Summary
디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.
Abstract
정확 하 게 감지 하 고 스파스 세균 샘플 세 의료 진단, 및 로봇 식 임무를 다른 행 성과 태양계의 위성에 의해 생활 탐지에 대 한 음식, 음료, 제약 공업, 많은 응용 프로그램 있다. 현재, 스파스 세균 샘플은 문화 도금 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 의해 계산 됩니다. 문화 접시 필요 오래 부 화 시간 (주 일) 하며 epifluorescence 현미경 광범위 한 얼룩 및 샘플의 농도. 여기, 꺼짐-축 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 매우 희석 문화 (100-104 셀/mL)에 박테리아를 열거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 사용자 지정 DHM의 건설 건물 저가 악기에 자세한 지침과 함께 설명 되어 있습니다. 홀로 그래피의 원리를 설명 하 고 통계 모델 동영상 해야 얼마나 오래 추정 하는 데 사용은 악기의 광학 성능 특성 및 세균 솔루션 (표 2)의 농도에 따라 셀을 검출 하 . 10 셀의 비디오 검색5, 104, 103및 100 셀/mL 유엔 재건된 홀로그램을 사용 하 여 실시간으로에서 설명 된다. 진폭 및 위상 이미지의 개조는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 보여 줍니다.
Introduction
매우 희석 샘플에 정확한 세균의 결정은 많은 응용 프로그램에서 중요 한: 몇 가지 예는 물과 식품 품질 분석1,,23; 혈액, 중추 신 경계, 또는 래4,5;에 병원 균의 검출 메 마른 물6;를 포함 하 여 제약 제품의 생산 그리고 오픈 바다와 퇴적 물7,,89같은 oligotrophic 환경에서 환경 지역 사회 분석. 또한 목성과 토성, 특히 유로 파10,11 , Enceladus12,13, 의 얼음 위성에 가능한 현존 미생물 생명의 검출에 대 한 관심 증가 14, 표면 액체 바다를 알려져 있습니다. 1978 년에서 바이킹 이후 아무 미션이 다른 행성에 현존 생활을 찾을 하려고, 때문에 기술 및 세균성 식별 및 공간 임무15동안 계산을 위한 계기의 한정 된 개발이 되었습니다.
판 수의 전통적인 방법의 찾을 culturable 셀만, 때로는 환경 긴장에 종의 소수를 표현할 수 있는 < 116. 플레이트 일 또는 외피의 주 변형에 따라 최대 성공을 위해 필요 합니다. Epifluorescence 현미경 검사 법은 신속 하 고 정확한 미생물 열거형에 대 한 황금 표준으로 크게 접시 계산을 대체 했다. 핵 산 라벨 형광 염료 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR 녹색 또는 acridine 오렌지 같은 핵 산을 바인딩하는 일반적인 염료 사용17,,1819 하지만 많은 연구를 사용 하 여 그램의 형광 표시기 서명20,,2122,,2324. ML 당 10 ~5 셀의 검출 (Lod)의 한계를 이끌어 전 농도 단계 없이 이러한 방법을 사용 하 여. LoD 향상 된 여과 사용 하 여 가능 하다입니다. 액체 샘플 막, 일반적으로 폴 리 카보 네이트를 이상적으로 줄이기 위해 배경 검정에 진공 필터링입니다. 저 배경 염료와 같은 위에서 언급 한 DNA 얼룩 필터25에 직접 적용할 수 있습니다. 눈으로 정확한 계산에 대 한 10 ~5 셀 필터, mL 당 10 ~5 셀 보다 더 희석 샘플에 대 한 즉 당 필요한, 중요 한 샘플 볼륨을 수집 하 고 필터링 해야 합니다. 레이저 검사 장치 필터의 모든 영역을 체계적으로 탐구 하 고 따라서 mL26당 10 ~2 셀 아래로 탐지의 한계를 밀고, 계산에 필요한 셀의 수를 줄이기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 이들은 대부분 실험실에서 사용할 수 있습니다 그리고 정교한 하드웨어 뿐 아니라 소프트웨어 전문가 확인 입자를 관찰 하는 허용 하 고 박테리아와 파편 하지.
참고로, 패 혈 증으로 성인 보통 시작에서 증상을 보여주는 < 셀/100ml의 혈액, 및에서 유아 < 10 셀/mL. 성인에서 혈액 무승부 소요 10 mL, 유아, 1 mL에서. PCR 기반 방법 인간과 비 병원 성 식물 DNA의 존재에 의해 및 혈액27,28구성 요소 PCR 억제 저해 됩니다. 다양 한 새로운 기술에도 불구 하 고 문화 전원 지역 또는 개발 도상 국가에서 특히 혈 류 감염의 진단에 대 한 황금 표준 남아 있습니다. 다른 행성에 생활의 탐지, 열역학 계산 생활을 따라서 예상된 가능한 바이오 매스 에너지 예산을 추정할 수 있다. 1-100 셀/mL 유로 파29에 열역학으로 합리적인 것으로 예상 된다. 그것은 쉽게 이러한 숫자에서 볼는 수성 해결책의 다량에 있는 세포의 아주 작은 숫자의 발견은 중요 한 미해결된 문제를 수 있습니다.
이 논문에서는, 10의 농도에서 Serratia marcescens 및 Shewanella oneidensis (야생 형 및 비 운동 돌연변이)의 탐지 설명5, 104, 103및 꺼짐-축을 사용 하 여 100 셀/mL 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) DHM의 주요 장점은 전통적인 가벼운 현미경 검사 법은 높은 해상도에서 두꺼운 샘플 볼륨의 동시 영상-이 구현에서 샘플 챔버는 0.8 m m 두께. 이러한 샘플 챔버는 소프트-리소 그래피입니다 (PDMS) 정밀 가공 알루미늄 몰드에서의 허용 오차는 ± 50 µ m에 의해 건설 되었다. 이 고 전력 가벼운 현미경 검사 법을 통해 필드의 깊이에 약 100 개선을 나타냅니다. 또한 DHM 광학 경로 길이 (굴절률과 두께의 제품)의 측정에 대 한 허용 하 양적 위상 정보를 제공 합니다. DHM와 유사한 기술을 사용 되었습니다 모니터링 박테리아와 효 모 세포 주기 및 세균 건조 질량30,,3132;의 계산 산란 차이점도 세균성 긴장33을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.
우리가 사용 하는 악기 이전 게시34,35, 미생물와 함께 사용 사용자 이며 그것의 디자인 및 건축 시연 및 설명. 수성 솔루션 통해 주사기 펌프; 0.25 µ L 볼륨 샘플 챔버에 지속적으로 공급 된다 흐름 율은 전체 샘플 볼륨의 이미지를 보장 하기 위해 카메라 프레임 속도 의해 결정 됩니다. 통계 계산 주어진된 농도에서 세포의 상당수를 탐지 하기 위해 몇 군데 해야 합니다 샘플 볼륨의 수를 예측 합니다.
셀-감지 응용 프로그램 진폭 및 위상 이미지에 홀로그램의 재건은 필요; 분석은 원시 홀로그램에서 수행 되었다. 이 저장 계산 리소스 및 디스크 공간: 500mb 홀로그램 비디오 1-2 결핵 때 재건 될 것입니다. 그러나, 우리는 홀로그램 원하는 종 나타내는 확인 하는 샘플의 깊이 통해 재건 논의 할. DHM의 중요 한 기능 강도 및 이미지의 단계를 모니터링 하는 기능입니다. 강도 (예: 대부분의 생물 세포)에 거의 투명 한 유기 단계에서 명확 하 게 표시 됩니다. 그것은 레이블 없는 기술, 아니 염료 사용 됩니다. 이 한가능한 우주 비행 용, 염료는 임무의 조건을 살아날 수 있습니다 이후 dvantage 및-더 중요 한 것은-외계 생물, 인코딩에 대 한 DNA 또는 RNA를 사용 하지 않을 수 있습니다 작업으로 간주 될 수 없습니다. 북극과 남극, 염료 원격 위치를 데 려 어려울 수 있습니다 및 저장 시 저하 될 수 있습니다 같은 극한 환경에서 작업에 대 한 장점 이기도 합니다. 위상 및 진폭으로 이미지의 개조는 우리가 만든 사용할 수 GitHub (샴푸)에 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 성장과 열거형의 박테리아
참고: 이것은 적절 한 매체 36에서 자란 거의 모든 세균성 긴장에 적용 됩니다. 우리의 예제에서 우리는 세 사용: Serratia marcescens 일반적인, 쉽게 식별 연구소 스트레인;로 그리고 작은, 높게 운동 환경 부담, Shewanella oneidensis 미스터-1. 비교의 비 운동 세포, 비 운동 Shewanella 돌연변이, Δ 대 운동 FlgM, 또한 사용 된다 비교 37. 모든 변종 lysogeny 국물 (파운드)에서 재배 됩니다.
- 살 균 파운드 매체 (증류수의 리터 당: 10 g bacto tryptone, 10 g NaCl bacto 효 모 5 g, 필터 또는 오토 클레이 브). 표준 100mm 직경 파운드-한 천 격판덮개 (동일한 매체 플러스 리터 당 15 g 한 천 제조 법, 오토 클레이 브 (121 ° C, 20 분) 소독을 때 충분히 처리할 멋진 부)를 준비 합니다. 냉장고에 매체 및 접시를 저장.
- Micropipette와 챔버로 전송 undiluted 문화 10 µ L 샘플을 추출.
- 40 X (63 X 나 0.7-0.8) 높은 건조 객관적인 현미경 이미지 단계 대조를 사용 하 여.
- 계산 20 사각형에 평균 박테리아.
참고: 사각형만 그 건너 상단 왼쪽된 경계 (또는 아래쪽 그리고 당신이 선호 하는 경우에 오른쪽) 내에서 전적으로 박테리아만을 계산 합니다. 사각형은 여러 줄으로 구분 됩니다, 하나를 경계로 선택. - 20의 평균으로 계산 농도 희석 요인 x 사각형. 직접 수 농도 위해 잘 작동 하지 않습니다 참고 < 10 7 / mL.
- 만들어 살 균 0.9% 식 염 수와 함께 선택한 세균 샘플의 각각의 직렬 희석 솔루션. 20 µ L 세균성 솔루션의 전송 및 180 µ L 식 염 수로 희석. 가장 낮은 농도 10 ~ 3 셀/mL 때까지 반복.
- 희석 제안 하는 적어도 2 걸릴 100 µ L 10은 3과 10 4 /mL — 및 적절 한 고체 미디어 접시에 접시. 살 균 분산기로 퍼졌다. 각 희석의 3 복제 수행.
- 하룻밤 또는 식민지 성장 때까지 당신의 박테리아에 대 한 적절 한 온도에서 품 어.
- 식민지 고 콜로 니 형성 단위 (CFU) (# x 희석 요소 식민지)에 따라 계산 / 볼륨 도금 CFU/mL =. CFU는 복제 평균.
2. DHM 높은 희석 샘플의 준비
DHM와 게시물 DHM의 계산에 대 한 마스터의- 확인 직렬 희석 문화 파운드 미디어 판에 콜로 니 형성 단위 (참조 1.4.1-1.4.4). 이 이중 맹 검을 수행 하므로 사람이 녹음을 하 고는 각 측정 샘플에서 농도의 인식 하지 못합니다.
- 셀의 농도 실험 기간 동안 분명 변경 되지 않습니다 있도록
- 적절히 운동 장려 되지만 세포 분열을 억제 하는 최소한의 매체의 10-15 mL에 박테리아를 희석. 이 0.9% 식 염 수 또는 좀 더 구체적인 운동 성 매체 수 있습니다. 예를 들어 대장균에 사용 하 여, 운동 성 매체 EDTA 38를 포함 해야 합니다. 이러한 예제에 대 한 우리는 0.9% 식 염 수를 사용.
3. DHM 비디오
- 관심의 희석의 약 10 mL에 당겨 멸 균 주사기를 사용 하 여,.
- 살 균이 음 쇠를 사용 하 여 및 튜브 DHM 샘플 챔버에 주사기를 연결.
참고: 맞춤 미세 챔버 악기의 광학 경로 통해 샘플의 일관 된 흐름을 허용 하기 위하여 건설 되었다. 자세한 내용은 결과 섹션을 참조. 실험 전에 압력가 마로 소독에 의해 시료 챔버의 모든 구성 요소를 소독. - 흐름 지속적으로 주사기 펌프를 사용 하 여 샘플 챔버를 통해 주사기에서 샘플.
참고: 적절 한 유량 유체 채널 크기, 원하는 처리량 뿐만 아니라 데이터 수집 제한에 따라 다릅니다. - 샘플 샘플 챔버를 통해 흘러 서 적절 한 프레임 속도로 연속적으로 홀로그램을 획득 합니다. 시간 스탬프 파일 데이터 분석 (프로토콜 섹션 4) 동안 나중에 사용할 수 있는 로그 각 이미지의 시간 캡처 생성 됩니다. 상 온 (23 ° C)에서 모든 홀로그램을 얻을. 카메라 제조업체에서 제공 하는 미리 작성 된 c + + 실행 파일을 실행 하 여 홀로그램 기록.
참고: 적절 한 프레임 속도 선택 흐름 속도 따라 다릅니다. 이 실험에 대 한 것이 좋습니다 그런 박테리아의 이미지를 만든 것 이다 프레임 속도 사용 하 여 > 악기에 걸쳐 여행으로 2 회 ' s 시야. - 는 DHM 통해 이동 하는 샘플의 전체 10 mL에 대 한 충분 한 시간.
- 박테리아 성장 하지 또는 접종 실험을 하는 동안 죽어 농축 보낸된 미디어 게시물 DHM 이미지 캡처의 100 µ L 미디어 접시. 살 균 분산기와 확산 하 고 24 시간;에 대 한 적절 한 온도에서 품 어 현재 식민지 계산.
4. 셀 밀도 및 검출 한계의 계산
- 박테리아의 존재에 대 한 데이터를 분석 하는 인수 홀로그램 동영상.
- 홀로그램의 시계열에 대 한 중간 픽셀 값 계산 다음 홀로그램에 고정 제거할 각 각 픽셀에서이 중간 값을 뺍니다. 이 ImageJ에서 다음 단계를 수행 하 여 수행할 수 있습니다:
- 32-비트 (이미지-형식-32 비트) 변환
- 계산 (이미지-스택-Zproject-중간) 중간
- 스택 (의 나머지 부분에서 평균을 뺍니다 Process-ImageCalculator-Subtract)
- 보이는 공기 반지 및 초점에서 셀의 개수 수동으로. ImageJ에 이렇게 포인트 도구로 개체를 가르키고.
- 홀로그램의 각 시리즈 (홀로그램 수집의 시간에서 기록 된) 시간 스탬프 파일을 동반 될 것 이다. 사용 시간 스탬프 파일을 계산 하는 샘플의 총 양을 펌핑 당시 이미지 체포 됐다.
- 홀로그램의 시계열에 대 한 중간 픽셀 값 계산 다음 홀로그램에 고정 제거할 각 각 픽셀에서이 중간 값을 뺍니다. 이 ImageJ에서 다음 단계를 수행 하 여 수행할 수 있습니다:
- 샘플 이미지의 전체 볼륨에 의해 감지 하는 세포의 총 수를 나누어 세포 밀도 계산. 정확한 통계에 대 한 5-10 프레임 평균.
5. 진폭 및 위상 재건 이미지
프레임 당 10-200 셀- 선택 대표 동영상. 재구성 소프트웨어에 원시 (중간 감 하지) 홀로그램을 로드 (예: ImageJ 숫자 전파 39; [GitHub] 샴푸).
- ImageJ를 사용 하 여, OD 숫자 전파 숫자 회절 이동.
- 프롬프트에서 푸리에 마스크 실제 또는 가상 이미지를 선택 하 고 모든 정현파 잡음 기능 제거를 그립니다.
- 재건 거리를 입력 하 여 진폭과 위상 적절 한 z-단계에서 재구성.
- Median 진폭 데이터 4.1.1에서 소음을 줄이기 위해 빼기.
- 3D 플롯 데이터 큐브 또는 프로젝션. 플러그인에가 서 — 볼륨 뷰어.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
결과 DHM로 매우 낮은 수준에서 생활 하 고 죽은 박테리아를 감지 하는 능력을 표시 해야 합니다. 계산 하는 박테리아의 수는 Petroff 하우저 세 실과 접시 수를 사용 하 여 얻은 결과와 일관 되어야 합니다. 표준 통계 방법을 다양 한 세균성 농도에서 다른 검출 방법의 정확성에 대 한 정보를 제공합니다.
그림 1 에서는 세포의 직접 열거형에 사용 되는 세 실의 미세 뿐만 아니라 사용 Petroff 하우서 세 챔버. 그림 2A 보여줍니다 충분 한 허용 된 전형적인 풍부한 문화 접시 S. marcescens 식민지 (상 온에서 16 시간) 성장에 대 한 시간. 그림 2B 사용 하는 모든 종자에 대 한 성장 곡선을 보여 줍니다. OD600 와 식민지 수 사이의 관계 선형 분 광 광도 계;의 신뢰할 수 있는 범위 내에서 해야 정확한 분 광 광도 측정 다, 우리가 측정 ~ OD600 = 0.1 ~ 108/mL으로. 직접 Petroff 하우서 계산 하 고 식민지 수 셀까지 10% 매출 성장 곡선에 의해 본 죽을 시작 하기로 한다.
그림 3 사용자 지정 샘플 챔버의 설계를 보여준다. 사용자 지정 미세 챔버 홀로그램 현미경의 시야를 통해 샘플의 지속적인 흐름을 허용 하도록이 실험을 위해 사용 되었다. 표준 미세 기술과 재료 샘플 챔버의 건설에 사용 되었다. 무뚝뚝한 스쳐 스테인리스 바늘 남성 루어 록 피팅 샘플 챔버에 입구 및 출구 포트를 제공 하기 위해 미세 장치에 삽입 했다. 미세 채널 형상입니다 (PDMS) 알루미늄 프레임을 통해 압축 된, 가공된 알루미늄 마스터 몰드를 사용 하 여 두 개의 광학 질 유리 창문 사이 소프트 리소 그래피에 의해 설립 되었다. PDMS 흐름 채널 형상 설정으로 보호 하는 피하 주사 바늘, 유체 수송 흐름 채널에서 제공 하는. 이러한 샘플 챔버 PDMS를 사용 하 여 흐름 채널 기하학을 확립 하 고 따라서 악기의 광학 경로에 아무 PDMS를 포함에. 꺼짐-축 홀로그램 현미경의 광학 특성, 두 개의 마이크로 채널 성형 했다 참고 서로 평행 하 게 샘플 실에서. 이 간섭계 ('표본'과 '참조' 팔 라고 함)의 두 팔 사이의 광 경로 길이 맞게 것입니다. 참고 채널 메 마른 매체, 포함 하 고 흐름에 따라 해서는 안.
그림 4 는 실험실 구현에는 회로도 디지털 홀로그램 현미경의 이미지를 보여준다. 그것은 카메라와 함께 제공 하는 소프트웨어에 의해 운영 한다. 그림 5 에서는 세균성 열거와 보기의 필드 당 셀의 예상된 번호와 그들의 통신 대표 DHM 데이터. 재건, 없이 원시 홀로그램에서 보고 하 고 중간 빼기와 수동 추적 셀 가능 하다. 이 크게에 비해 모든 z-비행기, 재구성 원시 홀로그램 챔버의 깊이 걸쳐 셀 표시 계산 부담을 줄일 수 있습니다. 다른 농도 격판덮개 조사 및 Petroff 하우저 카운트와 그들의 통신에서 문화의 모양을 표시 됩니다. 총 셀 개수는 셀 이미지가 포함 된 볼륨의 총 수에 각 샘플의 볼륨에 본 수를 평균 하 여 결정 됩니다. 탐지의 한계는 몇 군데 샘플 볼륨의 총 수에 의해 결정 됩니다. 이 실험에서 우리는 10ml 단위로 0.25 µ L (샘플 당 40000 이미지의 총) 몇 군데 샘플의 최대 총이 값에 최대 한도 설정 합니다. 셀은 20 프레임의 시리즈를 통해 각 프레임에서 명확 하 게 관찰 하는 경우 최대 총 볼륨 이루어집니다 전에 녹음 중지 됩니다. 이전에 신문에서 우리 보고 샘플 볼륨 1-105 셀/mL (표 1)에서 배열 하는 농도에서 50%의 신뢰도에서 박테리아를 검출 하는 데 필요한 수 추정에 대 한 수식. 이 견적을 바탕으로, 모든 40000 프레임의 검사 허용 합니다 1/mL에서 세포의 검출이 계산은 계산 집약적 이지만.
그림 6 개조 소프트웨어 (피지)39의 사용을 보여준다. 단일 홀로그램 열리고 소프트웨어 "OD 숫자 전파 숫자 회절" 실행 됩니다. 이미지 매개 변수 대화 상자;에 부여 됩니다. 진폭, 강도 및 위상 수 있습니다 모두 개축 될. 하나의 z 평면을 선택할 수 있습니다, 또는 일괄 개조 전체 깊이 재구성 하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 7 선택 된 샘플에서 다른 깊이 진폭 및 위상 이미지 복원을 보여준다. 생성 된 복원 하는 데 사용 하는 푸리에 마스크 중간 감 강도 이미지, 단계 이미지, 위상 스택을 통해 최대 투영 및 강도 스택의 볼륨 투영 표시 됩니다.
그림 1: 세균성 세포의 세 직접. 셀/mL에서 세균 농도 챔버를 세 고 그 숫자 회계 Petroff 하우저 상공 20만 포함 되어 있다는 사실에 대 한 확장에서 박테리아의 총 수를 계산 하 여 계산 됩니다 샘플의 nL. (A)는 Petroff 하우서 챔버를 계산. (B) 계산의 이미지 상자 서로 다른 크기의 다양 한 크기의 셀을 열거 하는 데 유용 보여주는 단계 대조, X 10에서 미세 챔버. S. marcescens 세 챔버 작은 상자; 내에서 (C) 외관 단계 대조 X 40입니다. (D) 메서드는 계산에 대 한 셀 위쪽 및 오른쪽 가장자리 (N), 하지만 하지 아래쪽과 왼쪽 가장자리 (Y)에 떨어지는 제외 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 셀 식민지 성장 및 광학 밀도 계산. (A) S. marcescens 16 시간 동안 실 온에서 incubated. 올바른 희석에 문화 접시 해야정확한 계산 및 통계에 대 한 20-200 식민지 있다. 표시 된 접시는 다소 너무 신뢰할 수 있는 계산을 위해 혼잡. (B) 성장 곡선 사용 3 변종에 대 한. ~ 108 셀/mL, 0.1의 광학 밀도 일치 하지만 정확한 값은 악기에 따라 다. 직접 Petroff 하우저 카운트 선형 성장 범위 내에서 10% 이내를 판 수에 동의합니다. 오차 막대는 5 독립 샘플의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 챔버 디자인 샘플. (A) 미세 도식 (견본 및 참조 microchannels 표시). (B) 완벽 하 게 조립된 샘플 챔버. (C) 폭발 CAD를 샘플 챔버의 구성 요소를 보여주는 볼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 회로도 및 디지털 홀로그램 현미경의 이미지. (A) 회로도 보여주는 4 가지 주요 요소: 소스, 샘플 (견본 경로 규격 표시와 참조 경로 참고 표시 됩니다), 현미경, 그리고 센서. (B)는 하드웨어의 솔리드 모델. 섬유 공급 소스 어셈블리, 하단 이며 이미징 카메라 맨은. 두 개의 비구 면 렌즈 및 릴레이 렌즈-구성-현미경 광학 300mm 긴 렌즈 튜브 안에 포함 되어 있습니다. 소스 사이 3 축 단계 현미경 광학의 연구에서 표본 쉬운 수동 조작을 제공합니다. (C)는 실험실에서 악기의 사진. 눈금 막대는 이미지의 하단 부분에 1 인치를 나타냅니다. 설계도에서 월 러 스 그 외 여러분 다시 그려집니다. 34. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 성장 곡선 및 대표 DHM 데이터. (A) 예측 365 µ m x 365 µ m의 샘플 볼륨 기반 보기의 필드 당 세포 1 m m x. DHM 열거형에 대 한 최적의 범위는 사각형에 표시 됩니다 및 실제 샘플 (B)로 표시 됩니다 및 (C). Shewanella 의 (B) DHM 홀로그램 문화 8 × 105 셀/mL Petroff 하우저 하 여 측정 및 7.7 x 10에5 셀/mL 격판덮개 조사;에 의해 측정 된 이 이미지는 110 셀, 우수한 맞춤 예측을 보여줍니다. Shewanella 문화 2.0 ± 0.1 x 105 셀/mL Petroff 하우저와 2.0 ± 0.3 x 105 셀/mL 격판덮개 조사;에 의해 측정 된 측정에서 (C) DHM 홀로그램 이 이미지는 27 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대 = 35 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 복원 수행. (A) 오픈 피지에 홀로그램. (B) 실행 숫자 전파 파장 및 이미지 크기를 입력 하십시오. 시작 하는 0에 가까운 z 거리를 선택 합니다. (C) 그릴 푸리에 마스크 실제 또는 가상 이미지를 선택 하 라는 메시지가 나타나면. (D) 목욕 처리 볼륨에 걸쳐 개조에 대 한 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 개조의 모습. 10 ~6 셀/mL에서 Serratia 문화 이미지. (A) 원시 홀로그램입니다. (B) 푸리에 변환. 원 내부 영역은 영역을 사용할 수; 나머지는 마스크. (C) 단일 z-평면에서 진폭 재건. (D) 하나의 z-비행기;에 재건 단계 눈금 막대도에서 위상 변화를 보여준다. (E) 최대 단계 스택의 모든 z-비행기를 통해 강도 프로젝션. (F) 볼륨 전체 진폭 스택 (800 µ m x 365 x 365)의 볼. 눈금 막대 = 35 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 농도 [mL 당 셀] | 프레임 필요 |
| 1.00E + 00 시 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 월 | 67 |
| 1.00E + 03 월 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 년 | 1 |
표 1: DHM (50%의 탐지 신뢰)에 의해 박테리아 검출에 필요한 샘플 볼륨의 최소 번호.
| 속성 | 값 | 단위 |
| 운영 파장 | 405 | nm |
| 객관적인 숫자 조리개 | 0.3 | - |
| 시스템 확대 | 20 | - |
| 수평 해상도 | 0.7 | Μ m |
| 샘플 영상 볼륨 | 360 x 360 x 800 | Μ m x μm x μm |
| 장비 길이 | 400 | mm |
표 2: 디지털 홀로그램 현미경에 대 한 광학 및 성능 사양.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
홀로그램의 수치 재건: 홀로그램의 숫자 재건, 각도 스펙트럼 방법 (ASM) 사용 됩니다. 이 DHM의 그린의 기능으로 홀로그램의 회선을 포함 한다. 특정 초점면에서 이미지의 복잡 한 wavefront 푸리에 회선 정리를 다음과 같이 채용 하 여 계산할 수 있다:
(1)
어디 
는 푸리에 변환 연산자 
홀로그램 매트릭스와 
은 그린의 기능으로 정의 되는 DHM의:
(2)
어디 
개축 될 원하는 초점 비행기의 광학 축 거리는 
조명 파장은 
및 
x에서 픽셀의 수와 y 방향 각각, 및 
와 
x 및 y 방향, 각각40픽셀 크기 (검출기 평면)에 있는.
복잡 한 파도 앞에서 강도 크기의 제곱에 의해 산출 될 수 있다 
, 위상의 가상 및 실제 부품 사이 몫의 아크탄젠트 값에 의해 얻어질 수 있다 .
수정 및 문제 해결
스파스 세균 농도의 열거와 관련 된 실험 높게 오염, 잘못 된 반응과 거짓 제외를 따르게 됩니다. 이런이 이유로, 성장 및 박테리아의 열거, DHM 매우 희석 샘플의 준비가이 실험에서 중요 한 단계가 있습니다. 주의 환경 박테리아는 성장 하 고 열거를 신중 하 게 제어 하 여이 실험에서 오염 방지로 이동 해야 합니다. 적절 한 살 균 기술, 압력가 마로 소독를 포함 하 여를 사용 하면 오염 뿐만 아니라 잘못 된 반응에 대해 방지할 수 있습니다. 추가 방지 하기 위해 잘못 된 반응에 대 한 박테리아는 상대적으로 고유한 특성 (예를 들면, S. marcescens 는 경작 하는 때 매우 독특한 붉은 색)이이 실험에 대 한 선정 됐다. False 네거티브에 대 한 방지 하기 위해이 실험을 위해 선택 하는 박테리아는 풍부한 문화 접시에 성장 하 고 독특한 모양 또는 DHM 통해 식별 운동 패턴 수 선정 됐다. 그것은 주기적으로 샘플을 도금 고 접시 수는 박테리아를 측정 하 여 오염 및 예기치 않은 세포 성장에 대 한 테스트 해야 합니다.
이 실험을 실시, 샘플의 1 mL 당 약 2.4 g B의 데이터 크기 전망 이다. 이 수는 물론, 사용 하는 카메라와 파일 형식에 따라 달라 집니다. 보고 된 데이터 크기는 4 Mpx 검출기 및 표준 TIFF 파일 형식 사용입니다. 데이터의 후 처리 샘플의 1 mL 당 계산의 약 6 분 필요합니다. 이 처리 시간이 3.5 g h z와 RAM의 32 기가바이트 인텔 i7 8-코어 프로세서를 사용 하는 동안 관찰 되었다. 이러한 계산 크게 처리 시간이 감소 하지만 여기 다 되지 않았습니다 GPU를 병렬화 할 수 있습니다.
기술의 한계
DHM을 사용 하 여 박테리아의 매우 낮은 농도 검출 하는 것이 가능한 동안이 메서드는 관련 되지 않은. 혼자 형태학 세균성 긴장을 식별 하는 결정적인 수단 아니다. 진단 응용 프로그램 비 표적 세포 및 집계의 존재로 인해 구체적인 과제를 발표할 예정 이다. 그러나, 여기에 제시 된 듀얼 빔 악기의 장점은 상대적으로 탁 한 샘플 이미지 박테리아 수는 것. 임상 샘플 및 필요한 샘플의 전처리의 정도에서 박테리아를 감지 하는 능력 결정에 남아 있다.
프로토콜의 중요 한 단계
2 단계: 정확한 희석 얻는 양적 열거형에 필수적 이다. 만든 모든 희석 접시 수를 백업 해야 합니다. 3 단계: 유량과 해당 프레임 속도 모든 셀은 볼 수 있도록 신중 하 게 이루어져야 합니다. 펌프 매개 변수 조정 한다 검출 실험의 한계를 수행 하기 전에 신중 하 게 조정 됩니다. 4 단계: 매우 낮은 세균 농도, 그것 감지의 자신감 충분 한 데이터를 캡처 중요 하다. 그것은 특정 셀, 그리고 하지 파편을 볼 되 고 있습니다를 일부 데이터를 재구성 해야 합니다. 극단적인 경우, 솔루션의 10 mL 이상 필요할 수 있습니다. 비 운동 긴장 운동 긴장 보다 모호한 될 가능성이 더 높습니다. 5 단계: 데이터에 어떤 모호한 경우 재건 홀로그램 셀 나타내고 하지 파편을 입증 하는 데 도움이. 고해상도 개조 전형적인 세포 형태학, 표시 됩니다 그리고 운동 성 운동 긴장의 트랙에서 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 고 든과 베티 무어 재단 보조금 4037 4038 자금이 작품에 대 한 캘리포니아 기술 연구소를 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
