Summary
Голографической цифровой микроскопии (DHM) является объемный метод, который позволяет после обработки изображений образцов, выполненных толще, чем brightfield микроскопии в сопоставимых резолюции, с упором на 50-100 X. DHM используется здесь для выявления, учета и отслеживания микроорганизмов на очень низкой плотности и по сравнению с измерения оптической плотности, плита count и прямых игр.
Abstract
Точного обнаружения и подсчета разреженные бактериальные образцы имеет много приложений в продуктов питания, напитков и фармацевтической промышленности, в медицинской диагностике, а также для обнаружения жизни роботов миссиями на другие планеты и спутники солнечной системы. В настоящее время разреженные бактериальные образцы учитываются по культуре обшивка или эпифлуоресцентного микроскопии. Плиты культуры требуют долго инкубационный раз (дней до нескольких недель), и микроскопия помощью эпифлуоресцентного требует обширных окрашивание и концентрации образца. Здесь мы продемонстрируем использование вне оси цифровой голографической микроскопии (DHM) для перечисления бактерий в очень разбавленных культур (100-104 клеток/мл). Во-первых строительство пользовательских DHM обсуждается, а также подробные инструкции по созданию инструмента лоу кост. Обсуждены принципы голографии, и статистическую модель используется для оценки, как долго видео должно быть обнаружить клетки, основанный на оптические характеристики инструмента и концентрация бактерий раствора (Таблица 2) . Видео выявление клеток на 105, 104, 103и 100 клеток/мл свидетельствует в реальном времени с помощью ООН реконструированный голограммы. Реконструкция амплитуды и фазы изображений показано с помощью пакета с открытым исходным кодом.
Introduction
Определение точной бактериальных отсчетов в очень разбавленных пробах крайне важно во многих приложениях: несколько примеров являются воды и продовольствия качества анализа1,2,3; обнаружение возбудителей в крови, спинномозговой жидкости или мокроты4,5; Производство фармацевтической продукции, в том числе стерильной воды6; и анализ экологического сообщества в олиготрофном средах, например в открытом океане и отложений7,8,9. Растет также интерес к обнаружению возможных сохранившиеся микробной жизни на ледяных лун Юпитера и Сатурна, особенно Europa10,11 и Энцелада12,13, 14, которые, как известно, имеют подземных жидких океанов. Потому что ни одна миссия с Викинг в 1978 году пытался найти сохранившиеся жизнь на другой планете, был ограниченным развитием технологий и инструментов для идентификации бактерий и подсчета голосов во время космических миссий15.
Традиционные методы плита графа найти только culturable клетки, которые могут представлять меньшинство видов экологической штаммов, иногда < 1%16. Пластины требуют дни или недели инкубации для максимального успеха, в зависимости от штамма. Микроскопия помощью эпифлуоресцентного основном заменены плиты счетчики как золотой стандарт для быстрого и точного микробной перечисления. Нуклеиновые кислоты маркировки флуоресцентных красителей, например 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI), SYBR зеленый или оранжевый акридин привязанные к нуклеиновые кислоты являются типичными красители, используемые17,18,19 , хотя многие исследования используют люминесцентные Индикаторы грамм подписали20,-21,-22,-23,-24. С помощью этих методов без шаги предварительной концентрации приводит к пределов обнаружения (LOD ' ы) ~ 105 клеток / мл. Улучшения в Лоде можно с помощью фильтрации. Жидкий образец, вакуум фильтруются на мембраны, обычно поликарбоната и идеально черный для уменьшения фона. Низкий фон красителей, таких как пятна ДНК, упомянутые выше могут быть применены непосредственно к фильтр25. Для точного подсчета глаз, ~ 105 клетки необходимы для фильтра, что означает, что для образцов более разбавленного чем клетки5 ~ 10 мл, пользователей.вследствие тома должны быть собраны и фильтруют. Лазерное сканирование устройства были разработаны для того, чтобы систематически исследовать все регионы фильтра и таким образом уменьшить количество клеток, необходимых для подсчета, толкания пределы обнаружения до ~ 102 клеток / мл26. Однако они не доступны в большинстве лабораторий и требуют сложного оборудования, а также программного обеспечения которые позволяют эксперт подтверждение, что наблюдается частиц, бактерий и не мусор.
Для справки, взрослых с сепсисом обычно начинают симптомами на < 100 клеток/мл крови и младенцев в < 10 кл/мл. Ничьей крови от взрослого занимает 10 мл, а от младенца, 1 мл. Методы на основе ПЦР ингибируется наличием микрофлоры человека и непатогенные ДНК и ПЦР ингибирующих компонентами крови27,28. Несмотря на целый ряд новых методов культур остаются золотой стандарт для диагностики инфекций кровотока, особенно в сельских районах или развивающихся стран. Для обнаружения жизни на других планетах термодинамические вычисления можно оценить бюджет энергии для жизни и, таким образом, ожидаемый возможных биомассы. 1 - 100 клеток/мл, как ожидается, будут термодинамически разумные Europa29. Это можно легко увидеть из этих чисел обнаружения очень небольшое количество клеток в больших количествах водный раствор является важной нерешенной проблемой.
В этой статье, мы демонстрируем обнаружения Serratia marcescens и Shewanella oneidensis (одичал тип и не подвижные мутант) в концентрациях 105, 104, 103и 100 клеток/мл, используя вне оси Голографический микроскоп (DHM). Ключевым преимуществом DHM над традиционными световой микроскопии является одновременные снимки объем толстые пробы с высоким разрешением — в этой реализации, камеры образец был толщиной 0,8 мм. Эти образцы камеры были построены софт литография полидиметилсилоксан (PDMS) с высокой точностью алюминиевых плесень с допуском ± 50 мкм. Это представляет приблизительно 100-кратного улучшение в глубине поля над мощной световой микроскопии. DHM также обеспечивает количественную фазу информацию, позволяя для измерения длины оптического пути (продукт преломления и толщина). DHM и подобные методы были использованы для контроля бактерий и дрожжей клеточного цикла и расчет бактериальной сухой массы30,,3132; рассеяние различия может даже использоваться для различения бактериальных штаммов33.
Инструмент, который мы используем на заказ специально для использования с микроорганизмами, как ранее опубликованные34,35, и его дизайн и строительство продемонстрировали и обсуждены. Водные растворы поставляются непрерывно объем 0,25 мкл пример камеру через шприцевый насос; скорость потока определяется частота кадров камеру для обеспечения визуализации объема всей выборки. Статистическое вычисление предсказывает количество образцов томов, которые должны отражаться для того, чтобы обнаружить значительное количество ячеек в данной концентрации.
Для клеток обнаружения приложений реконструкция голограмм в амплитуду и фазу изображения не требуется; анализ проводился на сырье голограммы. Это экономит значительные вычислительные ресурсы и дисковое пространство: 500 МБ голограммы видео будет 1-2 ТБ при реконструкции. Однако мы обсуждаем реконструкции через глубины выборки для подтверждения, что голограмм представляют желаемый вид. Важной особенностью DHM является его способность контролировать интенсивность и фазу изображения. Организмов, которые являются почти прозрачной в интенсивности (например, большинство биологических клеток) появляются четко в фазе. Как это лейбл бесплатно техника, не красители используются. Этопреимущество для возможных космического полета приложений, так как красители могут не пережить условия миссии и — что еще более важно — нельзя работать с внеземных организмов, которые не могут использовать для кодирования ДНК или РНК. Это также преимущество для работы в экстремальных условиях Арктики и Антарктики, где красители могут быть трудно довести до удаленного местоположения и может ухудшиться после хранения. Реконструкция изображений в амплитуде и фазе выполняется с помощью пакета с открытым исходным кодом, который мы сделали доступны на GitHub (шампунь) или ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост и перечисление бактерии
Примечание: это применимо к почти любой бактериальный штамм, выращенных в соответствующих средних 36. В нашем примере, мы используем три штамма: Serratia marcescens как общие, легко идентифицируемые лаборатории штамм; и меньше, очень подвижные экологической нагрузки, Shewanella oneidensis MR-1. Для сравнения обнаружения подвижных против не подвижные клетки, не подвижные Shewanella мутант, Δ FlgM, также используется для сравнения 37. Все штаммы выращиваются в бульоне lysogeny (LB).
- Подготовить стерильные LB среднего (за литр дистиллированной воды: bacto Триптон 10 g, 5 g bacto дрожжей, 10 г NaCl; фильтр или автоклаве). Подготовьте стандартный 100 мм диаметр LB-агар пластины (же рецепт как средний плюс 15 g агар литр; автоклав (121 ° C, 20 мин) для стерилизации и залить когда достаточно прохладно, чтобы обрабатывать). Хранить в холодильнике среднего и пластин.
- За день до эксперимента семян 5-6 мл " мастер " культуры среднего из свежих бактериальные колонии, используя правильную технику стерильные и биобезопасности. Инкубируйте на шейкере (120 об/мин) при 30 ° C ~ 12 ч инкубации время будет зависимым от деформации и темпов роста. В наших экспериментах Shewanella штаммов инкубируют на 12 часов; Однако, Serratia собирают после 8 часов, чтобы культура будет участвовать в середине логарифмического роста.
- День эксперимента, возьмите спектрофотометрические чтения (600 OD) бактериальных мастер культуры, которая, как ожидается, будет в диапазоне от 0,6 до 0,7. Это должно быть в фазе логарифмического роста (как определено ранее). Если не, субкультура 100 мкл в 5 мл среды и позволяют рост клеток в середине журнала фазу.
- Взять образец мастера культуры и подсчитать ячейки напрямую с помощью подсчета Petroff-Хауссер камеры. Это будет перечислять живые и мертвые клетки.
- Экстракт 10 мкл пример неразбавленном культуры с микропипеткой и передачи в камеру.
- Изображение под микроскопом высокой сухой объективных (40 X или 63 X, NA 0,7 - 0,8) с использованием фазового контраста.
- Количество бактерий в по крайней мере 20 квадратов и среднем.
Примечание: Учитываются только те бактерии, которые находятся полностью в пределах квадрата и только те переправу через верхней и левой границы (или снизу и справа, если вы предпочитаете). Если квадраты разделяются на несколько строк, выберите один как граница. - Расчет концентрации как в среднем 20 квадратов x коэффициент разрежения. Обратите внимание, что прямые, счетчики не хорошо работать для концентрации < 10 7 / mL.
- Сделать серийных разведений культуры для подсчета колонии-формирования единиц (CFU). Это будет перечислять только живые клетки.
Решение
- сделать последовательный разбавления каждого из выбранных бактериальные образцы с стерильным 0,9% физиологического раствора. Передача 20 мкл раствора бактериальных и разбавить его с 180 мкл физиологического раствора. Повторяйте до тех пор, пока низкая концентрация составляет ~ 10 3 клеток/мл.
- Взять 100 мкл от по крайней мере двух предложил разведений являются 10 3 и 10 4/мл — и пластина на плите соответствующие твердые СМИ. Распространение с стерильных распространитель. Выполнить по крайней мере 3 реплицирует каждого разведения.
- Инкубировать в соответствующей температуре для бактерий на ночь, или до тех пор, пока колонии растут.
- Количество колоний и рассчитать колонии, образуя единиц (CFU) согласно (# колоний x коэффициент разрежения) / тома с покрытием = кое/мл. Средняя CFU над реплицирует.
2. Подготовка весьма разбавленных образцов для DHM
- сделать серийных разведений мастера культуры для DHM и пост DHM подсчета колонии формирование подразделения на LB СМИ пластины (см. 1.4.1 - 1.4.4). Выполнить это двойное слепое, так, что человек делает записи не знает концентрации в каждой измеряемой пробе.
- Развести бактерии в 10-15 мл минимальной среды, которая будет стимулировать моторику (при необходимости) но тормозят деление клеток, таким образом, чтобы концентрация клеток не заметно меняется во время эксперимента. Это может быть, 0,9% физиологического раствора или более конкретных среднего подвижности. Например если с помощью кишечной палочки, сократительной способности среднего должен содержать ЭДТА 38. В этих примерах мы используем 0,9% физиологического раствора.
3. Запись видео DHM
- с помощью стерильного шприца, тянуть в около 10 мл разбавления интерес.
- Подключить шприц к палате DHM образца с помощью стерильных фитинги и трубы.
Примечание: На заказ microfluidic камеры был построен для того, чтобы позволить последовательного потока пробы через оптический путь инструмента. Для получения более подробной информации в разделе результаты. До эксперимента, все компоненты образца камеры следует стерилизован автоклавированием. - Поток выборки из шприца через камеру образец, непрерывно с помощью насоса шприца.
Примечание: Соответствующие расхода зависимости аэрогидродинамических канала измерения, требуемой пропускной способности, а также ограничения приобретения данных. - Как образец текла через камеру образец, приобрести голограммы последовательно на соответствующую частоту. Какие журналы время каждого изображения захвата использоваться позднее при анализе данных (протокол раздел 4) будет создан файл штамп времени. Получите все голограммы при температуре (23° C). Выполнение предварительного письменного исполняемый файл C++, предоставленного изготовителем камеры для записи голограмм.
Примечание: Надлежащих кадров зависит от выбранной скорости потока. Для этого эксперимента, рекомендуется использовать частоту кадров таким образом, что будет отражаться бактерия > 2 раза, как он путешествовал через инструмент ' поле зрения s. - Достаточно времени для всего 10 мл образца передаваться посредством Вывинтить.
- Обеспечить, что бактерии не растет или умирает в ходе экспериментов, прививать обогащенного СМИ пластины с 100 мкл захвата изображений пост DHM отработанного СМИ. Спред с стерильных разбрасыватель и Инкубируйте на соответствующий темп за 24 часа; количество колоний настоящей.
4. Расчет плотности клеток и пределы обнаружения
- с видео приобретенных голограмма, анализировать данные для присутствия бактерий.
- Вычислить значение Средний пикселя для временных рядов голограмм, а затем вычесть этот медианное значение из каждой соответствующих пикселей для ликвидации стационарных артефакты в голограммы. Это может быть сделано в ImageJ, выполнив следующие шаги:
- преобразовать в 32-битных (образ-тип-32 бит)
- вычислить медиану (Image-стек-Zproject-медиана)
- вычесть средний от остальной части стека ( Process-ImageCalculator-Subtract)
- подсчитать количество видимых воздушные кольца и в фокус ячейки вручную. В ImageJ, это делается, указывая на объектов с помощью инструмента точку.
- Каждая серия голограмм будет сопровождаться отметка времени файла (записанный в момент приобретения голограммой). Используйте файл штамп времени рассчитать общее количество образцов закачивается в то время образ был взят в плен.
- Вычислить значение Средний пикселя для временных рядов голограмм, а затем вычесть этот медианное значение из каждой соответствующих пикселей для ликвидации стационарных артефакты в голограммы. Это может быть сделано в ImageJ, выполнив следующие шаги:
- Вычислить плотность ячеек путем деления общее количество клеток, определяется общий объем отображаемого образца. В среднем 5-10 кадров для точной статистики.
5. Изображение восстановления амплитуда и фаза
- выбрать представителя видео с 10-200 клеток в каждом кадре. Загрузка сырья (не вычитается медиана) голограмм в восстановления программного обеспечения (примеры: ImageJ численные распространения 39; Шампунь [GitHub]).
- С помощью ImageJ, перейдите к ОД-численные распространения-численные дифракции.
- В командной строке, нарисуйте маску Фурье выбрать реальный или виртуальный образ и устранить любые функции синусоидального шума.
- Реконструировать амплитуды и фазы на соответствующие z шаги путем ввода расстояния реконструкции.
- Медиана вычесть амплитуда данных для уменьшения шума как 4.1.1.
- Отобразить данные как 3D cube или проекции. Перейти к плагины — объем просмотра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты следует указать способность обнаружить живых и мертвых бактерий на очень низких уровнях DHM. Количество бактерий, учитываются должны согласовываться с результатами, полученными с помощью Petroff-Хаузер Счетной палаты и пластины отсчеты. Стандартные статистические методы предоставляют сведения о точности обнаружения различных методов в различных концентрациях, бактериальных.
Рисунок 1 показывает Petroff-Хауссер Счетной палаты, используется, а также микроструктура Счетной палаты, используемый в перечислении прямой клеток. Рисунок 2A показывает типичный обогащается культура пластины, что позволило достаточно времени для S. marcescens расти колоний (16 часов при комнатной температуре). Рисунок 2B показывает кривые роста для всех штаммов, используемых. Хотя точный спектрофотометрические измерения различаются, отношения между600 и колонии счетчик ОД должна быть линейной в надежных диапазоне спектрофотометра; Мы измерили ~ OD600 = 0,1 в/мл8~ 10. Прямые Petroff-Хауссер подсчитывает и колонии счетчики должны согласиться на 10% до клетки начинают умирать, как видно по оборотам кривой роста.
Рисунок 3 показывает, Дизайн пользовательского образца камер. Пользовательские microfluidic камер были использованы для этого эксперимента разрешить непрерывного потока пробы через поле зрения голографический Микроскоп. Стандартные microfluidic методы и материалы были использованы в строительстве образец палат. Блант наконечником из нержавеющей стали, что иглы с мужской Луер-Лок фитинги были вставлены в устройство microfluidic предоставлять впускных и выпускных отверстий в камеру образец. Геометрии канала microfluidic был учрежден мягкой литографии полидиметилсилоксан (PDMS) с помощью Мастер плесень выточенный из алюминия, который был сжат, через алюминиевые рамы, между двумя оптическое качество стекла. PDMS устанавливает геометрию канала потока, а также обеспечивает иглы, которые обеспечивают перенос жидкости и от каналов потока. Эти палаты образца использовать PDMS исключительно для создания геометрии канала потока и таким образом содержат не PDMS оптического пути документа. Обратите внимание, что из-за оптический характер голографический Микроскоп вне оси, два микро каналы были формованных параллельно друг другу в зале образца. Это предназначено для соответствия длины оптического пути между обоих плечах интерферометра (именуемая «образца» и «ссылка» оружие). Ссылка канал должен содержать только стерильные средства массовой информации и не следует подвергать потока.
Рисунок 4 показывает схематическое изображение и изображения цифровой голографический микроскоп в ее осуществлении лаборатории. Он управляется программного обеспечения, поставляемого с камерой. Рисунок 5 показывает репрезентативных данных DHM для бактериальных перечисления и их соответствие прогнозируемое количество клеток в поле зрения. От сырья голограммы, без восстановления можно увидеть и подсчитать ячейки средний вычитание и ручного отслеживания. Это значительно уменьшает вычислительную нагрузку по сравнению с реконструкцией всех z самолеты, как сырые голограммы показать ячейки по всей глубине камеры. Появление культур в различных концентрациях и их переписку с пластиной число и число Petroff-Хаузер указаны. Общая клеток определяются путем усреднения количество клеток, видели в каждом томе образца за общее количество томов образы. Предел обнаружения определяется общее количество томов образца образы. В этом эксперименте мы задавать максимальный предел на это значение, с максимальной общей сложности 10 мл образца, отображаемого в 0,25 мкл шагом (в общей сложности 40 000 изображений на сэмпл). Записи будут остановлены, прежде чем максимальный совокупный объем достигается, если клетки четко прослеживается в каждом фрейме над серии 20 кадров. В предыдущей статье мы сообщили формулы для оценки количество томов образцов, необходимых для обнаружения бактерий на уровне 50% уверенности в концентрациях от 1-105 клеток/мл (Таблица 1). Исходя из этой оценки, изучение всех 40 000 кадров должен позволить обнаружения клеток в 1/мл, хотя этот расчет интенсивных вычислений.
Рисунок 6 показывает использование восстановления программного обеспечения (Фиджи)39. Открыт один голограммы и программное обеспечение запускается «OD-численные распространения-численные дифракции». Параметры обработки изображений приведены в диалоговом окне; амплитуда, интенсивности и фазы могут все быть восстановлены. Может быть выбран один z плоскости, или пакетного реконструкций может использоваться для восстановления на всю глубину.
На рисунке 7 показана реконструкций амплитуды и фазы изображений на разных глубинах в выбранный образец. Показано Фурье маска, используемая для создания реконструкций, наряду с изображение вычитается средней интенсивности, образ фазы, максимальная проекции через стек фазы и объем проекция стека интенсивности.
Рисунок 1: прямые, считая бактериальных клеток. Бактериальные Концентрация клеток/мл вычисляется путем подсчета общее количество бактерий в подсчете камеры и масштабирование учет числа тот факт, что палата Petroff-Хаузер содержит только 20 nL образца. (A) Petroff-Хауссер подсчет камеры. (B) изображение счетной камеры микроструктуры под 10 X фазового контраста, показаны полезным для перечисления клетки различных размеров коробки различных размеров. (C) внешний вид S. marcescens в Счетной палаты маленьких полях; 40 x фазового контраста. (D) метод для подсчета, исключает клетки, падающие на верхней и правой границ (N), но не левый и нижний края (Y). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Подсчет клеток колонии роста и оптической плотности. (A) S. marcescens инкубировали при комнатной температуре в течение 16 часов. В правильно разрежения следует культуры пластину 20-200 колоний для точного подсчета и статистики. Пластину показано это несколько слишком тесно для надежной подсчета. (B) роста кривых для 3 штаммов, используемых. Оптическая плотность 0.1 соответствует ~ 108 кл/мл, но точные значения зависят от инструмента. Прямые Petroff-Хаузер пунктам согласен с плиты счетчики в пределах 10% в пределах диапазона линейного роста. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение 5 независимых выборок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: образец конструкции камеры. (A) Microfluidic схема (помечены микроканалов образца и ссылки). (B) полностью собранный образец камеры. (C) взорвалась CAD просмотра показаны составные элементы образца камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема и изображения цифровой голографический Микроскоп. (A) схемы показаны четыре основных элемента: источник, образец (образец путь обозначен спец и путь ссылки помечены ссылка), микроскоп и датчик. (B) твердых модель оборудования. Волоконно кормили исходная сборка находится внизу, и тепловизионная камера находится на вершине. Оптики микроскопа – состоит из двух асферические линзы и линзы реле – содержатся внутри трубки длиной объектив 300 мм. Этап 3 оси между источником оптики микроскопа обеспечивает легкий ручной манипуляции образца исследуемого. (C) фотография инструмента в лаборатории. Линейки шкалы в нижней части изображения представляет 1 дюйм. Схемы повторно взяты из Уоллес и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: кривых роста и репрезентативных данных DHM. (A) предсказал клеток в поле зрения на основе объем образца 365 мкм, мкм x 365 x 1 мм. Оптимальный диапазон для перечисления DHM показан в прямоугольнике, и реальные примеры указаны как (B) и (C). (B) DHM голограммы Shewanella культура на 8 x 105 клеток/мл измеряется Petroff-Хаузера и 7,7 x 105 клеток/мл как измеряется количество пластины; Это изображение показывает 110 клеток, отлично подходит для прогнозирования. (C) DHM голограммы Shewanella культуры на 2,0 ± 0,1 x 105 кл/мл, измеряется Petroff-Хаузера и 2.0 ±0. 3 x 105 клеток/мл как измеряется количество пластины; Это изображение показывает 27 клеток. Шкалы бар = 35 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: выполнение реконструкций. (A) открытое голограммы в Фиджи. (B) запустить численное распространения и введите размер длины волны и изображения. Выберите расстояние z недалеко от 0 для запуска. (C) рисовать маску Фурье при появлении запроса выберите реального или виртуального образа. Баня (D) обработка позволяет для реконструкции по всему объему. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: появление реконструкций. Образы Serratia культуры на ~ 106 клеток/мл. (A) Raw голограммы. (B) Фурье. Область внутри круга является использоваться; остальные замаскирован. (C) амплитуды реконструкции в одной плоскости z. (D) этапа реконструкции в одной плоскости z; в баре масштаба показывает фазового сдвига в градусах. (E) максимум интенсивности проекции через все z самолеты в стеке фазы. (F) объем просмотра полной амплитуды стека (365 x 365 x 800 мкм). Шкалы бар = 35 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Концентрация [клеток / мл] | Необходимые кадры |
| 1.00E + 00 | 6686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Таблица 1: Минимальное количество необходимых образцов томов для обнаружения бактерий DHM (обнаружение доверия 50%).
| Недвижимость | Значение | Единица |
| Рабочая длина волны | 405 | Нм |
| Цель числовая апертура | 0,3 | - |
| Система увеличения | 20 | - |
| Латеральное разрешение | 0,7 | Мкм |
| Объем образца изображений | 360 x 360 x 800 | X μm x μm мкм |
| Длина инструмента | 400 | мм |
Таблица 2: Характеристики оптических и производительности для цифровой голографический Микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Численное реконструкция голограммы: численные реконструкции голограмм, используется метод угловой спектра (АНМ). Это включает в себя свертка голограмма с функция Грина для Вывинтить. Комплекс волновому изображения в частности фокальной плоскости можно рассчитать, используя Фурье импульсной Теорема следующим:
(1)
Где 
находится Фурье оператор, 
голограммы матрица, и 
– зеленый функция DHM, который определяется как:
(2)
Где 
расстояние вдоль оптической оси, желаемого фокальной плоскости будет реконструирован, 
волны освещения, 
и 
являются количество пикселей в x и y направлениях, соответственно, и 
и 
являются размеры пикселей (в плоскости детектор) в x и y направлениях, соответственно40.
От комплекса волнового фронта, интенсивность можно рассчитать величины брусковые 
, и фазы могут быть получены путем арктангенс частное между реальной и мнимой частями .
Модификации и устранение неполадок
Эксперименты с перечисления концентрации разреженных бактериальных очень чувствительны к загрязнению, ложных срабатываний и ложных негативов. По этой причине, роста и перечисление бактерий а также подготовку весьма разбавленных образцов для DHM являются важнейшие шаги в этом эксперименте. Необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать загрязнения в этом эксперименте, тщательно контролируя окружающей среды, где выращиваются и перечисленные бактерии. Методы надлежащего стерилизации, включая автоклавирования, предотвратить против загрязнения, а также ложных срабатываний. Для дальнейшего предотвращения против ложных срабатываний, бактерии были отобраны для этого эксперимента, который exhibit относительно уникальные характеристики (например, S. marcescens имеет очень четкие красный цвет, когда культивированный). Чтобы предотвратить против ложных негативов, бактерии, выбранный для этого эксперимента были отобраны таким образом, что они будут иметь возможность расти на обогащается культура плиты, а так же имеют характерной формы и/или подвижности шаблонов быть определены посредством Вывинтить. Важно периодически тест для загрязнения и/или неожиданные клеточный рост покрытие образцы и количественного определения бактерий графом пластины.
В проведении этого эксперимента, ожидается данных размером примерно 2,4 ГБ на 1 мл образца. Конечно, это число зависит от камеры и формат файла используется. Размер данных сообщили является использование 4 Mpx-детектор и стандартный формат файла TIFF. Пост-обработки данных требует примерно 6 мин вычислений на 1 мл образца. Это время обработки наблюдалось при использовании Intel i7 8-ядерный процессор частотой 3,5 ГГц и 32 ГБ ОЗУ. Эти вычисления можно распараллелить на GPU, значительно сократить время обработки, однако не было сделано здесь.
Ограничения метода
Хотя возможен с помощью DHM обнаружить очень низкие концентрации бактерий, этот метод является неспецифической. Морфология только не является убедительным средством выявления бактериальных штаммов. Диагностические приложения будут представлены конкретные проблемы из-за присутствия непромысловых клеток и агрегатов. Однако преимущество dual лучевой документа, представленные здесь, что это возможность изображения бактерий в относительно мутных образцов. Способность обнаруживать бактерий в клинических образцах, а также степень предварительной обработки образцов, что требуется, по-прежнему определяться.
Важнейшие шаги в протоколе
Шаг 2: Получение точных разведений имеет важное значение для количественных перечисления. Любое разведений сделал должны быть подкреплены пластины игр. Шаг 3: выбор скорости потока и соответствующую частоту кадров должны быть сделаны тщательно, чтобы рассматривать все клетки. Регулировка параметров насоса должны быть тщательно настроены перед выполнением предел обнаружения эксперимента. Шаг 4: для очень низкой концентрации бактериальных, важно захватить достаточно данных, чтобы быть уверенным, обнаружения. Это может быть необходимо восстановить некоторые данные, чтобы быть уверенным, что клетки, а не мусор, рассматриваются. В крайних случаях может потребоваться более 10 мл раствора. Non подвижные штаммы являются более склонны быть двусмысленным чем подвижные штаммов. Шаг 5: если есть какой-либо двусмысленности в данных, восстановления может помочь продемонстрировать, что голограмм представляют собой клетки и не мусор. Высоким разрешением реконструкции покажет морфологии классические клеток, и моторики ясно видно в треки подвижные штаммов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают, Гордон и Бетти Мур фонд грантов 4037 и 4038 на Калифорнийский технологический институт для финансирования этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
