Summary
I artikeln beskrivs ett protokoll för storskalig axenic isolering och samling av frisimmande miracidia av mänskligt blod fluke Schistosoma mansoni och deras efterföljande behandling för införsel i vitro kultur.
Abstract
Människans blod VALSTJÄRT, Schistosoma spp., har en komplicerad livscykel som innebär sexuell och asexuell utvecklingsfaser inom en snigel mellanliggande och däggdjur slutliga-värd som, respektive. Möjligheten att isolera och upprätthålla de olika livscykelstadier villkor i vitro kultur har underlättat utredningar av de cellulära, biokemiska och molekylära mekanismer som reglerar parasit tillväxt, utveckling och värd interaktioner. Överföring av snäckfeber kräver asexuell reproduktion och utveckling av flera larval arrangerar inom snigel värden; från den smittsamma miracidium, genom primär och sekundär sporocysts, till den sista cercarial etappen som är infekterat människor. I denna uppsats presenterar vi ett stegvisa protokoll för massa kläckning och isolering av Schistosoma mansoni miracidia från ägg erhållits från lever av infekterade möss och deras efterföljande införsel i vitro kultur. Det förväntas att de detaljerade protokollet kommer att uppmuntra nya forskare att engagera sig i och bredda detta viktiga område av schistosome forskning.
Introduction
Mänskligt blod VALSTJÄRT Schistosoma spp., är smittämnen snäckfeber, en försummade tropiska sjukdomar som drabbar en uppskattade 230 miljoner människor världen över1. Den mest utbredda arten, Schistosoma mansoni, är geografiskt fördelade i Sydamerika, den Karibiska övärlden, Mellanöstern och subsahariska Afrika2. Livscykeln för S. mansonioch andra schistosomes, är komplex, som inbegriper en däggdjur slutgiltig värd och sötvatten sniglar i släktet Biomphalaria som fungerar som obligat mellanliggande värdar.
S. mansoni manliga och kvinnliga vuxen mask par lever i de däggdjur värd reproducera, bakre mesenteriska vener resulterar i utsläpp av embryonated ägg (ova) som fastna i de små venoler av tarmslemhinnan. Ägg sedan bryter genom kärlväggen, vandrar genom slemhinnor vävnad, och så småningom ange intestinala lumen där de annulleras med avföring. När ägg in sötvatten och frisimmande yngel (miracidia) hatch, måste, de på kort tid, hitta en lämplig Biomphalaria snigel att infektera för att fortsätta sin livscykel. Infektion innebär miracidial fastsättning snigelns yttre karossyta följt av aktiv penetration och inträde för larven i värden. Snart efter posten börjar miracidium att kasta sina yttre cilierade epidermal plattor eftersom det utgör ett syncytium som kommer att bli den nästa larvstadium, den primära eller mor sporocyst nya yttre yta (tegument). Genom asexuell reproduktion, varje primär sporocyst producerar och släpper en andra generation av sporocysts, kallas sekundär eller dotter sporocysts, som i sin tur genererar och frigöra stora mängder intramolluscan slutskedet, cercaria3 . Vid fly från snigel värden är frisimmande cercariae kan ansluta till och tränga direkt in i huden på en människa eller annan lämplig däggdjur värd. Vid inresa till sin nya värd, cercariae förvandla till parasitiska schistosomula scenen och invadera det vaskulära systemet. De, flyttar i sin tur till lungan och sedan till nedsatt ven där de mogna till vuxna maskar, bildar manliga och kvinnliga par och resa till mesenteriska vener att slutföra sin livscykel.
Lyckade intramolluscan eller ”snigel fas” utveckling av larval schistosomes är avgörande för fortsättningen av cykeln av mänsklig värd-till-värd överföring. Av avgörande betydelse är perioden följande post av de frisimmande miracidium snigel värden och sin tidiga omvandling till primära sporocyst scenen. Beroende på den fysiologiska och immunologiska kompatibiliteten mellan värd och parasit är det under denna fas av larval utveckling det inledande framgång eller misslyckande att fastställa infektioner är beslutsam4,5,6 . Framtida utveckling av primär sporocysts kan producera asexuellt sekundära sporocysts, som sedan generera mänskliga-smittsam cercariae, kräver ytterligare en tillåtande fysiologiska värd miljö som tillhandahåller för alla parasitens tillväxt och reproduktiva behov.
Hittills har lite är känt om den underliggande fysiologiska, biokemiska och molekylära processer som styr schistosome-snigel interaktioner, särskilt de molekyler och vägar involverade i reglerar larval utveckling och reproduktion, eller modulerande värd immunsvar. Tillgång till stort antal dessa larval arrangerar i vitro kultur villkor som tillåter experimentella manipulation skulle avsevärt underlätta upptäckten av utvecklingstoxicitet vägar och bakomliggande mekanismer för celltillväxt, differentiering och reproduktion. Kritiska parasit vägar eller mekanismer, identifierade genom in vitro- försök, kunde sedan användas för att störa larval tillväxt/reproduktion i snigel värden, eller att identifiera snigel värd immunologiska mekanismer involverade i erkännande och eliminering av miracidial eller sporocyst steg.
I denna artikel och videopresentation, vi ger en detaljerad beskrivning av en metod för att isolera ett stort antal frisimmande S. mansoni miracidia för införsel i vitro kultur som sedan kan bli föremål för uppföljning experimentella manipulation (se figur 1 för en schematisk översikt över arbetsflödet protokoll). Även om liknande förfaranden har beskrivits tidigare7,8,9, vi kände att ett detaljerat protokoll skulle vara användbar för forskare som vill anställa denna modell att ta fortfarande obesvarade frågor relaterade till intramolluscan larver utveckling, cellulär proliferation och schistosome-snigel immun interaktioner. Detta tillvägagångssätt kan dessutom enkelt anpassas för isolering av ägg från andra medicinskt viktiga sugmaskar såsom urinblåsan-bostad S. haematobium, levern VALSTJÄRT eller lung VALSTJÄRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurens vård och experimentella rutiner godkändes av institutionell djur vård och användning kommittén av University of Wisconsin-Madison enligt protokoll nr. V005717. Följande protokoll innebär en biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) anläggning för mänskliga patogener, även om ingen av schistosome arrangerar skildras i detta protokoll är smittsam till människor eller andra däggdjur. Följ institutionella principer för att hantera Risk grupp 2 (RG2) mänskliga patogener.
Obs: Vi använder Swiss-Webster honmöss (6 - vecka gammal) på grund av sin högre känslighet för infektion10, vilket därmed ger större ägg bördor. Tucker et al. beskriver mus- och snigel infektion-protokoll som används i denna modell system11. Tabell för material visar alla särskild utrustning, material, reagens och animaliska källor behövs för att genomföra detta experimentellt protokoll.
1. behandling av infekterade lever
- Euthanize möss, 6-7 veckor efter infektion, av CO2 kvävning (frekvens på 10-30% av kammarens volym per minut). Övervaka möss för upphörande av andning och hjärtslag.
Obs: Normalt upp till 20 möss får behandlas vid en given tidpunkt. - Efter överför euthanized möss till en biosäkerhet skåp, placera möss på ryggen och spraya deras ventrala yta med 70% etanol. Låt dra i 1 min.
- Nypa och dra upp huden på nedre delen av buken och skär över basen av nöp huden närmast buken med sterila kirurgiska saxar. Dra skära huden anteriorly (dvs mot huvudet) att avslöja levern. Observera att levern är förstorad och spräckliga på grund av ett ägg-inducerad granulomatöst svar (figur 2A).
- Ta bort levern och placera det i en bägare som innehåller 200 mL steril 1,2% NaCl lösning innehållande penna/strep.
- Upprepa steg 1.3 och 1.4 med återstående möss.
Obs: Tjugo möss behandlas vanligtvis i en enda skörd. - Placera lever i en steril petriskål och ta bort icke-lever fett/bindväv med steril pincett.
- Överföra trimmas/rengöras lever till en steril 250 mL centrifug flaska innehållande ~ 200 mL steril 1,2% NaCl-lösning med penna/strep.
- Kraftfullt skaka flaskan som innehåller lever och med sterila disponibla pipett, ta bort överflödig yta skum/flytande skräp. Långsamt Häll av den återstående saltlösning i en behållare eller sink innehållande 1% blekmedel (desinfektionsmedel).
- Tillsätt ~ 200 mL färsk koksaltlösning till lever och upprepar steg 1,8 tre gånger.
2. lever utvinning och miracidial isolering
- Placera lever i en liten steril rostfritt stål mixer kopp och lägga till ~ 2 mL 1,2% NaCl-lösning (figur 2B).
- Täck bägaren med folie och en petriskål att förhindra spill, och blanda i 1 min av omväxlande låg och hög hastighet (20 s låg hastighet/10 s hög hastighet, upprepa) (figur 2 c).
- Fördela jämnt blandade lever suspensionen i sterila 250 mL centrifug flaskor (för 20 lever Använd 4 flaskor).
- Lägga till steril koksaltlösning med antibiotika ~ 200 mL totala volym/flaskan. Väga/balans flaskor innan centrifugering.
- Centrifugera blandade lever vid 290 x g i 15 min på 4 oC. försiktigt Häll av supernatanterna i en behållare med blekmedel före kassering.
- Upprepa steg 2,4-2,5 en gång. Var noga med att noggrant resuspendera lever sediment före centrifugering.
- Efter att kasta den sista saltlösning tvätta (steg 2,6), tillsätt 200 mL steril damm vatten med penna/strep pelleterat levern vävnad, skaka att resuspendera sediment och överför till en steriliserad 1-L mätkolv som har varit helt täckt med aluminium folie, utom överst 3 cm av halsen (figur 2D).
Obs: Använd två flaskor (= 10 lever) per 1-L kolv. Dammen vatten simulerar den naturliga sötvatten miljön som behövs för att stimulera miracidial kläckning av ägg. - Med steril damm vatten fylla upp kolven till ca 3 cm ovanför folien täcker halsen. Sedan, utan dröjsmål (när miracidia börjar snart att kläckas), ta bort återstående skum och levervävnad som flyter på ytan av snabbt pipettering upp ~ 12 mL damm vatten som innehåller skräp och kasta det i en separat kasta tube. Ersätta med färsk steril damm vatten.
- Upprepa rengöring steg 2,8, ytterligare tre gånger, kontroll förekomst av miracidia i kassera tuben. Upphöra upprepning av rengöring steg om miracidia visas i tvättlösningen.
- Efter den sista tvättningen, sakta lägga ~ 12 mL varm steril damm vatten (pre värmas till 30 oC) för att skapa en temperaturgradient med rena, sterila varmt vatten på toppen.
Obs: Detta sker bäst genom att långsamt urladda vatten längs sidan av kolven halsen för att undvika att blanda. - Placera en liten petriskål täcka över kolven öppning och skina ett ljus över toppen av kolven över folie locket att belysa den övre ytan av vatten.
Obs: Normalt inom 5-10 min, simning miracidia, lockas till ljuset, kommer att koncentrera sig i stort antal inom de första 2-3 cm damm vatten (figur 3A).
3. Miracidial skörd och odling
- När miracidia har samlat på ytan efter 10 min, med hjälp av en steril överföring Pipettera, ta bort ~ 8 mL damm vatten och överföring till ett sterilt 15 mL centrifugrör. Placera röret som innehåller miracidia på is.
- Lägg tillbaka 8 mL varm steril damm vatten längs insidan av mätkolven och vänta en annan 10 min.
- Med nya rör varje gång, upprepa steg 3.1 och 3.2 tre gånger. Efter samlingen 4th , hålla det sista röret på is för 10 min så att miracidia sedimentera. Denna uppsättning rör består av den första skörden.
- Centrifugrör som innehåller miracidia på 290 x g för 1 min på 4 oC i en nedkylda kyld centrifug.
- Ta omedelbart bort de flesta av supernatanten (~ 7 mL) var noga med att inte störa den parasit pelleten (figur 3B).
- Pool alla miracidia från denna första skörd till ett rör, sedan skölj alla ursprungliga rören med ~ 1 mL steril damm vatten och lägga till ”poolade” röret.
- Tillåta parasiter sedimentera på is för ~ 5 min, och igen Centrifugera parasiter på 290 x g för 1 min på 4 oC.
- Försiktigt avlägsna supernatanten och lägga till 6-8 mL steril Chernins balanserad saltlösning (CBSS +, se tabell för material) innehållande penna/strep.
- Försiktigt upphäva de miracidia och alikvot dem till en 24-väl kultur platta (1 mL per brunn), följt av sköljning röret i 6-8 mL CBSS + och att tillsätta 1 mL skölj i varje brunn. Inkubera parasiter på 26 oC normoxic villkor. Koncentrationer av isolerade miracidia varierar, men vanligtvis i genomsnitt ~ 7000/mL.
- Upprepa steg 3.1 till 3,9 att fortsätta skörda sent-kläckning miracidia om parasiter fortfarande koncentrerar sig på ljuskällan, men öka tidsintervallet mellan samlingar till 15-20 min.
Notera: Denna nya uppsättning rör representerar den andra skörden. Men eftersom miracidial nummer är vanligtvis låga, sammanförs larver från alla rör oftast till en enda kultur brunn innehållande 2 mL CBSS +. - På 24 h efter skörd och odling, försiktigt blandas sporocysts i sina brunnar av pipettering.
- Vänta några minuter för att tillåta parasiter sedimentera till botten av brunnarna. När de har bosatt sig, ta försiktigt bort supernatanten (~1.5 mL), som kommer att innehålla de flesta av cilierade epidermal plattorna skjul av miracidia under larval omvandlingen. Denna ”transformation” supernatant kan antingen kasseras eller införlivas med uppföljande studier av larval sekretoriska produkter.
- Tillsätt 1,5 mL färsk CBSS + till varje brunn och försiktigt pipetten att resuspendera sporocysts. Upprepa steg 3.12 önskas ytterligare tvätt eller byte till annan databärare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Majoriteten av miracidia kommer vanligtvis har samlats i de två första ”skördarna”. Inkubering av isolerade miracidia i CBSS + utlöser miracidium-till-sporocyst omvandlingsprocessen (Figur 4A- C). Inom den första timmen brunnar följande överföring till kultur som innehåller CBSS +, majoriteten av miracidia upphör simning (figur 4A). 6 h i kultur håller miracidia på att aktivt sprider sina cilierade epidermal tallrikar (figur 4B). Sammanfaller med denna utgjutelse process, larverna bildar deras yttre syncytial tegumental höljet när de omvandlas till primära sporocysts. De flesta av parasiterna kommer att ha avslutat larval omvandling, att bli fullt bildade sporocysts, genom 24-48 h efter odling i CBSS + (figur 4 c). Efter 4 dagar av kultur i CBSS + ensam, kan sporocyst överlevnad förväntas minska till ~ 80%. Dock sporocysts odlade för 1 dag i CBSS + och överförs sedan till komplett Bge (cBge) medium för 3 dagar normalt resultera i bättre överlevnaden och larver med ett mer robust utseende (figur 4 d). Sporocyst lönsamhet generellt sett fortfarande stabil mellan 4 och 7 dagar i cBge med fortsatt ökning larval tillväxt under denna tid i kultur jämfört CBSS + ensam.
Figur 1 . Översikt över protokollet arbetsflöde. Schematisk Sammanfattning av större stegen i isoleringen och odling av miracidia härrör från möss som infekterats med humant blod fluke, S. mansoni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bearbetning av infekterad lever. (A) mus lever kraftigt infekterad med S. mansoni ägg. Observera den utvidgade storleken, onormal färg och förekomst av granulom i infekterade levern (höger) jämfört med en normal oinfekterade lever (till vänster). (B) Washed musen lever efter överföring till sterila rostfritt stål mixer cup. Lever var sedan blandas i en minut med steril folie och petriskål för att täcka koppen, därmed undvika spill (C). Efter blandning, var levern Homogenatet, innehåller ägg, tvättas flera gånger i saltlösning och resuspended i steril damm vatten, innan de överförs till en mätkolv på 1-L täckt med aluminiumfolie (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Skörd S. mansoni miracidia. Aktivt simning miracidia koncentrerat av attraktion till ljus överst på mätkolven (A). Med 10 minuters mellanrum, parasiter skördas med pipett och placeras vid 4 ° C att immobilisera larver. Miracidia sedan tvättas i CBSS + genom centrifugering och samlas i en enda röret (B) strax före distribution till brunnar i en kultur plattan. CBSS +; Chernins balanserad saltlösning (Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Miracidial förvandling till primära sporocysts och deras underhåll in vitro- . S. mansoni miracidia och sporocysts placeras i in vitro- kultur för olika tider efter skörd. Nyligen skördade miracidia inom 1 h av kultur i CBSS + (A). Efter 6 h av kultur, miracidia har börjat sprida sina cilierade epidermal tallrikar (pilar) när de omvandlas till primära sporocysts (B). Efter 24 h i CBSS + har de flesta av miracidia helt omvandlas till primära sporocysts (C). Sporocysts var förvandlade i CBSS + för 24 h, sedan överförs och upprätthålls i cBge medium 3 dagar (D). Sporocysts allmänt visas mer robust och har högre överlevnad på 4 dagar efter odling i närvaro av cBge, jämfört med CBSS + ensam. CBSS +, Chernins balanserad saltlösning; cBge medium, komplett B. glabrata embryonal cell medium (se Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia av S. mansoni, isolerade och manipulerade som beskrivs häri, kan infektera endast snigel mellanliggande värden, och därför utgör inte ett mänskligt biologiskt under denna fas av larval utveckling. Men för att undvika oavsiktlig exponering/infektion av sniglar, bör vara försiktig att utföra miracidial isoleringar på en annan plats från områden där mottagliga Biomphalaria snigel arter kan vara närvarande eller underhållas. Ett separat rum, registrerad som BSL2 utrymme, rekommenderas starkt. Dessutom, alla tvätta lösningar som används i bearbetningen av lever, Rom och larver isolering bör behandlas med desinfektionsmedel (t.ex., 1% blekmedel) innan bortskaffande.
Det bör noteras att kirurgiskt avlägsnande av lever från infekterade möss och deras efterföljande bearbetning före blandning/homogenisering utförs i biologiska säkerhetsdragskåp (BSC) under aseptiska förhållanden. Dock av praktiska skäl (underlätta manipulera bulk prover) är alla andra förfaranden gjort på en desinficerad bänkmonterade utnyttja sterila behållare (t.ex., blender koppar, kolvar, flaskor och tuber, överföring pipetter, etc.) och sterila lösningar som innehåller antibiotika (saltlösning, damm vatten, CBSS). Antibiotika tillsätts alla lösningar som en ytterligare försiktighetsåtgärd mot introducerade mikrobiell kontamination. Dessutom, under miracidial isolering och skörd steg (protokoll avsnitten 2 och 3), är en liten petriskål cover placerad över kolven öppning för att minimera utanför kontaminering under inledande borttagning av skum/levern skräp och efterföljande överföring av koncentrerad miracidia från kolven att Centrifugera rören.
Typiskt, vi skördar miracidia från 20 infekterade mus lever i ett parti, som vi uppskattar larval avkastning av ca 5000 larver per levern. Dock kan avkastningen variera avsevärt beroende på vilken infektion intensitet av enskilda möss resulterar i sats till sats variation i miracidial återställningar. Isoleringar kan utföras med färre start lever, även om metoden har vi beskrivit är allmänt tillämpliga för 10-20 lever. När 20 lever bearbetas, efter sista resuspension av levern pellets i steril damm vatten (protokollenheten 2, steg 2,7), bör upphängningarna fördelas lika i två 1000-mL mätkolvar (2 flaskor/kolv). Om 10 lever eller färre används den ursprungliga lever homogenates (protokoll avsnitt 2, steg 2,3) kan distribueras till 2 flaskor och tvättade suspensioner överförs sedan till en enda mätkolv för vidare bearbetning. En eller 2 lever också kan behandlas, men (volymer) mängder utvinning, tvätta och kläckning lösningar bör minskas proportionellt, med final tvättas sediment i dammen vatten överförs till en 10 mL folie-omfattas-mätkolv att koncentrera miracidia.
För att maximera miracidial avkastning med ett minimum av levern skräp kontaminering, är det också viktigt att utföra de damm vatten tvättarna (protokoll avsnitt 2, steg 2,7-2,9) så snabbt och effektivt som möjligt. När äggen är utsatta för damm vatten, inträffar miracidial kläckning snart därefter, även om tiden innan larval utseende på ljuskällan i kolvens hals kan variera från 5-20 min efter kläckningen påbörjas. För att begränsa förlusten av parasiter under dammen vatten rengöring tvätta steg är det viktigt att kontrollera visuellt varje damm vatten för tidig ankommande miracidia i kolvens hals övre vatten lager. Dessutom när miracidia överförs till 15 mL samling rör och placeras på is, kommer att de upphöra simning aktivitet och lösa röret längst ned. Dock efter centrifugering till pellet larver (avsnitt 3, steg 3,4-3.5), startar miracidia igen att simma om vatten är tillåtet att värma. Därför är det viktigt att ta bort damm vatten snabbt, men utan att störa pelleten eller pipettering upp simning parasiter.
Som tidigare nämnts, av isolerade miracidia kan variera beroende på antalet vuxen mask-par som är närvarande i enskilda möss (infektion intensitet) och konsekvens av initial infektion protokoll. Miracidia är starkt phototropic och majoriteten (80-90%) kommer att koncentrera sig på ljuskällan under skördeperioden första. Resterande 10-20% av miracidia kommer att fortsätta att kläckas och mer ackumuleras långsamt under skördeperioden andra. Mest (> 95%) miracidia införs i kultur och underhålls på 26 oC i CBSS + medium kommer har omvandlas till primära sporocysts inom 24-48 h i odling. Vid denna tid, larval livskraft normalt är > 90%. Efter 4 dagar i CBSS + enbart lönsamheten sjunker avsevärt (70-80%). Dock resulterar byter odlingssubstratet från CBSS + att slutföra Bge medium 24 h följande inledande CBSS odling i högre överlevnadstal och stabilare tillväxt. Vi upprätthåller rutinmässigt kortsiktiga sporocyst kulturer under normoxic förhållanden. Sporocysts är dock ganska känsliga att syrehalten och särskilt reaktiva syreradikaler som kan orsaka skadlig oxidativ skada7. C.J. Bayne4 och andra har rapporterat att den övergripande hälsa och genomförbarheten av sporocysts in vitro- avsevärt förbättras när kulturer bibehålls hypoxisk villkor. Sänkta syrenivåer kan erhållas genom gasning (med kväve) enskilda förslutningsbara kolvar eller kväve-anrikning av gasfas inkubator4.
Som ovan, metoder för axenic isolera och odling av schistosome har miracidia och sporocysts beskrivits tidigare. Det erkändes tidigt att miracidial phototropism kunde användas för att attrahera och koncentrera swimming larver och det isolerade miracidia kunde vara snabbt immobiliserade i hyperosmotisk saltlösningar (mellan 120-160 mOs/Kg)8. Det konstaterades vidare att underhåll i saltlösningar resulterade i omvandlingen av miracidia till primära sporocysts, den första intramolluscan larvstadium9,12. Komplexa media har också formulerats för att stödja långsiktiga in vitro- tillväxt och utveckling av såväl S. mansoni sporocyst stadier9,13,14,15, som celler härrör från snigel värd Biomphalaria glabrata16. Dessa formuleringar införlivas olika kommersiella medier, och kanske har kompletterats med amino syror, salter, lipider, reduktionsmedel och sockerarter. Komplett media formuleringar ingår också Värmeinaktiverade fostrets nötkreatur eller häst serum vid olika koncentrationer. Vi har funnit att korrekt-Värmeinaktivering (HI) var avgörande för sporocyst överlevnad och långsiktig utveckling i vitro. Vi hittade denna inkubation av serum (tinade, 100 mL flaskor) i 60 oC vattenbad för 60 min, med mild blandning varje 10 min för jämn värme var mest effektiva. Dessutom testar vi vanligtvis flera partier av serum från en blivande leverantör för larval kultur kompatibilitet. Slutligen, etableringen av den första (och endast) autentiska blötdjur cellinje, B. glabrata embryonala (Bge) cell raden av Hansen16 var ett stort genombrott som betydligt underlättade framsteg inom larval schistosome odling ansträngningar. Isolerade S. mansoni miracidia, när den placeras i samtidig kultur med Bge celler utvecklas från primär till sekundär/dotter sporocysts17, och så småningom till slutskedet cercarial18,19. Således, kontinuerlig in vitro- odling av fasen hela snigel S. mansoni livscykel har uppnåtts. Bge cell medium används i vår kultur-system stöder både sporocyst tillväxt och utveckling och underhåll av raden Bge cell.
Sammanfattningsvis har vi beskrivs och visuellt illustreras ett detaljerat protokoll för massa axenic isolering och odling av S. mansonifrisimmande miracidial fas. Dessa miracidia, när de utsätts för lämpliga odlingsbetingelser, klarar av att utveckla till successiva primära och sekundära sporocyst generationer, och så småningom cercariae. Med utveckling och kontinuerlig förfining av verktyg tillgängliga för att manipulera gener och gen uttryck i vitro genom transgena, RNA-interferens och arvsmassan redigering (t.ex. CRISPR/Cas9) metoder, det är tänkt att effektiv metoder för isolering och odling av miracidia från olika trematode arter20 kommer att behövas för att anskaffa material för vidare befordran av forskning inom detta område. Denna metod fint kompletterar en tidigare beskrivna protokollet för isolera och odla frisimmande cercariae av S. mansoni underlätta in vitro- omvandling till däggdjur schistosomula scenen21, för eventuella odling till ovigerous vuxen maskar22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Delvis finansierad av NIH grant RO1AI015503. Schistosome-infekterade möss tillhandahölls av NIAID snäckfeber Resource Center vid biomedicinsk Research Institute (Rockville, MD) genom NIH-NIAID kontrakt HHSN272201000005I för distribution via BEI resurser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
