gennemsigtige i intensitet (f.eks. de fleste biologiske celler) vises tydeligt i fase. Da det er en etiket-gratis teknik, anvendes ingen farvestoffer. Dette er en endvantage for mulige rumfart applikationer, eftersom farvestoffer ikke kan overleve betingelserne af en mission og — endnu vigtigere — ikke antages for at arbejde med udenjordiske organismer, som ikke kan bruge DNA eller RNA til kodning. Det er også en fordel for arbejde i ekstreme miljøer såsom Arktis og Antarktis, hvor farvestoffer kan være vanskeligt at bringe til den afsides beliggenhed og kan nedbrydes ved opbevaring. Genopbygning af billeder i fase og amplitude er udført ved hjælp af en open source-softwarepakke, som vi har stillet til rådighed på GitHub (SHAMPOO) eller ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numeriske genopbygning af hologrammer: numeriske genopbygningen af hologrammer, metoden kantede spektrum (ASM) bruges. Dette indebærer foldning af hologram med den grønne funktion for DHM. Den komplekse wavefront af billedet i et bestemt brændplanet kan beregnes ved at ansætte Fourier foldning sætning som følger:
(1)
Hvor <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Gordon og Betty Moore Foundation tilskud 4037 og 4038 til California Institute of Technology for finansiering af dette arbejde.
Materials
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples – Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, . 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn’s moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. . Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. . Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
