التحديد الكمي للكائنات الحية الدقيقة في تركيزات منخفضة باستخدام المجهر المجسم الرقمي (DHM)
Summary
الميكروسكوب المجسم الرقمي (DHM) هو تقنية حجمي يسمح تصوير العينات X 50-100 أكثر سمكا من الفحص المجهري برايتفيلد في القرار قابلة للمقارنة، مع التركيز ما بعد المعالجة. هنا يستخدم اضعا لتحديد وفرز الأصوات، وتتبع الكائنات المجهرية في جداً منخفضة الكثافة والمقارنة مع قياسات الكثافة البصرية ولوحة العد والعد المباشر.
Abstract
وقد كشف بدقة وفرز العينات البكتيرية متفرق العديد من التطبيقات في الأغذية والمشروبات، والصناعات الدوائية، في التشخيص الطبي، والكشف عن الحياة الروبوتية بعثات أخرى الكواكب وأقمار النظام الشمسي. حاليا، يتم حسابها العينات البكتيرية متفرق طريق الثقافة الطلاء أو ابيفلوريسسينسي المجهري. لوحات الثقافة تتطلب فترة طويلة حضانة مرات (أيام إلى أسابيع)، والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي يتطلب تلطيخ مكثفة وتركيز العينة. هنا، نحن توضح كيفية استخدام الفحص المجهري خارج المحور الرقمي المجسم (DHM) لتعداد البكتيريا في الثقافات مخفف جداً (100-104 خلايا/مل). أولاً، هو مناقشة بناء اضعا مخصصة، جنبا إلى جنب مع تعليمات مفصلة حول بناء وسيلة منخفضة التكلفة. وتناقش مبادئ التجسيدي، ويتم استخدام نموذج إحصائي لتقدير كم من الوقت ينبغي أن أشرطة الفيديو للكشف عن الخلايا، استناداً إلى خصائص الأداء البصري للصك وتركز الحل البكتيرية (الجدول 2) . فيديو الكشف عن الخلايا في 105، 104، 103و 100 خلايا/مل يتجلى في الوقت الحقيقي باستخدام الصور المجسمة الأمم المتحدة أعيد بناؤها. ويتجلى الإعمار الصور السعة والمرحلة باستخدام حزمة برمجيات المصدر المفتوح.
Introduction
تحديد دقة التهم البكتيرية في عينات مخفف جداً أمر حاسم في العديد من التطبيقات: هي أمثلة قليلة على الماء والغذاء نوعية التحليل1،2،3؛ الكشف عن العوامل الممرضة في الدم أو السائل الدماغي النخاعي البصاق4،5؛ إنتاج المستحضرات الصيدلانية، بما في ذلك الماء المعقم6؛ وتحليل المجتمع البيئي في البيئات oligotrophic مثل مفتوحة المحيط والرواسب7،،من89. هناك أيضا اهتمام متزايد في الكشف عن إمكانية الحياة الميكروبية قائما على الأقمار الجليدية لكوكب المشتري وزحل، لا سيما أوروبا10،11 وانسيلادوس12،13، 14، التي من المعروف أن لها المحيطات السائلة تحت سطح الأرض. لأن أي بعثة منذ فايكنغ في عام 1978 حاول العثور على الحياة موجودة على كوكب آخر، كان هناك التنمية المحدودة لتكنولوجيات وأدوات لتحديد البكتيريا والعد أثناء بعثات الفضاء15.
البحث عن الأساليب التقليدية للوحة العد فقط من الخلايا كولتورابل، التي يمكن أن تمثل أقلية أنواع في الضغوط البيئية، في بعض الأحيان < 1%16. لوحات تتطلب أيام أو أسابيع من الحضانة لأقصى قدر من النجاح، تبعاً للضغط. ابيفلوريسسينسي المجهري حلت إلى حد كبير التهم لوحة كمعيار الذهب لتعداد الميكروبية سريعة ودقيقة. الحمض النووي-العلامات الفلورية الأصباغ مثل 4 أو 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)، “الأخضر سيبر” أو أورانج أكريديني التي تربط الأحماض النووية هي18،،من17نموذجية الأصباغ المستخدمة19 ، على الرغم من أن العديد من الدراسات استخدام مؤشرات الفلورسنت غرام توقيع20،،من2122،،من2324. باستخدام هذه الطرق دون تركيز ما قبل الخطوات يؤدي إلى الحدود للكشف عن (لودس) ~ 105 خلايا كل مل. تحسينات في اللد إمكانية استخدام الترشيح. عينة سائل تصفية الفراغ على الغشاء، عادة البولي، ومن الناحية المثالية الأسود إلى الحد من الخلفية. منخفض-خلفية الأصباغ مثل البقع الحمض الخلوي الصبغي المشار إليها أعلاه يمكن تطبيقها مباشرة على تصفية25. لعد دقيق بالعين، الخلايا5 ~ 10 مطلوب للتصفية، مما يعني أن لعينات مخفف أكثر من الخلايا5 ~ 10 كل مل، حجم العينة كبيرا يجب جمعها وتصفيتها. وقد وضعت أجهزة المسح الضوئي الليزر بغية استكشاف جميع مناطق عامل التصفية بشكل منهجي وبالتالي تقليل عدد الخلايا المطلوبة للعد، دفع حدود الكشف وصولاً إلى خلايا2 ~ 10 كل مل26. ومع ذلك، هذه غير متوفرة في معظم المختبرات، وتتطلب الأجهزة المتطورة، فضلا عن البرامج التي تسمح بتأكيد الخبراء بأنه لاحظ الجسيمات هي البكتيريا ولا من الحطام.
للإشارة، البالغين مع الانتان عادة ما تبدأ تظهر الأعراض في < الخلايا 100 مليلتر من الدم، والرضع في < 10 خلايا/مل. سحب دم من الكبار يأخذ 10 مل، ومن رضيع، 1 مل. الأساليب المستندة إلى بكر هي تحول دون وجود البشرية وغير ممرضة النباتات الحمض النووي ومكونات تثبيط PCR في الدم27،28. وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من التقنيات الناشئة، تظل الثقافات المعيار الذهبي لتشخيص التهابات مجرى الدم، لا سيما في المناطق الريفية أكثر أو الدول النامية. للكشف عن الحياة في الكواكب الأخرى، يمكن تقدير حسابات دينامي حراري ميزانية الطاقة للحياة ومن ثم الكتلة الأحيائية المحتملة المتوقعة. 1-100 خلايا/مل يتوقع أن يكون معقولاً [ثرمودنميكلي] في أوروبا29. سهولة يتبين من هذه الأرقام أن الكشف عن إعداد صغيرة جداً من الخلايا في كميات كبيرة من محلول مائي مشكلة هامة لم تحل بعد.
في هذه الورقة، ونظهر الكشف السراتية marcescens و أونيدينسيس شيوانيلا (المسخ البرية من نوع وغير متحركة) بتركيزات 105104، 103و 100 مليلتر الخلايا استخدام قبالة محور المجهر المجسم الرقمي (DHM). الميزة الرئيسية اضعا عبر الفحص المجهري الخفيفة التقليدية هو تصوير واحد من وحدة تخزين العينة سميكة بدقة عالية – في هذا التنفيذ، كانت قاعة عينة 0.8 مم. وشيدت هذه الدوائر عينة من لينة الطباعة الحجرية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) من العفن الدقة تشكيلة ألومنيوم مع تسامح من ± 50 ميكرومتر. هذا يمثل تحسنا تقريبا 100-fold في العمق من الميدان عبر الفحص المجهري الضوء عالية الطاقة. كما يوفر اضعا المرحلة كمية المعلومات، مما يسمح لقياس طول المسار الضوئي (المنتج من الانكسار وسمك). وقد استخدمت اضعا وتقنيات مشابهة لرصد البكتيريا والخميرة دورة الخلية وحساب كتلة جافة البكتيرية30،،من3132؛ حتى يمكن استخدام الاختلافات ونثر للتفرقة بين السلالات البكتيرية33.
أداة نستخدمها مبنية خصيصا للاستخدام مع الكائنات الحية الدقيقة، كما نشرت سابقا34،35، وتصميم وتشييد أظهرت ومناقشتها. يتم توفير المحاليل باستمرار إلى 0.25 ميليلتر حجم عينة دائرة عن طريق مضخة الحقن؛ يتحدد معدل التدفق بمعدل الإطار الكاميرا ضمانا لتصوير حجم العينة كاملة. وتتنبأ عملية حسابية إحصائية عدد وحدات العينة التي يجب أن يتم أخذ صورة عنه بغية الكشف عن عدد كبير من الخلايا بتركيز معين.
طلبات الكشف عن الخلية، لم يكن إعادة إعمار الصور المجسمة إلى صور مرحلة والسعة المطلوبة؛ تم إجراء تحليل على الهولوغرام الخام. وهذا يوفر موارد حسابية كبيرة ومساحة القرص: صورة ثلاثية الأبعاد 500 ميغابايت فيديو سوف يكون 1-2 تيرابايت عندما أعيد بناؤها. ومع ذلك، نحن نناقش إعادة الإعمار من خلال عمق العينة للتأكد من أن الصور المجسمة تمثل الأنواع المرغوبة. سمة هامة من سمات اضعا هو قدرته على رصد كثافة والمرحلة من الصور. الكائنات الحية التي تقريبا شفافة في كثافة (مثل معظم الخلايا البيولوجية) تظهر واضحة في المرحلة. كما أسلوب خال من التسمية، يتم استخدام لا صبغات. وهذادفانتاجي للتطبيقات الممكنة من التحليق في الفضاء، منذ الأصباغ قد لا ينجون من شروط البعثة و – والأهم – لا يمكن الافتراض بالعمل مع الكائنات خارج كوكب الأرض، والتي لا يجوز استخدام الحمض النووي الريبي أو لترميز. كما أنها ميزة للعمل في البيئات المتطرفة مثل القطب الشمالي والقطب الجنوبي، حيث قد يكون من الصعب على جلب إلى الموقع البعيد الأصباغ وقد تتحلل عند التخزين. يتم تنفيذ إعادة الإعمار للصور في المرحلة والسعة استخدام حزمة برمجيات المصدر المفتوح التي حققناها متاح على GitHub (الشامبو) أو باستخدام إيماجيج.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة البناء العددي من الهولوغرام: لتعمير الهولوغرام العددية، يتم استخدام الأسلوب الطيف الزاوي (ASM). ويشمل هذا الالتواء من الصورة الثلاثية الأبعاد مع الدالة الأخضر اضعا. يمكن حساب واجهة الموجه المعقدة للصورة في طائرة خاصة تنسيق باستخدام “نظرية فورييه الالتواء” كالتالي:
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر Gordon وبيتي مور مؤسسة المنح 4037 و 4038 إلى “معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا” لتمويل هذا العمل.
Materials
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples – Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, . 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn’s moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. . Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. . Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
