Summary
Cet article décrit un protocole d’isolement axénique à grande échelle et de perception des miracidia nageant librement de la douve de sang humaine Schistosoma mansoni et leur traitement ultérieur pour être introduit dans la culture in vitro .
Abstract
Douves du sang humains, Schistosoma spp., ont un cycle de vie complexe qui implique des phases asexuées et sexuées de perfectionnement au sein d’un escargot intermédiaires et mammifère hôte final, respectivement. La capacité d’isoler et de maintenir les étapes du cycle de vie différent en vertu des conditions de culture in vitro a grandement facilité les enquêtes sur les mécanismes cellulaires, biochimiques et moléculaires régulant hôte, le développement et la croissance de parasite interactions. Transmission de la schistosomiase nécessite la reproduction asexuée et le développement de plusieurs stades larvaires chez l’hôte escargot ; le miracidia infectieux, par le biais de sporocystes primaires et secondaires, à la phase finale de cercaires c’est infectieux pour l’homme. Dans cet article, nous présentons un protocole étape par étape pour l’éclosion massive et l’isolement des miracidia Schistosoma mansoni des oeufs provenant de foie de souris infectées et leur introduction ultérieure dans la culture in vitro . Il est prévu que le protocole détaillé encouragera de nouveaux chercheurs de poursuivre et d’élargir cet important domaine de recherche de schistosomiase.
Introduction
L’humain sang douves Schistosoma spp., sont les agents étiologiques de la schistosomiase, une maladie tropicale négligée qui afflige un estimé de 230 millions de personnes dans le monde1. L’espèce la plus répandue, Schistosoma mansoni, est géographiquement distribué en Amérique du Sud, l’archipel des Caraïbes, le Moyen-Orient et l’Afrique subsaharienne2. Le cycle de vie de S. mansoniet autres schistosomes, est complex, faisant intervenir un hôte définitif chez les mammifères et les escargots d’eau douce du genre Biomphalaria qui servent d’hôtes intermédiaires obligatoires.
S. mansoni mâles et femelles adultes ver couples vivant dans les veines mésentériques postérieures de reproduire le mammifère hôte, ce qui entraîne la libération de œufs embryonnés (ovules) qui se loge dans les petites veinules de la muqueuse intestinale. Œufs puis pauses à travers les parois des vaisseaux, migrent à travers le tissu muqueux et finit par entrer dans la lumière intestinale où ils seront annulées par les fèces. Lorsque les ovules entrez hachures de larves nageuses et d’eau douce (miracidies), ils doivent, dans l’ordre court, trouver un escargot Biomphalaria adapté pour infecter afin de poursuivre son cycle de vie. Ce processus d’infection implique miracidiale pièce jointe à surface de l’escargot extérieure suivie de pénétration active et l’entrée de la larve dans l’hôte. Peu de temps après l’entrée, le miracidia commence à jeter ses plaques épidermiques ciliées externes car elle forme un syncytium qui deviendra la nouvelle surface extérieure (tégument) de la prochaine étape larvaire, le sporocyste primaire ou mère. Par le biais de la reproduction asexuée, chaque sporocyste primaire produit et libère une deuxième génération de sporocystes, appelés secondaires ou des sporocystes de fille, qui à son tour, génèrent et libèrent un grand nombre de la dernière étape apporte, la cercaire3 . À échapper à l’hôte de l’escargot, cercaires libres sont capables d’attacher à et directement pénétrer dans la peau d’un hôte mammifère convenable humaine ou autre. Dès l’entrée dans leur nouvel hôte, les cercaires transforment le stade parasitaire schistosomula et envahissent le système vasculaire. Ils, à leur tour, migrent dans les poumons, puis à la veine hépatique où ils mûrissent de vers adultes, forment des couples masculins et féminins et rendre les veines mésentériques pour compléter leur cycle de vie.
Apporte le succès ou le développement de la « phase d’escargot » de schistosomes larvaires est essentiel à la poursuite du cycle de transmission à l’homme hôte-hôte. D’une importance cruciale est la période entrée suivante de la miracidia nageant librement dans l’hôte de l’escargot et sa transformation au début sur la scène du sporocyste primaire. Selon la compatibilité immunologique et physiologique entre l’hôte et le parasite, c’est au cours de cette phase du développement larvaire que succès initial ou l’échec pour établir les infections est déterminé4,5,6 . Développement ultérieur des sporocystes primaires capables de produire par voie asexuée des sporocystes secondaires, qui ensuite génèrent des cercaires homme infectieuse, nécessitent encore un environnement permissif hôte physiologiques qui offre pour l’ensemble de la croissance du parasite et la reproduction a besoin.
A ce jour, on connaît mal le sous-jacent, physiologiques, biochimiques et moléculaires processus régissant les interactions de schistosomes-escargot, surtout les molécules et les voies impliqués dans réglementant la reproduction et le développement larvaire ou modulant réactions immunitaires de l’hôte. Accès facile à un grand nombre de ces stades larvaires dans in vitro culture des conditions qui permettent la manipulation expérimentale faciliterait grandement la découverte de cheminement et les mécanismes sous-jacents de la croissance cellulaire, différenciation et la reproduction. Voies critiques parasite ou mécanismes, identifiés grâce à l’expérimentation in vitro pourraient alors servir de perturber la croissance ou la reproduction larvaire chez l’hôte de l’escargot, ou pour identifier les escargot hôte immunitaire mécanismes impliqués dans la reconnaissance et l’élimination des miracidiale ou sporocyste étapes.
Dans cet article et la vidéo de présentation, nous fournir une description détaillée d’une méthode pour isoler un grand nombre de nageuses S. mansoni miracidia pour être introduit dans la culture in vitro qui peut-être alors être soumise au suivi expérimental manipulation (voir Figure 1 pour une présentation schématique du flux de protocole). Des procédures similaires ont été décrits précédemment7,8,9, nous avons estimé qu’un protocole détaillé serait utile aux chercheurs qui souhaitent utiliser ce modèle pour répondre à des questions encore sans réponse associées à le développement larvaire apporte, prolifération cellulaire et interactions immunitaires schistosomes-escargot. En outre, cette approche pourrait facilement être adaptée pour l’isolement des oeufs des autres trématodes médicalement importants tels que la vessie vivant S. haematobium, douves du foie ou douves du poumon.
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Protocol
Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées par la Commission Institutional Animal Care et utilisation de l’Université du Wisconsin-Madison en vertu du protocole aucune. V005717. Le protocole suivant consiste à travailler dans un établissement de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour les agents pathogènes humains, même si aucun des schistosomes étapes décrites dans le présent protocole sont infectieux pour les humains ou d’autres mammifères. Suivre des politiques institutionnelles pour la manipulation d’agents pathogènes humains groupe de risque 2 (RG2).
Remarque : Nous utilisons femelles souris Swiss-Webster (6 - semaine vieux) en raison de leur susceptibilité accrue d’infection10, réduisant ainsi à plus grandes charges d’oeuf. Tucker et coll. décrivent des protocoles d’infection souris et escargot utilisés dans ce système de modèle11. La Table des matières liste tous les équipements spécifiques, les matériaux, les réactifs et les sources animales nécessaires pour réaliser ce plan expérimental.
1. traitement des foies infectés
- Euthanasier souris, infection après 6 à 7 semaines, par asphyxie de CO2 (taux de 10 à 30 % du volume de la chambre par minute). Contrôler la souris à l’arrêt de la respiration et le rythme cardiaque.
Remarque : En règle générale, jusqu'à 20 souris peuvent être traitées à un moment donné. - Après avoir transféré les souris euthanasiés une armoire de la biosécurité, placez la souris sur leur dos et leurs surfaces ventrales de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %. Laisser tremper pendant 1 min.
- Pincer et tirer la peau du bas-ventre et recoupent le plus proche de l’abdomen avec des ciseaux chirurgicaux stériles à la base de la peau pincée. Tirez la peau coupée vers l’avant (c'est-à-dire, vers la tête) pour révéler le foie. Notez que le foie doit être élargi et moucheté en raison d’une réaction granulomateuse induite par l’oeuf (Figure 2 a).
- Retirer le foie et le placer dans un bécher de 200 mL de stérile 1,2 % NaCl solution contenant pen/infection streptococcique.
- Répétez les étapes 1.3 et 1.4 avec souris restants.
NOTE : Vingt souris sont généralement transformées en une seule récolte. - Placer les foies dans une boîte de Petri stérile et supprimer non-foie gras/conjonctif avec une pince stérile.
- Transférer garnis/nettoyer les foies dans une bouteille stérile centrifugeuse de 250 mL contenant environ 200 mL de solution de NaCl 1,2 % stérile avec stylo/strep.
- Vigoureusement secouer le flacon contenant le foie et, à l’aide d’une pipette stérile à usage unique, supprimer la surface excédentaire mousse/flotter des débris. Lentement, videz le reste de la solution saline dans un récipient ou évier contenant 1 % eau de Javel (désinfectant).
- ~ 200 mL de sérum physiologique frais s’ajoute les foies et répétez l’étape 1.8 trois fois plus.
2. foie extraction et miracidiale isolation
- Placer les foies dans une tasse de petit mélangeur en acier inoxydable stérile et ajouter environ 2 mL de solution de NaCl à 1,2 % (Figure 2 b).
- Couvrir la coupe avec grille et une boîte de Pétri pour prévenir les déversements et mélanger pendant 1 min en alternant les haute et basse vitesse (20 s faible vitesse/10 s grande vitesse ; répétition) (Figure 2).
- Répartir la suspension du foie mélangée dans des bouteilles stériles centrifugeuse de 250 mL (pour 20 foies utilisent 4 bouteilles).
- Ajouter une solution saline stérile avec des antibiotiques à ~ 200 mL total volume/bouteille. Poids/équilibre bouteilles avant la centrifugation.
- Centrifuger les foies mélangés à 290 x g pendant 15 min à 4 oC. doucement décanter surnageants dans un récipient avec l’eau de Javel avant d’être jetés.
- Répétez les étapes 2,4-2,5 fois. Assurez-vous de complètement remettre en suspension des sédiments du foie avant la centrifugation.
- Après avoir jeté la dernière saline laver (étape 2.6), ajouter 200 mL d’eau stérile étang avec stylo/strep dans le tissu hépatique granulé, secouez pour remettre en suspension des sédiments et transférer la suspension dans une fiole jaugée de 1 L stérilisée qui a été entièrement recouvert d’aluminium fleuret, à l’exception de la partie supérieure de 3 cm de l’encolure (Figure 2D).
Remarque : Utilisez deux bouteilles (= 10 foies) par flacon de 1 L. L’eau du bassin simule l’environnement d’eau douce naturel nécessaire pour stimuler la miracidiale l’éclosion des oeufs. - À l’aide de l’eau stérile, remplir le ballon à environ 3 cm au-dessus de la grille qui couvre le cou. Alors, sans délai (comme miracidia bientôt commencer à éclore), enlever la mousse résiduelle et le tissu hépatique flottant à la surface en pipettant également rapidement jusqu'à environ 12 mL d’eau contenant des débris et jeter dans un séparé jeter le tube. Remplacer avec de l’eau fraîche étang stérile.
- Répétez le nettoyage étape 2.8, plus trois fois, en vérifiant la présence des miracidia dans le tube de rejet. Cesser de répétition de l’étape de nettoyage si miracidia apparaît dans la solution de lavage.
- Après le dernier lavage, ajouter lentement ~ 12 mL d’eau stérile chaud (préchauffé à 30 oC) pour créer un gradient de température avec l’eau chaude propre et stérile sur le dessus.
Remarque : Il est préférable de faire décharger lentement l’eau le long du côté de l’encolure du flacon pour éviter le mélange. - Placer une petite boîte de Pétri de la couverture sur l’ouverture de la fiole et briller d’une lumière vive dans le haut du ballon au-dessus du couvercle de papier d’aluminium pour éclairer la surface supérieure de l’eau.
Remarque : En général, moins de 5-10 min, natation miracidia, attirés par la lumière, se concentrera en grand nombre dans les premiers 2-3 cm d’eau (Figure 3 a).
3. miracidiale récolte et culture
- Lorsque miracidia ont amassé à la surface après 10 min, à l’aide d’une pipette de transfert stérile, retirer environ 8 mL de l’eau du bassin et transférer dans un tube à centrifuger de 15 mL stérile. Placer le tube contenant des miracidia sur la glace.
- Ajouter arrière 8 mL d’eau stérile chaud à l’intérieur de la fiole jaugée et attendre encore 10 min.
- À l’aide de tubes neufs chaque fois, répétez les étapes 3.1 et 3.2 trois fois plus. Après la collection deth 4, maintenir le tube final sur la glace pendant 10 min permettre le miracidia à régler. Cet ensemble de tubes comprend la première récolte.
- Tubes à centrifuger contenant miracidia à 290 g pendant 1 min à 4 oC dans une centrifugeuse réfrigérée refroidie.
- Retirez immédiatement la majeure partie du liquide surnageant (~ 7 mL) en veillant à ne pas déranger le culot du parasite (Figure 3 b).
- Piscine tous le miracidia de cette première récolte en un seul tube, puis rincer tous les tubes originaux avec l’eau du bassin stérile ~ 1 mL et ajouter dans le tube « combiné ».
- Permettre aux parasites de s’installer sur la glace pendant environ 5 min et centrifuger à nouveau les parasites à 290 g pendant 1 min à 4 oC.
- Avec précaution, retirez le surnageant et ajouter que 6 à 8 mL stérile Chernin équilibré contenant pen/infection streptococcique de solution saline (CBSS + ; voir Table des matières).
- Suspendez doucement le miracidia et l’aliquote dans une plaque de culture de 24 puits (1 mL / puits), suivi par le tube de rinçage en 6 à 8 mL CEMB + et ajouter 1 mL de rinçage à chaque puits. Incuber les parasites à 26 oC dans des conditions normoxiques. Concentrations de miracidia isolé peut varier, mais habituellement en moyenne à environ 7 000/mL.
- Si les parasites sont concentrent encore la source lumineuse, répétez les étapes 3.1 à 3.9 pour poursuivre la récolte miracidia éclosion tardive mais augmenter l’intervalle de temps entre les collections à 15-20 min.
Remarque : Ce nouveau jeu de tubes représente la deuxième récolte. Cependant, parce que les nombres de miracidiale sont généralement faibles, larves de tous les tubes habituellement sont regroupées dans une seule culture cupule contenant 2 mL CEMB +. - À 24h après récolte et culture, doucement Resuspendre les sporocystes dans leurs puits de pipetage.
- Attendre quelques minutes afin de permettre des parasites se déposer au fond des puits. Une fois qu’ils sont sont installés, retirer délicatement le surnageant (~1.5 mL), qui contiendra la plupart des plaques épidermiques ciliées répandu par miracidia durant la transformation des larve. Cette « transformation » surnageante peut être mis au rebut ou incorporée dans des études de suivi des produits de sécrétion larvaires.
- Ajouter 1,5 mL de frais CEMB + à chaque puits et doucement la pipette pour remettre en suspension les sporocystes. Répétez l’étape 3.12 Si vous souhaitez encore laver ou changer pour un autre support.
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Representative Results
La grande majorité des miracidia sera en général ont été recueillie dans les deux premiers « récoltes ». L’incubation des miracidia isolé CEMB + déclenche le processus de transformation miracidia-à-sporocyste (Figure 4 a- C). Dans la première heure suivant transfert à culture puits contenant CEMB +, la majorité des miracidia cessent de natation (Figure 4 a). À 6 h dans la culture, miracidia sont en train de faire activement leurs plaques épidermiques ciliés (Figure 4 b). Parallèlement à ce processus de délestage, les larves forment leur enveloppe tégumentaire syncytial extérieure comme ils se transforment en sporocystes primaires. La plupart des parasites auront terminé la transformation larvaire, devenir des sporocystes complètement formé, en culture après 24-48 h en CEMB + (Figure 4). Après 4 jours de culture en CEMB + seul, survie sporocyste est censée diminuer d’environ 80 %. Toutefois, les sporocystes cultivés pendant 1 jour au CEB + et ensuite transféré au milieu de Bge (cBge) complet pour les 3 jours entraîner généralement meilleurs taux de survie et les larves avec un aspect plus robuste (Figure 4). Viabilité du sporocyste reste généralement stable entre 4 et 7 jours en cBge avec continué d’augmenter la croissance des larves pendant ce temps dans la culture par rapport à la CEB + seul.
Figure 1 . Vue d’ensemble du flux de travail protocole. Résumé schématique des grandes étapes de l’isolement et culture des miracidia dérivé de souris infectées par la douve du sang humain, S. mansoni. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Traitement des foies infectés. Foie de souris (A) fortement infecté avec des œufs de S. mansoni . Notez la taille élargie, couleur anormale et la présence de granulomes dans le foie infecté (à droite) par rapport à un foie non infecté normal (à gauche). (B) lavé souris foies après le transfert à la tasse du mélangeur en acier inoxydable stérile. Les foies ont été mélangés alors pendant une minute à l’aide de feuilles stériles et boîte de Pétri pour couvrir la coupe, afin d’éviter les déversements (C). Après mélange, l’homogénat de foie, contenant des oeufs, a été lavé plusieurs fois dans une solution saline et remis en suspension dans l’eau stérile, avant d’être transféré dans une fiole jaugée de 1 L recouvert de papier d’aluminium (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Récolte S. mansoni miracidia. Activement la natation miracidia concentré par attraction de lumière au dessus de la fiole jaugée (A). À intervalles de 10 min, les parasites sont récoltées à l’aide d’une pipette et placés à 4 ° C pour immobiliser des larves. Miracidia sont ensuite lavés dans CEB + par centrifugation et recueilli dans un tube unique (B) juste avant la distribution aux puits d’une plaque de culture. NCLE + ; Chernin équilibré de solution saline (Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Miracidiale transformation de sporocystes primaires et leur entretien à la vitro . Miracidia de S. mansoni et les sporocystes placé dans la culture in vitro pour des moments différents après récolte. Miracidia nouvellement récolté moins de 1 h de culture CEMB + (A). Après 6 h de culture, miracidia ont commencé à jeter leurs plaques épidermiques ciliés (flèches), comme ils se transforment en sporocystes primaires (B). Après 24h dans CEB + la plupart du miracidia ont complètement transformé de sporocystes primaires (C). Les sporocystes ont été transformés CEMB + pendant 24 h, puis transférés et maintenues dans un milieu de cBge pendant 3 jours (D). Les sporocystes généralement apparaissent plus robustes et ont des taux de survie supérieurs à culture après 4 jours en présence de cBge, comparativement à CEMB + seul. NCLE +, Chernin équilibré de solution saline ; cBge moyen, complet b. glabrata embryonnaires de cellules moyennes (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Miracidia de S. mansoni, isolé et manipulé comme décrit ci-après, peut infecter seulement l’hôte intermédiaire d’escargot et par conséquent ne représentent pas un danger biologique humain au cours de cette phase du développement larvaire. Toutefois, pour éviter l’exposition/infection accidentelle d’escargots, il faut pour exécuter des isolations miracidiale dans un emplacement différent des zones où des espèces d’escargots Biomphalaria sensibles peuvent être présents ou entretenu. Une salle séparée, enregistrée comme espace BSL2, est fortement recommandée. En outre, laver toutes les solutions utilisées dans le traitement des foies et de larves d’isolement doivent être traitées avec désinfectant (par exemple, 1 % eau de Javel) avant des éliminer.
Il est à noter qu’infecté de l’ablation chirurgicale des foies de souris et leur traitement ultérieur avant mélange/homogénéisation est effectuée sous une hotte de sécurité biologique (BSC) dans des conditions aseptiques. Cependant, pour des raisons pratiques (facilité de la manipulation des échantillons en vrac) toutes les autres procédures sont effectuées sur une paillasse désinfectée utilisant des containers de stérilisation (p. ex., mélangeur tasses, flacons, bouteilles et tubes, pipettes de transfert, etc.) et de la solutions stériles contenant des antibiotiques (eau saline, d’étang, CEMB). Antibiotiques sont ajoutés à toutes les solutions par mesure de précaution supplémentaire contre la contamination microbienne introduite. En outre, au cours de l’isolement de miracidiale et la récolte des étapes (protocole, Sections 2 et 3), une petite boîte de Pétri de la couverture est placée sur le ballon afin de minimiser la contamination extérieure pendant l’enlèvement initial de débris de mousse/foie et de la cession ultérieure des miracidia concentré du flacon de centrifuger les tubes.
En général, nous récoltons miracidia de 20 foie de souris infectés en un seul lot, dont nous estimons larvaires rendements d’environ 5 000 larves par foie. Cependant, les rendements peuvent varier considérablement selon l’intensité de l’infection des souris individuels résultant en lot à variation miracidiale recouvrements. Des isolations peut être effectuée à l’aide de foies de départ moins, bien que la méthode que nous avons décrit s’applique généralement pour les foies de 10-20. Lorsque 20 foies sont traitées, après la remise en suspension définitive des boulettes du foie dans l’eau stérile (protocole Section 2, étape 2.7), les suspensions doivent être réparties également en deux flacons de 1000 mL (2 bouteilles/flacon). Si 10 foies ou moins sont utilisés, l’originales homogénats de foie (Protocole N° 2 de la Section, étape 2.3) peuvent être distribuées aux 2 bouteilles et lavé puis transférées dans une fiole jaugée unique pour un traitement ultérieur des suspensions. Un ou 2 foies peuvent également être transformées, mais quantité (volume) d’extraction, de lavage et de l’éclosion des solutions doit être réduite proportionnellement, avec finale lavé de sédiments dans l’eau étant transféré dans une fiole jaugée 10 mL recouvert de papier pour se concentrer miracidia.
Afin de maximiser les rendements de miracidiale avec un minimum de contamination des débris du foie, il est également important d’effectuer les lavages de l’eau d’étang (Protocole N° 2 de l’article, pas de 2,7 à 2,9) aussi rapidement et efficacement que possible. Une fois que les oeufs sont exposés à l’eau du bassin, miracidiale l’éclosion a lieu peu de temps après, bien que le temps avant aspect larvaire à la source lumineuse dans le col de la fiole peut varier de 5 à 20 min après l’éclosion commence. Pour limiter les pertes de parasites au cours de l’étang l’eau nettoyage étapes il est crucial de vérifier visuellement chaque étang laver pendant des miracidia arrivée précoce dans la couche d’eau supérieure du col de la fiole. En outre, une fois miracidia sont transférées aux tubes de prélèvement de 15 mL et sont placés sur la glace, ils cesser l’activité de natation et s’installer au fond du tube. Cependant, après centrifugation pour granuler larves (Section 3, étapes 3,4-3,5), miracidia partira encore se baigner si l’eau n’est autorisé à chaud. Par conséquent, il est important de retirer l’eau du bassin rapidement, mais sans déranger le culot ou de pipetage des parasites de natation.
Tel que mentionné précédemment, les rendements des miracidia isolé peuvent varier selon le nombre de paires de ver adulte présents chez la souris individuels (intensité de l’infection) et la cohérence des protocoles de l’infection initiale. Miracidia sont fortement phototropique et la majorité (80 à 90 %) se concentrera sur la source lumineuse pendant la première période de récolte. Les 10-20 % restants des miracidia continuera à éclore et plus s’accumuler lentement au cours de la deuxième période de récolte. Plus (> 95 %) ont transformera miracidia introduit dans la culture et maintenue à 26 oC dans un milieu CEMB + de sporocystes primaires sous 24-48 h de culture. A cette époque, viabilité larvaire est généralement > 90 %. Après 4 jours de CEB + viabilité seule diminue considérablement (70-80 %). Cependant, passer le milieu de culture de CEB + à Bge moyen 24h qui suit mise en culture initiale CEMB entraîne des taux de survie plus élevés et une croissance plus vigoureuse. Régulièrement, nous maintenons les cultures sporocyste à court terme dans des conditions normoxiques. Toutefois, les sporocystes sont très sensibles aux niveaux d’oxygène et en particulier pour les espèces réactives de l’oxygène qui peuvent infliger des dommages oxydatifs délétères7. C.J. Bayne4 et autres ont rapporté que la santé globale et la viabilité des sporocystes in vitro sont nettement améliorées lorsque les cultures sont maintenues dans des conditions hypoxiques. Taux d’oxygène baisse s’adressant par gazage (avec de l’azote) des flacons à fermeture individuelles, soit par enrichissement en azote de la phase gazeuse de l' incubateur4.
Comme cités ci-dessus, méthodes pour isolant et en cultivant des schistosomes axéniques miracidia et les sporocystes ont été décrites précédemment. Il a été reconnu dès le début que miracidiale phototropisme pourrait servir à attirer et à concentrer les larves de natation et que miracidia isolé pourrait être rapidement immobilisé hyperosmotique solutions salines (entre 120-160 mOs/Kg)8. On a fait observer qu’en maintenance en solutions salines résulte dans la transformation des miracidia pour sporocystes primaires, le premier stade larvaire apporte9,12. Des milieux complexes aussi ont été formulés à l’appui à long terme in vitro la croissance et le développement de la S. mansoni sporocyste étapes9,13,14,15, ainsi que les cellules dérivé de l’hôte escargot Biomphalaria glabrata,16. Ces formulations constituée de divers médias commerciaux et mai ont été complétées par des acides aminés, lipides, agents réducteurs et sels sucres. Formulations de médias complet incluaient également inactivés par la chaleur fœtale bovine ou sérum de cheval à différentes concentrations. Nous avons trouvé que bon-inactivation par la chaleur (HI) était crucial à la survie de sporocystes et de développement à long terme en vitro. Nous avons trouvé que l’incubation du sérum (bouteilles décongelés, 100 mL) dans un bain-marie à 60 oC pendant 60 min, avec doux mélange toutes les 10 min pour uniforme de chauffage était le plus efficaces. En outre, nous testons habituellement plusieurs lots de sérum d’un fournisseur éventuel compatibilité culture larvaire. Enfin, la mise en place d’une lignée cellulaire chez les mollusques authentique première (et actuellement seulement), la lignée de cellules embryonnaire (Bge) de b. glabrata par Hansen16 a été une percée majeure qui facilitait considérablement avancées en schistosome larvaire efforts de culture. Isolé des miracidia de S. mansoni , lorsqu’il est placé en culture mixte avec Bge cellules développées depuis le primaire à sporocystes secondaires/fille17et finalement à la dernière étape de cercaires18,19. Ainsi, continue in vitro culture de la phase d’escargot entière du cycle de vie de S. mansoni est parvenue. Le support de cellule de Bge utilisé dans notre système de culture prend en charge les sporocyste croissance/développement et maintien de la lignée cellulaire de Bge.
En résumé, nous avons décrit et illustré visuellement un protocole détaillé pour la masse axéniques d’isolement et de la culture de l’étape de nage libre miracidiale de S. mansoni. Ces miracidia, lorsqu’ils sont soumis à des conditions de culture appropriées, sont capables de développer à des générations successives de sporocystes primaires et secondaires et finalement des cercaires. Avec le développement et l’amélioration continue des outils actuellement disponibles pour manipuler les gènes et gene expression in vitro par le biais de transgéniques, l’interférence ARN et génome d’édition (par exemple, CRISPR/Cas9) approches, il est prévu qu’efficace Méthodes d’isolement et culture des miracidia de diverses espèces de trématodes20 continuera d’être nécessaire afin de se procurer les matériaux pour davantage d’avancement de la recherche dans ce domaine. Cette méthode vient joliment compléter un protocole décrit précédemment pour isoler et cultivant des cercaires libres de S. mansoni pour faciliter en vitro transformation au stade mammifère schistosomula21, pour éventuelle culture à ovigères adulte worms22.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financé en partie par la subvention de NIH RO1AI015503. Souris infectées par les schistosomes ont été fournis par le NIAID schistosomiase Resource Center à l’Institut de recherche biomédicale (Rockville, MD) par le biais de NIH-NIAID contrat HHSN272201000005I pour distribution au moyen de ressources de la BEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
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