Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Manuel Bedrossian; Casey Barr; Chris A. Lindensmith; Kenneth Nealson; Jay L. Nadeau

doi:10.3791/56343

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

Mikroorganizmaların düşük konsantrasyonlarda dijital holografik mikroskobu (DHM) kullanarak miktarının

Published: November 01, 2017

doi:

10.3791/56343

Manuel Bedrossian, Casey Barr, Chris A. Lindensmith, Kenneth Nealson, Jay L. Nadeau

¹Department of Medical Engineering,California Institute of Technology, ²Department of Earth Sciences,University of Southern California, ³Jet Propulsion Laboratory,California Institute of Technology

Summary

Dijital holografik mikroskobu (DHM) görüntüleme örnekleri 50-100 X daha aydınlık alan mikroskobu karşılaştırılabilir çözünürlükte odaklanarak daha kalın gerçekleştirilen son işlem sağlar hacimsel bir tekniktir. Burada DHM tanımlamak için sayma, kullanılır ve mikroorganizmalar, çok izleme yoğunluğu düşük ve optik yoğunluk ölçümleri, plaka sayısı ve doğrudan sayısı ile karşılaştırıldığında.

Abstract

Doğru tespit ve seyrek bakteriyel örnekleri sayma yiyecek, içecek ve ilaç işleme sanayi, birçok uygulamada tıbbi teşhis ve diğer gezegen ve uyduları güneş sisteminin robot görev tarafından hayatı algılama için vardır. Şu anda, seyrek bakteriyel örnekleri kültür kaplama veya epifluorescence mikroskobu tarafından dikkate alınır. Kültür plakaları gerektiren uzun kuluçka çarpı (gün hafta) ve epifluorescence mikroskobu geniş boyama ve örnek konsantrasyon gerektirir. Burada, eksen dışı dijital holografik mikroskobu (DHM) çok seyreltik kültürler (100-10⁴ hücre/mL) bakterilerde numaralandırmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. İlk olarak, özel DHM inşası, bir düşük maliyetli araç oluşturma hakkında ayrıntılı yönergeler ile birlikte ele alınmıştır. Holografi prensipleri ele alınmıştır ve istatistiksel bir modelini ne kadar videoları gerekir tahmin etmek için kullanılan araç optik performans özellikleri ve bakteriyel çözüm (Tablo 2) konsantrasyonu dayalı hücreleri, algılamak için olmak . Hücreleri video algılama 10,⁵, 10⁴, 10³ve 100 hücre/mL un restore edilmiş hologram kullanarak gerçek zamanlı olarak gösterdi. Genlik ve faz görüntüleri yeniden inşası bir açık kaynak yazılım paketi kullanarak gösterilmiştir.

Introduction

Birçok uygulamada doğru bakteri sayıları çok seyreltik örneklerinde belirlenmesi önemlidir: birkaç örnektir: su ve gıda kalite analiz¹^,²^,³; Kan, beyin omurilik sıvısı veya balgam⁴^,⁵patojenler tespiti; eczacılık ürünleri, steril su⁶dahil olmak üzere üretim; ve çevre toplum analiz açık okyanus ve çökeller⁷^,⁸^,gibi⁹oligotrofik ortamlarda. Orada da mümkün kaybolmamış mikrobiyal yaşam Jüpiter ve Satürn, özellikle Europa¹⁰^,¹¹ ve Enceladus¹²^,¹³^, buzlu aylar tespiti ilgi artmaktadır¹⁴, hangi yeraltı Sıvı okyanuslar var bilinmektedir. 1978 yılında Viking beri görev başka bir gezegende kaybolmamış hayat bulmaya çalıştı çünkü teknolojileri ve bakteriyel kimlik ve alan misyonlar¹⁵sırasında sayım için aygıtlar sınırlı gelişme oldu.

Plaka sayısı geleneksel yöntemlerle bulmak bir azınlık çevre suşları, türlerin bazen temsil edebilir yalnızca culturable hücreleri < %1¹⁶. Plakalar zorlanma bağlı olarak en fazla başarı için günlerce ya da haftalarca, kuluçka gerektirir. Epifluorescence mikroskobu büyük ölçüde hızlı ve doğru mikrobiyal numaralandırma için altın standart olarak plaka sayar yerini aldı. Nükleik asitler için bağlama nükleik asit etiketleme floresan boyalar ‘ 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR yeşil veya akridin turuncu gibi kullanılan tipik boyalar¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ vardır , birçok çalışma kullanın rağmen²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴Gram floresan göstergeleri imzalamak. Bu yöntemleri öncesi konsantrasyonu adımları olmadan kullanarak algılama (LoDs) sınırlarını ~ 10⁵ hücre mL başına yol açar. LoD gelişmeler filtrasyon kullanarak mümkündür. Vakum filtre-bir membran, genellikle polikarbonat ve siyah arka plan azaltmak için ideal bir sıvı örneğidir. Yukarıda belirtilen DNA lekeleri doğrudan filtre²⁵için uygulanabilir gibi düşük-arka plan boya. Doğru göz tarafından saymak, ~ 10⁵ hücre başına örnekleri ~ 10 mL başına⁵ hücre daha seyreltik Yani filtresi, gerekli olan, önemli örnek birimleri toplanan ve filtre. Lazer tarama aygıtları sistematik filtresi bütün bölgeleri keşfetmek ve böylece hücre sayım için ~ 10 mL²⁶başına² hücre aşağı algılama sınırlarını zorlayan gerekli sayısını azaltmak için geliştirilmiştir. Ancak, bunlar çoğu laboratuvarlarda kullanılamaz ve bakteri ve enkaz değil gelişmiş donanım hem de yazılım parçacıklar gözlenen uzman onayı izin vardır gerektirir.

Başvuru için kan zehirlenmesi olan yetişkinler genellikle belirtiler, gösterilen başlar < 100 hücre/mL kan ve bebekler de < 10 hücre/mL. Bir yetişkin gelen kan alımı 10 mL, alır ve bir bebek, 1 mL. PCR temelli yöntemleri varlığı ile insan ve patojenik olmayan flora DNA ve kan²⁷^,²⁸PCR inhibe bileşenlerinde tarafından inhibe. Ortaya çıkan teknikleri çeşitli rağmen kültürler kan dolaşımına enfeksiyonlar, özellikle içinde daha kırsal alanlarda ya da gelişmekte olan ülkelerden tanısında altın standart kalır. Diğer gezegenlerde hayat tespiti için termodinamik hesaplamalar hayat ve böylece beklenen olası Biyokütle enerji bütçesini tahmin edebilirsiniz. 1 – 100 hücre/mL Europa²⁹tarihinde thermodynamically makul olması bekleniyor. O kolayca bu sayılardaki miktarda sulu çözüm hücrelerin çok küçük sayılar tespiti önemli bir çözülmemiş sorun olduğunu görülebilir.

Bu yazıda, biz 10 konsantrasyonlarda Serratia marcescens ve Shewanella Corynebacterium (vahşi tipi ve hareketli mutant) algılama göstermek⁵, 10⁴, 10³ve bir eksen dışı kullanarak 100 hücre/mL Dijital holografik mikroskop (DHM). Anahtar DHM geleneksel ışık mikroskobu üzerinde kalın numune hacmi yüksek çözünürlükte eşzamanlı görüntüleme avantajdır — bu uygulamasında örnek odası 0.8 mm kalınlığında oldu. Bu örnek odaları tolerans ± 50 µm ile yumuşak litografi, polydimethylsiloxane (PDMS) bir hassas işlenmiş alüminyum kalıp üzerinden tarafından inşa edildi. Bu yüksek güçlü ışık mikroskobu alan derinliği yaklaşık 100-fold bir iyileşme gösterir. DHM optik yol uzunluğu (Ürün kalınlığı ve Kırılma indisi) ölçülerini izin nicel faz bilgi de sağlar. DHM ve benzer teknikler bakteri ve Maya hücre döngüsü ve bakteriyel kuru kitle³⁰^,³¹^,³²hesaplanması izlemek için kullanılmıştır; saçılma farklılıklar bile bakteri suşları³³ayırt etmek için kullanılır.

Kullandığımız enstrüman özel olarak daha önce yayımlanmış³⁴^,³⁵, mikroorganizmalar ile kullanmak için özel olarak oluşturulmuş ve onun tasarım ve inşaat gösterdi ve tartışıldı. Sulu çözümler sürekli bir 0,25 µL birim örnek odasına şırınga pompa ile sağlanır; akış hızı tüm numune hacmi görüntüleme sağlamak için kamera kare hızı tarafından belirlenir. İstatistiksel bir hesaplama hücreleri belirli bir konsantrasyon, önemli sayıda algılamak için yansıma gerekir örnek birim sayısı öngörür.

Hücre algılama uygulamaları için hologram yeniden inşası genlik ve faz görüntüler içine gerekli değildi; analiz ham hologram üzerinde gerçekleştirildi. Bu önemli miktarda Hesaplamalı kaynak ve disk alanı kazandırır: 500 Mb hologram video 1-2 ne zaman yeniden Tb olacak. Ancak, biz yeniden inşası ile derinlik hologram istenen tür temsil onaylamak için örnek tartışıyorlar. Bir önemli DHM yoğunluğu ve faz görüntüleri izlemek için onun yetenek özelliğidir. Yoğunluk (gibi birçok biyolojik hücreleri) neredeyse şeffaf organizmalar açıkça aşamasında görünür. Etiket içermeyen bir teknik olduğu gibi hiçbir boyalar kullanılır. Bu bir birdvantage boyalar bir görev şartları sağ çıkamayız beri mümkün uzay uçuşu uygulamalar için ve — daha da önemlisi — DNA veya RNA kodlamak için kullanamazsınız dünya dışı canlılar ile çalışmak için kabul edilemez. Da Arktik ve Antarktika, nerede boyalar uzak konuma getirmek zor olabilir ve depolama düşebilir gibi aşırı ortamlarda çalışmak için bir avantajdır. Görüntüleri yeniden inşası aşamasında ve genlik üzerinde GitHub (şampuan) kullanılabilmesini sağladığınız bir açık kaynak yazılım paketi veya ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.

Protocol

1. büyüme ve bakteri numaralandırma Not: Bu içinde uygun orta 36 büyüdü neredeyse herhangi bir bakteriyel zorlanma için geçerlidir. Bizim örneğimizde, biz üç suş kullanın: Serratia marcescens olarak bir ortak, kolay tanımlanabilir laboratuvar yük; ve daha küçük, son derece hareketli çevre zorlanma, Shewanella Corynebacterium Bay-1. Hafiye-in karşılaştırmak için hareketli hareketli olmayan hücreleri, hareketli Shewanella<…

Representative Results

Sonuçları canlı ve ölü bakteriler DHM tarafından çok düşük seviyelerde algılama yeteneğini gösterir. Sayılan bakteri sayısı Petroff-Hauser sayım odası ve plaka sayıları kullanarak elde edilen sonuçlar ile tutarlı olması gerekir. Standart istatistiksel yöntemler farklı algılama yöntemleri çeşitli bakteri konsantrasyonlarda doğruluğu hakkında bilgi sağlar. Şekil 1 Pet…

Discussion

Hologram sayısal yeniden inşası: hologram sayısal yeniden inşası için açısal spektrum yöntemi (ASM) kullanılır. Bu hologram DHM için Green fonksiyonu ile evrişim içerir. Belgili tanımlık imge vasıl belirli bir odak düzlem karmaşık wavefront Fourier evrişim teoremi istihdam ederek aşağıdaki gibi hesaplanabilir:

(1)

Nerede <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_up…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Gordon ve Betty Moore Vakfı Hibe 4037 ve bu eser finansmanı için California Institute of Technology için 4038 kabul edersiniz.

Materials

Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7710	Many options for purchase
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 cm Petri dishes	VWR	10053-704
15 mL culture tubes	Falcon (Corning Life Sciences)	352002	Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow	Nalgene	8000-0004	Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
Open-source software	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo

References

Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples – Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, . 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn’s moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. . Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).
Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
Hand, K. P. . Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).