Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .
Abstract
פספוסים דם אנושי, עלקת הבילהרציה spp., יש מחזור חיים מורכב שמערב שלבים התפתחותיים אל-זוויגית, מיניות בתוך השבלול ביניים, יונקים הסופי מארח, בהתאמה. היכולת לבודד ולקיים את שלבי מחזור החיים שונים בתנאים תרבות ' במבחנה הנחתה במידה רבה את חקירות של המנגנונים הסלולר, הביוכימי והמולקולרי ויסות טפיל צמיחה, פיתוח, מארח אינטראקציות. שידור של בילהרציה דורש רבייה אל-זוויגית ופיתוח של שלבים רבים זחל בתוך שבלול המארח; מ miracidium זיהומיות, דרך sporocysts ראשיים ומשניים, ועד השלב הסופי cercarial זה מסוגל להזיק לבני. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור המוני הבקיעה ובידוד של עלקת הבילהרציה mansoni miracidia מביצים המתקבל הכבדים של עכברים נגועים, מבוא עוקבות שלהם לתוך התרבות במבחנה . הוא צפוי כי פרוטוקול מפורט יעודד חוקרים חדשים לעסוק ולהרחיב שדה חשוב זה של מחקר schistosome.
Introduction
האדם דם spp. עלקת הבילהרציה פספוסים, הסוכנים סיבתי של בילהרציה, מחלה טרופית מוזנח מתעצמת משוער 230 מיליון בני אדם ברחבי העולם1. המין הנפוץ ביותר, עלקת הבילהרציה mansoni, מופץ גיאוגרפית בדרום אמריקה, האיים הקריביים, המזרח התיכון, אפריקה לסהרה2. מחזור החיים של S. mansoni, ו schistosomes אחרים, היא מורכבת, מעורבים שורה מהווים הסופית יונקים ו חלזונות מים מתוקים של הסוג Biomphalaria המשמשים כפונדקאים ביניים בלבד.
S. mansoni מבוגר זכר ונקבה תולעת זוגות המתגוררים וורידי מצע המעי העליון האחורי להתרבות בתרבית של המארח, וכתוצאה מכך שחרורו של embryonated ביציות (פשוט) זה להיות תקוע בעצם venules קטן של רירית המעי. הביצים ואז פורץ דרך הקירות כלי השיט, דרך רקמות mucosal והזן בסופו של דבר לומן מעיים היכן הם נמצאים בוטל עם הצואה. כאשר ביצית מזין את הצוהר הזחלים מים מתוקים, free-swimming (miracidia), שהם חייבים, סדר קצר, למצוא חילזון Biomphalaria מתאימים כדי להדביק על מנת להמשיך את מחזור חייו. תהליך זיהום זה כרוך miracidial מצורף משטח הגוף החיצוני של החילזון ואחריו חדירה פעיל, כניסה של הזחל לתוך המחשב המארח. זמן קצר לאחר הכניסה, miracidium מתחיל לשפוך צלחות אפידרמיס ciliated החיצוני שלה כמו צורות syncytium שיהפכו את המשטח החיצוני החדש (tegument) של הזחל הבא, sporocyst ראשי או אמא. דרך רבייה אל-זוויגית, כל sporocyst ראשית מייצרת ומשחרר דור שני של sporocysts, כינה משני או הבת sporocysts, אשר בתורו, לייצר ולשחרר מספר גדול של השלב הסופי intramolluscan, cercaria3 . על הבריחה מהמחשב המארח חילזון, free-swimming cercariae מסוגלים הצמדת וחודר ישירות על העור של האדם או אחר מתאים שורה יונקים. כשנכנסתי אל הפונדקאי החדש שלהם, cercariae להפוך לבמה schistosomula טפיליות ו לפלוש במערכת כלי הדם. הם, בתורו, נודדים הריאה ולאחר מכן את וריד הכבד שבו הם התבגרת. תולעים בוגרות, יוצרות זוגות זכר ונקבה, לנסוע אל הורידים מצע המעי העליון כדי להשלים את מחזור החיים שלהם.
מוצלחת intramolluscan או "חילזון שלב" התפתחות הזחל schistosomes חיוני המשכיות המחזור של שידור מארח למארח אנושי. חשיבות קריטית היא הערך הבא תקופה של miracidium free-swimming לתוך המחשב המארח חילזון וטרנספורמציה מוקדם שלה על הבמה הראשית sporocyst. בהתאם התאימות פיזיולוגי ו בין המארח לבין טפיל, זה במהלך שלב זה של התפתחות הזחל את ההצלחה הראשונית או כשל ליצור זיהומים הוא נחוש4,5,6 . עוקבות התפתחות מסוגל לייצר asexually sporocysts משני, אשר לאחר מכן ליצור cercariae אנוש-זיהומיות, ראשי sporocysts נוספות דורשות סביבה מארח פיזיולוגיים מתירניות מספק עבור כל הצמיחה של הטפיל, הרבייה צריך.
עד כה, מעט מאוד ידוע על הבסיסית פיסיולוגי, ביוכימי, תהליכים מולקולריים אינטראקציות schistosome-חילזון לשליטה, במיוחד מולקולות מסלולים מעורבים בוויסות התפתחות הזחל ורביה, או להתכוונן תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. מוכן גישה לכמויות גדולות של אלה שדרגות בתנאים in vitro לקשרי תרבות כי היתר מניפולציה ניסויית מאוד להקל על הגילוי של מסלולים התפתחותית ומנגנונים הבסיסית של צמיחת תאים, בידול רבייה... נתיבים קריטיים טפיל או מנגנונים, מזוהה באמצעות ניסויים במבחנה , יוכל לשמש לאחר מכן כדי לשבש את הזחל הצמיחה רבייה במארח חילזון, או כדי לזהות חילזון מארח המערכת החיסונית מנגנונים מעורבים זיהוי ולמניעת שלבים miracidial או sporocyst.
זה מאמר, מצגת וידאו, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה לבודד מספר רב של free-swimming S. mansoni miracidia עבור מבוא לתרבות במבחנה זה עלולים להיות נתונים מעקב ניסיוני מניפולציה (ראו איור 1 מבט סכמטי של זרימת העבודה לפרוטוקול). אף על פי נהלים דומים שתוארו קודם לכן7,8,9, הרגשנו כי פרוטוקול מפורט יהיה שימושי לחוקרים המעוניינים להעסיק. את מודל זה להפנות שאלות שלא נענו עדיין קשורים פיתוח זחל intramolluscan תאית שגשוג, אינטראקציות המערכת החיסונית schistosome-חילזון. בנוסף, גישה זו יכולה להתאים בקלות עבור בידוד של הביצים אחרים trematodes חשוב מבחינה רפואית כגון שלפוחית השתן-דיור ס haematobium, פספוסים הכבד או הריאות פספוסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון תחת פרוטוקול אין. V005717. להלן כללי התנהגות כרוך עובד במתקן אבטחה ברמה 2 (BSL2) עבור האדם פתוגנים, אף אחד השלבים schistosome מצטיירת פרוטוקול זה אמנם זיהומיות בני אדם או יונקים אחרים. בצע את מדיניות מוסדית לטיפול פתוגנים האנושי הסיכון קבוצה 2 (RG2).
הערה: אנו משתמשים הנשי עכברים שוויצרי-וובסטר (6 - בן שבועיים) עקב הרגישות שלהם גבוה יותר זיהום10, ובכך מניב בנטל ביצה גדולה יותר. טאקר. et al. תאר את הפרוטוקולים זיהום עכבר וחילזון המשמשים את מערכת דגם11. טבלה של חומרים מפורטים כל ציוד ספציפי, חומרים, ריאגנטים, מקורות בעלי חיים צריכה לבצע פרוטוקול ניסיוני זה.
1. עיבוד של כבדי נגוע
- המתת חסד עכברים, 6-7 שבועות לאחר הפגיעה, בעזרת CO2 (בשיעור של 10-30% נפח החדר לדקה). לפקח על עכברים על הפסקת נשימה, פעימות הלב.
הערה: בדרך כלל, עד 20 עכברים יכול לעבד בזמן נתון. - לאחר העברת עכברים לאללה אבטחה cabinet, במקום עכברים על גבם, לרסס משטחים הגחון שלהם עם 70% אתנול. תן משרים למשך 1 דקות.
- לצבוט למשוך את העור של הבטן התחתונה, חצו הבסיס של העור צבט הקרוב ביותר אל הבטן עם מספריים כירורגיים סטרילי. משוך את העור חתוך anteriorly (קרי, לכיוון הראש) כדי לחשוף את הכבד. שים לב לכך הכבד צריך להיות מוגדל מנומר עקב ביצה-induced גרגירומת ממושכת מענה (איור 2 א).
- להסיר את הכבד ומניחים אותו בתוך המכיל 200 מיליליטר סטרילי 1.2% NaCl פתרון המכיל עט/סטרפ.
- חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 עם עכברים הנותרים.
הערה: עכברים עשרים מעובדים בדרך כלל הקציר יחיד. - מקם את הכבדים בצלחת פטרי סטריליות ולהסיר שומן שאינו כבד/ורקמות עם מלקחיים סטרילי.
- העברה כבדי חיתוך/לנקות בקבוק צנטריפוגה 250-mL סטרילי המכיל ~ 200 מ ל- 1.2% NaCl פתרון סטרילי עם עט/סטרפ.
- נמרצות לנער את הבקבוק המכיל את הכבדים ולהסיר, באמצעות פיפטה חד פעמי סטרילי, פני השטח עודף קצף צף פסולת. לאט לאט יוצקים את תמיסת מלח שנותרו לתוך מכולה או כיור המכיל 1% מלבין (מחטא).
- ~ 200 מ"ל תמיסת טריים להוסיף הכבדים, חזור על שלב 1.8 שלוש פעמים נוספות.
2. הכבד בידוד חילוץ ו- miracidial
- מקם את הכבדים לתוך כוס בלנדר נירוסטה סטרילי קטן ולהוסיף ~ 2 מ"ל של 1.2% NaCl פתרון (איור 2B).
- לכסות את הספל עם רדיד, צלחת פטרי כדי למנוע נשפך, תערובת של 1 דקות, לסירוגין מהירות נמוך וגבוה (20 s מהירות נמוכה/10 s במהירות גבוהה; repeat) (איור 2C).
- פזר באופן שווה ההשעיה הכבד מעורב לתוך צנטריפוגה 250-mL סטרילי בקבוקים (עבור כבדי 20 להשתמש 4 בקבוקים).
- להוסיף מלח סטרילית עם אנטיביוטיקה ~ 200 מל סה כ נפח/בקבוק. שוקלים/איזון בקבוקים לפני צנטריפוגה.
- צנטריפוגה הכבדים מעורבב ב 290 x g למשך 15 דקות בבית 4 oC. בעדינות יוצקים את supernatants לתוך מיכל עם אקונומיקה לפני השלכת.
- חזור על שלבים 2.4-2.5 פעם אחת. הקפד ביסודיות resuspend משקע כבד לפני צנטריפוגה.
- לאחר השמטת את תמיסת המלח האחרון לשטוף (שלב 2.6), להוסיף 200 מ ל מים בריכה סטרילית עם עט/דלקת רקמת הכבד pelleted, ללחוץ כדי resuspend משקעים, ולהעביר את המתלים מעוקר 1-L סטריליות זה כבר מכוסה לגמרי עם אלומיניום רדיד, למעט החלק העליון 3 ס מ של הצוואר (איור דו-ממדי).
הערה: השתמש שני בקבוקים (= 10 כבדי) לכל 1-L את הבקבוק. אגם מים המדמה את הסביבה הטבעית מים מתוקים צריך לעורר miracidial הבקיעה מביצים. - באמצעות מים בריכה סטרילית, למלא את הבקבוק כדי כ- 3 ס מ מעל רדיד האלומיניום מכסה על הצוואר. ואז, ללא דיחוי (כפי miracidia בקרוב מתחילות לבקוע), להסיר קצף שיורית ואת רקמת הכבד צפים אל פני השטח על ידי מהר pipetting למעלה ~ 12 מ ל מים בריכה המכילים פסולת וזורקים השמטת את זה לתוך נפרדת שפופרת. להחליף מים טריים בריכה סטרילית.
- חזור על 2.8 שלב הניקוי, עוד שלוש פעמים, בדיקת נוכחות של miracidia בצינור להשליך. להפסיק את החזרה על ניקוי שלב אם miracidia מופיע בהפתרון לשטוף.
- לאחר השטיפה האחרונה לאט להוסיף ~ 12 מ ל מים חמים בריכה סטרילית (טרום התחמם עד 30 oC) ליצירת מעבר צבע הטמפרטורה במים חמים נקי, סטרילי על העליונה.
הערה: זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי לאט מתרוקנת מים לאורך צדי בצוואר הבקבוק כדי למנוע ערבוב. - הצב כיסוי פטרי קטן מעל הפתח הבקבוק והשכם אור בהיר לרוחב החלק העליון של הבקבוק מעל השער בנייר כסף כדי להאיר את המשטח העליון של מים.
הערה: בדרך כלל, בתוך 5-10 דקות, לשחות miracidia, נמשך אל האור, נתמקד במספר גדול בתוך הראשונה 2-3 ס מ של אגם המים (איור 3 א).
3. Miracidial קציר והטיפוח -תרגול
- כאשר miracidia צבר על פני השטח לאחר 10 דקות, באמצעות pipet של העברת סטרילי, להסיר ~ 8 מ של אגם מים, העברת שפופרת צנטרפוגה 15-mL סטרילי. מקם את הצינור המכיל miracidia על הקרח.
- להוסיף גב 8 מ ל מים חמים בריכה סטרילית לאורך החלק הפנימי של סטריליות ולא לחכות עוד 10 דקות.
- באמצעות צינורות חדשים בכל פעם, חזור על שלבים 3.1 ו- 3.2 שלוש פעמים נוספות. לאחר לאוסףה 4, לשמור את הצינור הסופי על קרח למשך 10 דקות לאפשר את miracidia להתיישב. קבוצה זו של צינורות כוללת הקציר הראשון.
- צנטריפוגה צינורות המכיל miracidia ב g x 290 דקות 1-4 oC ומפרידה בקירור טרום מקורר.
- להסיר לאלתר את רוב תגובת שיקוע (~ 7 מ"ל) נזהר שלא להפריע בגדר טפיל (איור 3B).
- בריכה כל miracidia מ זה הקציר הראשון לתוך אחד צינור, ואז לשטוף את כל הצינורות המקוריים עם בריכה סטרילית ~ 1 מ"ל מים ולהוסיף הצינור"במאגר".
- לאפשר טפילים להתיישב על קרח ~ 5 דקות, שוב centrifuge הטפילים ב g x 290 דקות 1-4 oC.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והוסף שמאוזן טשערנין סטרילי של 6-8 מ ל תמיסת מלח (CBSS +; ראה טבלה של חומרים) המכיל עט/סטרפ.
- בעדינות להשעות את miracidia ואת aliquot אותם לתוך צלחת 24-ובכן התרבות (1 מ"ל לכל טוב), ואחריו שטיפה הצינור ב- 6-8 מ ל CBSS + הוספת 1 מ"ל של שטיפה מכל קידוח. דגירה טפילים-26 oC בתנאים normoxic. ריכוזי miracidia מבודדים משתנים, אך בדרך כלל יהיה בממוצע ~ 7000/mL.
- אם טפילים עדיין מתרכז ב מקור האור, חזור על השלבים 3.1 ל 3.9 להמשיך לקצור מאוחר-הבקיעה miracidia אך להגדיל את מרווח הזמן בין אוספי ל 15-20 דקות.
הערה: זו קבוצה חדשה של צינורות מייצג את הקציר השני. עם זאת, כי miracidial מספרים נמוכים בדרך כלל, הזחלים משפופרות כל בדרך כלל הם איחדו לתוך תרבות טוב המכיל 2 מ"ל CBSS +. - 24 שעות לאחר הקציר, טיפוח, בעדינות resuspend sporocysts בבארות שלהם על-ידי pipetting.
- המתן מספר דקות כדי לאפשר טפילים להתיישב לתחתית הבארות. ברגע שהם התיישבו, הסר בזהירות את תגובת שיקוע (~1.5 מ"ל), אשר יכיל רוב ciliated באפידרמיס הצלחות לשפוך על ידי miracidia במהלך טרנספורמציה זחל. זה "שינוי" supernatant עשויים שנמחקו או שולבו מחקרי מעקב של מוצרים הפרשה זחל.
- להוסיף 1.5 מ של CBSS טריים + כל טוב, בעדינות פיפטה כדי resuspend sporocysts. חזור על שלב 3.12 אם עוד כביסה או שינוי למדיום אחר רצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרוב המכריע של miracidia בדרך כלל שנאסף ב- "יבולים" שני הראשונים. דגירה של מבודדים miracidia ב CBSS + מפעיל על תהליך הטרנספורמציה miracidium-אל-sporocyst (איור 4A- C). בתוך שעה הראשונה העברה הבא לתרבות בארות המכיל CBSS +, הרוב המכריע של miracidia הפסקת שחייה (איור 4A). ב- 6-אייץ ' בתרבות, miracidia בעיצומו של פעיל ששפך צלחות אפידרמיס ciliated שלהם (איור 4B). חופפת התהליך שפיכת, הזחלים יוצרים הכיסוי החיצוני שלהם tegumental syncytial כפי שהם המרה ל sporocysts הראשי. רוב הטפילים השלמת השינוי זחל, הופך מלא שנוצר sporocysts, באמצעות טיפוח לאחר 24-48 שעות ב- CBSS + (איור 4C). לאחר 4 ימים של התרבות של CBSS + לבד, יתכנו הישרדות sporocyst כדי להקטין עד ~ 80%. עם זאת, sporocysts תרבותי עבור יום אחד ב- CBSS +, ואז הועבר בינוני Bge (cBge) מלאה עבור 3 ימים בדרך כלל לגרום יותר שיעורי הישרדות וזחלים עם מראה יותר חזקים (איור 4D). הכדאיות sporocyst בדרך כלל נשאר יציב בין 4 ו 7 ימים ב- cBge עם המשך עלייה צמיחה זחל בתקופה זו בתרבות בהשוואה CBSS + לבד.
איור 1 . מבט כולל על פרוטוקול זרימת. סיכום סכמטי של הצעדים העיקריים המעורבים הבידוד והטיפוח של miracidia נגזר עכברים נגועים עם הלוויתן דם אנושי, S. mansoni. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : עיבוד של כבדי הנגועים. (א) עכבר הכבד נגועים קשה עם S. mansoni ביצים. שימו לב לגודל מוגדלת, צבע נורמלי, הנוכחות של גרנולומות בכבד הנגוע (מימין) לעומת כבד נגוע נורמלי (משמאל). (B) Washed העכבר כבדים לאחר העברה כוס בלנדר נירוסטה סטרילי. הכבדים היו אז התערבבו לדקה אחת באמצעות רדיד עקר פטרי כדי לכסות את הגביע, וכך להימנע נשפך (C). לאחר המיזוג, homogenate הכבד, המכילים ביצים, שטף את מספר פעמים בתוך תמיסת מלח, resuspended במים בריכה סטרילית, לפני מועבר סטריליות 1-L מכוסה ברדיד אלומיניום (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : קציר S. mansoni miracidia. פעיל שחייה miracidia מרוכז על ידי משיכה אל האור בחלק העליון של סטריליות (A). במרווחים של 10 דקות, טפילים לקצור ידי פיפטה, שהוצב בכביש 4 ° C כדי לשתק את הזחלים. Miracidia לאחר מכן ב- CBSS + על ידי צנטריפוגה שטופים שנאסף צינור יחיד (B) רק לפני הפצה כדי בארות של צלחת תרבות. CBSS +; של טשערנין מאוזנת תמיסת מלח (טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Miracidial השינוי העיקרי sporocysts ותחזוקה שלהם במבחנה . S. mansoni miracidia ו- sporocysts ימוקם in vitro לקשרי תרבות בזמנים שונים לאחר הקטיף. Miracidia שנקטפו לאחרונה בתוך h 1 של התרבות של CBSS + (A). לאחר 6 שעות של התרבות, miracidia החלו לשפוך צלחות אפידרמיס ciliated שלהם (חיצים) כפי שהם המרה ל ראשי sporocysts (B). לאחר 24 שעות ביממה ב- CBSS + רוב miracidia הפכו לגמרי את ראשי sporocysts (ג). Sporocysts היו הפכה CBSS + במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועבר ומתוחזק במדיום cBge במשך 3 ימים (D). Sporocysts בדרך כלל מופיעים עמידים יותר, יש שיעורי הישרדות גבוהים יותר ב 4 ימים שלאחר הטיפוח-תרגול בנוכחות cBge, בהשוואה ל- CBSS + לבד. CBSS +, של טשערנין מאוזנת תמיסת מלח; cBge בינוני, מלאה glabrata דרב עובריים תא בינוני (ראה טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia של S. mansoni, מבודד ולמניפולציה כמתואר להלן, יכול להדביק רק חילזון המארח ביניים, ולכן אינם מייצגים הביולוגי האנושי במהלך שלב זה של התפתחות הזחל. עם זאת, כדי למנוע חשיפה מקרית/זיהום של חלזונות, להקפיד לבצע miracidial ומשום במיקום שונה מאזורים שבו רגישים מינים חילזון Biomphalaria עשוי להיות נוכח או מתוחזקים. חדר נפרד, רשום כמרחב BSL2, מומלץ בחום. בנוסף, לשטוף כל פתרונות שימוש בעיבוד של כבדי ובידוד זחל צריכים להיות מטופלים עם חומר חיטוי (למשל, 1% מלבין) לפני סילוק.
יצוין כי הסרה כירורגית של הכבדים מן נגוע עכברים, העיבוד הבאים שלהם לפני המיזוג/המגון מבוצעות ב- בטיחות ביולוגית cabinet (BSC) בתנאים אספטי. עם זאת, מסיבות מעשיות (קלות מניפולציה דגימות בצובר) כל הליכים אחרים נעשים על benchtop מחוטא ניצול מכולות סטרילי (למשל, כוסות בלנדר, מבחנות, בקבוקים, צינורות, העברה pipets, וכו ') ופתרונות סטרילי המכילה אנטיביוטיקה (מלוחים, אגם מים, CBSS). אנטיביוטיקה יתווספו כל הפתרונות כאמצעי זהירות נוסף נגד זיהום מיקרוביאלי הציג. בנוסף, במהלך השלבים (פרוטוקול סעיפים 2 ו- 3) הבידוד miracidial והקציר, כיסוי קטן פטרי ממוקמת מעל הבקבוקון פתיחה כדי לצמצם זיהום מחוץ במהלך ההסרה הראשונית של הקצף/הכבד פסולת והעברה עוקבות של miracidia מרוכז מן הבקבוק כדי צנטריפוגה צינורות.
בדרך כלל, נקצור miracidia מ- 20 כבדי העכבר נגוע באצווה אחת, שממנה אנו מעריכים התשואות זחל של הזחלים בערך 5000 לכל הכבד. עם זאת, התשואות יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם עוצמת הזיהום של עכברים בודדים וכתוצאה מכך אצווה-כדי-אצווה וריאציה miracidial ושחזורים. ומשום יכול להתבצע באמצעות פחות כבדים ההתחלתי, למרות השיטה שתיארנו ישימה כלל במשך 10-20 כבדי. כבדי 20 יעובדו, בעקבות את resuspension הסופית של כדורי כבד במים בריכה סטרילית (פרוטוקול סעיף 2, שלב 2.7), המתלים יופצו באופן שווה לתוך 1000-mL שתי מבחנות (2 בקבוקים הבקבוק). אם נעשה שימוש כבדי 10 או פחות, homogenates הכבד המקורי (פרוטוקול בסעיף 2, שלב 2.3) שניתן להפיצם 2 בקבוקים ושטף המתלים הועבר לאחר מכן סטריליות יחיד לצורך המשך עיבוד. אחד או 2 כבדים גם ניתן לעבד, אבל כמויות (אחסון) של החילוץ, לשטוף, הבקיעה פתרונות צריך להיות מופחת פרופורציונלית, עם גמר שטף את המשקע במים בריכה מועבר 10-mL מכוסה בנייר כסף סטריליות להתרכז miracidia.
על מנת למקסם את התשואות miracidial עם מינימום של זיהום כבד פסולת, חשוב גם לבצע את אגם מים שוטף (פרוטוקול בסעיף 2, מדרגות 2.7-2.9) במהירות וביעילות האפשרית. ברגע ביצים נחשפים אגם מים, miracidial הבקיעה מתרחשת זמן קצר לאחר מכן, למרות מתחילה לפני המראה זחל על מקור האור בצוואר הבקבוק יכול לנוע בין 5-20 דקות לאחר הבקיעה. כדי להגביל את הפסד של טפילים במהלך ניקוי המים באגם צעדים חשוב לבדוק באופן חזותי את כל המים באגם לשטוף עבור miracidia שהגיעו מוקדם בשכבת המים העליונה של הצוואר של הבקבוק. בנוסף, לאחר miracidia של העברת צינורות איסוף 15-mL, ממוקמות על קרח, הם מפסיקים לשחות פעילות ולהתיישב לתחתית הצינור. עם זאת, לאחר צנטריפוגה כדי הצניפה הזחלים (סעיף 3, צעדים 3.4-3.5), miracidia יתחיל שוב לשחות אם מים מותר לחמם. לכן, חשוב להסיר את המים באגם במהירות, אבל ללא מפריע בגדר או pipetting למעלה שחייה טפילים.
כאמור, התשואות של miracidia מבודדים עשויה להשתנות בהתאם את מספר זוגות התולעת הבוגרת נוכח בעכברים בודדים (זיהום בעוצמה) עקביות של זיהום ראשוני פרוטוקולים. Miracidia חריפה phototropic, הרוב (80-90%) ותכונותיו-מקור האור על פני תקופת הקציר הראשון. 10-20% הנותרים של miracidia תמשיך לבקוע ולצבור יותר לאט במהלך תקופת הקציר השני. ביותר (> 95%) miracidia הציג לתוך התרבות ומתוחזק -26 oC CBSS + בינוני יש למסעדת sporocysts העיקרי בתוך 24-48 שעות של טיפוח-תרגול. בשלב זה, הכדאיות זחל בדרך כלל הוא > 90%. לאחר 4 ימים ב- CBSS + הכדאיות לבד יורדת במידה ניכרת (70-80%). עם זאת, מיתוג תרבות האמצעי CBSS + כדי להשלים Bge בינונית 24 שעות הבאות טיפוח CBSS הראשונית התוצאה שיעורי הישרדות גבוהים יותר תהליך צמיחה. אנו שומרים באופן שגרתי לטווח קצר תרבויות sporocyst בתנאים normoxic. עם זאת, sporocysts רגישים למדי כדי רמות החמצן, בייחוד מינים חמצן תגובתי זה יכול לגרום נזק חמצוני ברישול7. ביין סי4 ואחרים דיווחו כי הבריאות הכללית ואת הכדאיות של sporocysts במבחנה באופן משמעותי משופרות בעת תרבויות נשמרים בתנאים ובשפתיים. ניתן להשיג רמות החמצן הוריד ההמתה (עם חנקן) מבחנות closeable בודדים, או על ידי העשרה בחנקן בשלב הדלק של מבחנות4.
כמו שיטות מצוטט לעיל, בידוד, culturing של schistosome axenic miracidia ו- sporocysts תוארו קודם לכן. זה הוכר כבר בשלב מוקדם כי miracidial phototropism יכול לשמש כדי למשוך ותתרכזו הזחלים שחייה, miracidia המבודד הזה יכול להיות במהירות קיבוע hyperosmotic פתרונות מלוחים (בין 120-160 mOs/Kg)8. זה נצפתה יותר תחזוקה בפתרונות מלוחים גרמו בטרנספורמציה של miracidia את ראשי sporocysts,9,intramolluscan הפרפרים והעשים הראשון12. מדיה מורכבת גם נוסחו כדי לתמוך וקהילותיהם במבחנה הצמיחה וההתפתחות של S. mansoni sporocyst שלבים9,13,14,15, וכן תאים נגזר המארח חילזון Biomphalaria glabrata16. אלה ניסוחים שונים בתקשורת המסחרי והחלה עשויים להיות מצורפים עם חומצות אמינו, מלחים, ליפידים, צמצום סוכנים של סוכרים. התקשורת מלאה ניסוחים כלל גם להשבית חום שור עוברית או סוס סרום בריכוזים שונים. מצאנו שאת נאות החום-איון (איץ ' אי) היה תפקיד חשוב sporocyst הישרדות, ארוכת טווח לפיתוח במבחנה. אנו נמצאו הזה דגירה של סרום (בקבוקים המופשרים, 100-מ ל) waterbath oC 60 על 60 דקות, עם כל 10 דקות של חימום אחיד ערבוב עדין היה יעיל ביותר. בנוסף, אנחנו בדרך כלל לבדוק כמה מגרשים של נסיוב מן הספק פוטנציאליים לתאימות תרבות זחל. לבסוף, הקמת הקו הראשון (והיחיד כיום) תא molluscan אותנטי, glabrata דרב עובריים (Bge) תא הקו הנסן16 היתה פריצת דרך משמעותית פוריה ההתקדמות schistosome הזחל המאמצים הטיפוח-תרגול. מבודדים mansoni S. miracidia, כאשר מניחים לתוך תרבות משותפת עם תאים Bge התפתח מן הראשית עד sporocysts משני בת17, ובסופו של שלב cercarial18,19. לפיכך, טיפוח רציפה במבחנה של השלב חילזון שלם של מחזור החיים של S. mansoni הושגה. המדיום תא Bge בשימוש במערכת התרבות שלנו תומך הן sporocyst צמיחה/פיתוח ותחזוקה של הקו תא Bge.
לסיכום, יש תיאר ואנו חזותית מאויר פרוטוקול מפורט עבור בידוד המוני axenic וטיפוח של השלב free-swimming miracidial של S. mansoni. Miracidia אלה, כאשר נתון לתנאים תרבות מתאימה, מסוגלים לפתח דורות רצופים sporocyst ראשיים ומשניים, בסופו של דבר cercariae. עם התפתחות ועידון מתמיד של כלים זמינים כעת עבור מניפולציה גנים, גנים ביטוי במבחנה באמצעות התערבות RNA מהונדס, הגנום עריכה (למשל, CRISPR/Cas9) גישות, זה נמצא שחזה כך יעיל שיטות בידוד והטיפוח של miracidia מגוונת מיני trematode20 ימשיכו להיות נחוץ כדי להשיג חומרים נוספים לקידום המחקר בתחום זה. שיטה זו יפה משלים עבור בידוד, culturing cercariae free-swimming של S. mansoni כדי להקל על השינוי במבחנה עד שלב schistosomula בתרבית של21, עבור פרוטוקול שתואר קודם לכן בסופו של דבר -תרגול למבוגרים ovigerous תולעים22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לעורכים יש דבר לחשוף.
Acknowledgments
מומן בחלקו על ידי מענק-NIH RO1AI015503. עכברים נגועים schistosome נמסרו על ידי המרכז משאב NIAID בילהרציה מכון המחקר הביו-רפואי (Rockville, MD) דרך NIH-NIAID חוזה HHSN272201000005I להפצה באמצעות משאבים BEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S.
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
