कम सांद्रता पर सूक्ष्मजीवों को बढ़ाता डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी (DHM) का उपयोग
Summary
डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी (DHM) एक volumetric तकनीक है कि इमेजिंग नमूनों की अनुमति देता है 50-तुलनीय संकल्प पर brightfield माइक्रोस्कोपी से मोटे 100X, के साथ प्रदर्शन के बाद प्रसंस्करण केंद्रित । यहाँ DHM की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है, गिनती, और बहुत कम घनत्व पर सूक्ष्मजीवों ट्रैकिंग और ऑप्टिकल घनत्व माप, प्लेट गिनती, और प्रत्यक्ष गिनती के साथ तुलना में.
Abstract
सही का पता लगाने और गिनती विरल जीवाणु नमूनों भोजन में कई आवेदन किया है, पेय, और दवा प्रसंस्करण उद्योगों, चिकित्सा निदान में, और अन्य ग्रहों और सौर प्रणाली के चंद्रमाओं के लिए रोबोट मिशन द्वारा जीवन का पता लगाने के लिए. वर्तमान में, स्पार्स बैक्टीरियल नमूनों संस्कृति चढ़ाना या epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा गिना रहे हैं । संस्कृति प्लेट लंबी गर्मी समय (सप्ताह के दिनों) की आवश्यकता है, और epifluorescence माइक्रोस्कोपी व्यापक धुंधला और नमूने की एकाग्रता की आवश्यकता है । यहां, हम प्रदर्शन कैसे बंद धुरी डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM) का उपयोग करने के लिए बहुत पतला संस्कृतियों में बैक्टीरिया की गणना (100-104 कोशिकाओं/ सबसे पहले, कस्टम DHM के निर्माण पर चर्चा की है, साथ एक कम लागत साधन के निर्माण पर विस्तृत निर्देश के साथ । होलोग्रफ़ी के सिद्धांतों पर चर्चा कर रहे हैं, और एक सांख्यिकीय मॉडल का अनुमान लगाने के लिए कितनी देर वीडियो कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाना चाहिए, उपकरण के ऑप्टिकल प्रदर्शन विशेषताओं और बैक्टीरियल समाधान की एकाग्रता (तालिका 2) के आधार पर . 105, 104, 103, और १०० कोशिकाओं/एमएल में कोशिकाओं के वीडियो का पता लगाने के संयुक्त राष्ट्र के पुनर्निर्माण होलोग्राम का उपयोग कर वास्तविक समय में प्रदर्शन किया है । आयाम और चरण छवियों का पुनर्निर्माण एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।
Introduction
बहुत पतला नमूनों में सटीक जीवाणु गिनती का निर्धारण कई अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण है: कुछ उदाहरण पानी और खाद्य गुणवत्ता विश्लेषण कर रहे हैं1,2,3; रक्त, मस्तिष्कमेरु द्रव, या थूक4,5में रोगजनकों का पता लगाने; दवा उत्पादों का उत्पादन, बाँझ पानी सहित6; और खुले महासागर और तलछट7,8,9के रूप में oligotrophic वातावरण में पर्यावरण समुदाय विश्लेषण । बृहस्पति और शनि के बर्फीले चंद्रमाओं पर संभव वद्यमान माइक्रोबियल जीवन का पता लगाने में भी रुचि बढ़ रही है, विशेष रूप से यूरोपा10,11 और Enceladus12,13, 14, जो उपसतह तरल महासागरों के लिए जाना जाता है । क्योंकि १९७८ में वाइकिंग के बाद से कोई मिशन के लिए एक और ग्रह पर वर्तमान जीवन खोजने का प्रयास किया है, वहां बैक्टीरियल पहचान के लिए प्रौद्योगिकियों और उपकरणों के सीमित विकास किया गया है और अंतरिक्ष मिशन के दौरान गिनती15।
थाली गिनती के पारंपरिक तरीकों केवल बंजरभूमि कोशिकाओं है, जो पर्यावरण उपभेदों में प्रजातियों में से एक अल्पसंख्यक का प्रतिनिधित्व कर सकते है लगता है, कई बार & #60; 1%16। प्लेट दिन या अधिकतम सफलता के लिए, तनाव पर निर्भर करता है की मशीन के सप्ताह की आवश्यकता है । Epifluorescence माइक्रोस्कोपी मोटे तौर पर तेजी से और सटीक माइक्रोबियल गणन के लिए सोने के मानक के रूप में प्लेट गिनती की जगह है । न्यूक्लिक-एसिड-इस तरह के 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR ग्रीन, या acridine नारंगी कि न्यूक्लिक एसिड के लिए बांध के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों लेबल कर रहे है विशिष्ट रंजक इस्तेमाल किया17,18,19 , हालांकि कई अध्ययनों से ग्राम साइन20,21,22,23,24के फ्लोरोसेंट संकेतक का उपयोग करें । पूर्व एकाग्रता चरणों के बिना इन तरीकों का उपयोग करना पता लगाने की सीमा की ओर जाता है (LoDs) के ~ 105 प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं । लोद में सुधार निस्पंदन का उपयोग कर संभव हैं । एक तरल नमूना वैक्यूम-एक झिल्ली पर फ़िल्टर, आमतौर पर पाली कार्बोनेट और आदर्श पृष्ठभूमि को कम करने के लिए काला है । इस तरह के डीएनए के दाग के रूप में कम पृष्ठभूमि रंजक फिल्टर25के लिए सीधे लागू किया जा सकता है । आंख से सटीक गिनती के लिए, ~ 105 कोशिकाओं के प्रति फ़िल्टर की आवश्यकता है, जिसका मतलब है कि नमूनों के लिए अधिक से अधिक पतला ~ प्रति मिलीलीटर 105 कोशिकाओं, महत्वपूर्ण नमूना मात्रा एकत्र और फ़िल्टर किया जाना चाहिए. लेजर स्कैनिंग उपकरणों के लिए व्यवस्थित फिल्टर के सभी क्षेत्रों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है और इस तरह की गिनती के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करने, नीचे का पता लगाने की सीमा को धक्का ~ एमएल26प्रति 102 कोशिकाओं । हालांकि, इन सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं, और परिष्कृत हार्डवेयर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सॉफ्टवेयर है कि अनुमति विशेषज्ञ पुष्टि है कि मनाया कणों बैक्टीरिया और नहीं मलबे हैं परमिट की आवश्यकता है ।
संदर्भ के लिए, पूति के साथ वयस्कों आमतौर पर & #60 पर लक्षण दिखाने शुरू; १०० कोशिकाओं/एमएल रक्त, और शिशुओं पर & #60; 10 कोशिकाओं/ एक वयस्क से एक रक्त ड्रा 10 मिलीलीटर लेता है, और एक शिशु से, 1 मिलीलीटर । पीसीआर आधारित तरीकों मानव और गैर रोगजनक वनस्पति डीएनए की उपस्थिति और पीसीआर द्वारा बाधित कर रहे है रक्त में बाधा घटकों27,28। उभरती हुई तकनीकों की एक किस्म के बावजूद, संस्कृतियों खून के संक्रमण के निदान के लिए सोने के मानक, विशेष रूप से अधिक ग्रामीण क्षेत्रों या विकासशील देशों में रहते हैं । अंय ग्रहों पर जीवन का पता लगाने के लिए, ऊष्मा गणना जीवन के लिए ऊर्जा बजट का अनुमान है और इस तरह संभव बायोमास की उंमीद कर सकते हैं । 1-100 कक्ष/एमएलयूरोपा29 पर ऊष्मा उचित होने की संभावना है । यह आसानी से इन नंबरों से देखा जा सकता है कि जलीय समाधान की बड़ी मात्रा में कोशिकाओं की बहुत छोटी संख्या का पता लगाने एक महत्वपूर्ण अनसुलझी समस्या है ।
इस पत्र में, हम 105, 104, 103, और १०० कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर Serratia marcescens और Shewanella oneidensis (वंय-प्रकार और गैर-gram उत्परिवर्ती) का पता लगाने का प्रदर्शन एक ऑफ-एक्सिस डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM) । पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर DHM का प्रमुख लाभ उच्च संकल्प पर एक मोटी नमूना मात्रा के एक साथ इमेजिंग है-इस कार्यांवयन में, नमूना चैंबर ०.८ mm मोटी थी । इन नमूना कक्षों polydimethylsiloxane (PDMS) के नरम-लिथोग्राफी ± ५० µm की सहनशीलता के साथ एक सटीक मशीन एल्यूमीनियम मोल्ड से निर्माण किया गया । यह एक लगभग १००-उच्च शक्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर क्षेत्र की गहराई में सुधार गुना का प्रतिनिधित्व करता है । DHM भी मात्रात्मक चरण जानकारी प्रदान करता है, ऑप्टिकल पथ लंबाई (अपवर्तन सूचकांक और मोटाई के उत्पाद) की माप के लिए अनुमति देता है । DHM और इसी तरह की तकनीक बैक्टीरियल और खमीर सेल चक्र और बैक्टीरियल ड्राई मास30,31,३२की गणना की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है; बिखरने मतभेदों को भी बैक्टीरियल उपभेदों३३अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हम का उपयोग साधन कस्टम-सूक्ष्मजीवों के साथ प्रयोग के लिए विशेष रूप से निर्मित है, के रूप में पहले से प्रकाशित३४,३५, और इसके डिजाइन और निर्माण का प्रदर्शन कर रहे है और चर्चा की । जलीय समाधान लगातार सिरिंज पंप के माध्यम से एक ०.२५ µ एल मात्रा नमूना चैंबर के लिए आपूर्ति कर रहे हैं; प्रवाह दर कैमरा फ्रेम दर से निर्धारित है ताकि पूरे नमूना मात्रा की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए । एक सांख्यिकीय गणना एक दिया एकाग्रता पर कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या का पता लगाने के लिए imaged होना चाहिए कि नमूना संस्करणों की संख्या की भविष्यवाणी की.
सेल पहचान अनुप्रयोगों के लिए, आयाम और चरण छवियों में होलोग्राम के पुनर्निर्माण की आवश्यकता नहीं थी; अपुष्ट होलोग्राम पर विश्लेषण प्रदर्शन किया गया । यह महत्वपूर्ण गणनात्मक संसाधनों और डिस्क स्थान बचाता है: एक ५०० एमबी होलोग्राम वीडियो खंगाला जब 1-2 टीबी हो जाएगा । लेकिन, हम नमूने की गहराई के माध्यम से पुनर्निर्माण पर चर्चा करने के लिए पुष्टि करते है कि होलोग्राम वांछित प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । DHM की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह दोनों तीव्रता और छवियों के चरण की निगरानी करने की क्षमता है । जीवों कि तीव्रता में लगभग पारदर्शी रहे हैं (जैसे सबसे जैविक कोशिकाओं) चरण में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं. के रूप में यह एक लेबल मुक्त तकनीक है, कोई रंजक उपयोग किया जाता है । यह एक एकdvantage संभव अंतरिक्ष उड़ान अनुप्रयोगों के लिए, के बाद से रंजक एक मिशन की शर्तों और अधिक महत्वपूर्ण बात नहीं बच सकता है-अलौकिक जीवों के साथ काम है, जो डीएनए या आरएनए के लिए उपयोग नहीं कर सकते है नहीं ग्रहण किया जा सकता है । यह भी ऐसे आर्कटिक और अंटार्कटिक के रूप में चरम वातावरण में काम के लिए एक फायदा है, जहां रंगों को दूरदराज के स्थान पर लाने के लिए मुश्किल हो सकता है और भंडारण पर नीचा हो सकता है । चरण और आयाम में छवियों का पुनर्निर्माण एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज है कि हम GitHub (शैंपू) या ImageJ का उपयोग पर उपलब्ध कराया है का उपयोग किया जाता है ।
Protocol
1. बैक्टीरिया की वृद्धि और गणना
नोट: यह उचित माध्यम में उगाया लगभग किसी भी जीवाणु तनाव के लिए लागू है ३६ . हमारे उदाहरण में, हम तीन उपभेदों का उपयोग करें: Serratia marcescens एक आम के रू…
Representative Results
Discussion
होलोग्रामके सांख्यिक पुनर्निर्माण के लिए: होलोग्राम के संख्यात्मक निर्माण के लिए, कोणीय स्पेक्ट्रम विधि (एएसएम) का प्रयोग किया जाता है । यह DHM के लिए है हरी समारोह के साथ होलोग्राम के कनवल्शनफ़ि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अनुदान ४०३७ और ४०३८ प्रौद्योगिकी के कैलिफोर्निया संस्थान को इस काम के धन के लिए स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
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