Summary
Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .
Abstract
Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.
Introduction
O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo1. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana2. O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.
Adulto masculino e feminino de S. mansoni verme pares vivem nas veias mesentéricas posteriores de reproduzir o anfitrião dos mamíferos, resultando na liberação de ovos embrionados (óvulos) que se alojaram nas pequenas vênulas da mucosa intestinal. Ovos, em seguida, rompe as paredes dos vasos, migram através do tecido da mucosa e acabaram por inserir o lúmen intestinal onde eles são anulados com as fezes. Quando óvulos digite escotilha de larvas de água doce e livres (miracidia), eles devem, na ordem curta, encontrar um caracol de Biomphalaria apropriado para infectar a fim de continuar seu ciclo de vida. Esse processo de infecção envolve miracidial apego à superfície do corpo exterior o caracol seguido por penetração ativa e entrada da larva no hospedeiro. Logo após a entrada, o miracidium começa a derramar suas placas epidérmicas ciliadas exteriores como forma um sincício que se tornará a nova superfície externa (tegumento) do próximo estágio larval, o sporocyst primário ou mãe. Através de reprodução assexuada, cada sporocyst primário produz e libera uma segunda geração de sporocysts, denominados secundários ou sporocysts filha, que por sua vez, geram e liberar um grande número de fase intramolluscan final, a cercaria3 . Após a fuga do host de caracol, cercárias livres são capazes de anexar a e penetrando diretamente na pele de um humano ou outro hospedeiro adequado mamífera. Com a entrada em seu novo hospedeiro, cercárias transformam-se para a fase de parasitas schistosomula e invadem o sistema vascular. Eles, por sua vez, migraram para o pulmão e depois para a veia hepática onde amadurecem aos vermes adultos, formam pares masculinos e femininos e viajar para as veias mesentéricas para completar seu ciclo de vida.
Intramolluscan de sucesso ou desenvolvimento de "fase de caracol" de schistosomes larvas é essencial para a continuação do ciclo de transmissão humana de host para host. De importância crítica é a seguinte entrada de período do miracidium livres para o host de caracol e a sua transformação precoce à fase primária sporocyst. Dependendo da compatibilidade fisiológica e imunológica entre hospedeiro e parasita, é durante esta fase de desenvolvimento larval esse sucesso inicial ou falha estabelecer infecções é determinado4,5,6 . Desenvolvimento subsequente de primários sporocysts capazes de produzir assexuadamente sporocysts secundários, o que geram humanos-infectantes cercárias, mais exigem um ambiente de host fisiológicas permissiva que fornece para todo o crescimento do parasita e precisa de reprodutiva.
Até à data, pouco é conhecido sobre a base fisiológica, bioquímica e moleculares processos controlar interações esquistossomíase-caracol, especialmente as moléculas e vias envolveram na regulação da reprodução e desenvolvimento larval, ou modulando respostas imunes de anfitrião. Pronto acesso a um grande número destes estágios larval condições em vitro cultura que permitem a manipulação experimental que iria facilitar muito a descoberta de caminhos do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes do crescimento celular, diferenciação e reprodução. Caminhos críticos parasita ou mecanismos, identificados através de experimentos em vitro , poderiam então ser usados para interromper o crescimento larval/reprodução do acolhimento de caracol, ou para identificar mecanismos imunes de anfitrião de caracol envolvidos no reconhecimento e eliminação de estágios miracidial ou sporocyst.
Neste artigo e o vídeo de apresentação, nós fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar um grande número de livres de S. mansoni miracidia para introdução em vitro de cultura que pode ser sujeito a acompanhamento experimental manipulação (ver Figura 1 para uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo). Embora os procedimentos semelhantes têm sido descritos anteriormente7,8,9, nós sentimos que um protocolo detalhado seria útil para pesquisadores que desejam empregar este modelo para abordar questões ainda sem resposta relacionadas com intramolluscan desenvolvimento larval, proliferação celular e interações imune esquistossomíase-caracol. Além disso, esta abordagem pode facilmente ser adaptada para isolamento de ovos provenientes de outras tremátodes medicamente importantes como bexiga-moradia S. haematobium, solhas de fígado ou acasos de pulmão.
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Protocol
Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Wisconsin-Madison, sob protocolo e cuidados institucionais de Animal nenhum. V005717. O seguinte protocolo envolve o trabalho em uma instituição de nível de biossegurança 2 (BSL2) para patógenos humanos, apesar de nenhum dos estágios esquistossomíase retratados no presente protocolo são infectantes aos seres humanos ou outros mamíferos. Segui as políticas institucionais para a manipulação de agentes patogénicos humanos risco grupo 2 (RG2).
Nota: Nós usamos ratos fêmeas Swiss-Webster (6 - semanas de idade) devido à sua maior susceptibilidade à infecção10, desse modo, produzindo fardos de ovo maiores. Tucker et al descrevem os protocolos de infecção mouse e caracol usados neste modelo sistema11. A Tabela de materiais lista todos os equipamentos específicos, materiais, reagentes e animais fontes necessárias para realizar este protocolo experimental.
1. processamento de fígados infectados
- Eutanásia em ratos, pós-infecção 6-7 semanas, por asfixia de CO2 (taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto). Monitor de ratos para cessação da respiração e batimento cardíaco.
Nota: Normalmente, até 20 ratos podem ser transformados em um determinado momento. - Após a transferência de ratos sacrificados para uma armário de biossegurança, coloque os ratos em suas costas e pulverizar suas superfícies ventrais com etanol a 70%. Deixe de molho por 1 min.
- Beliscar e puxar a pele do abdômen inferior e corte em toda a base da pele comprimida mais próximo ao abdômen com uma tesoura cirúrgica estéril. Puxe a pele cortada anteriormente (ou seja, em direção a cabeça) para revelar o fígado. Observe que o fígado deve ser ampliado e salpicado devido a uma reação granulomatosa induzida por ovo (Figura 2A).
- Remover o fígado e coloque-o em um béquer contendo 200 mL de estéril 1,2% NaCl solução contendo caneta/estreptococos.
- Repita as etapas de 1.3 e 1.4 com ratos restantes.
Nota: Vinte ratos geralmente são processados em uma única colheita. - Coloque os fígados em uma placa de Petri estéril e remover não-fígado gordo/conjuntivo tecidos com Pinças esterilizadas.
- Transferi aparadas/limpa fígados para uma garrafa de centrífuga estéril de 250 mL contendo ~ 200 mL de solução de NaCl de 1,2% estéril com caneta/estreptococos.
- Vigorosamente agitar o frasco que contém os fígados e, usando uma pipeta descartável estéril, remover a excesso superfície espuma/flutuante de detritos. Lentamente, despeje o restante da solução salina em um recipiente ou afundar contendo 1% de cloro (desinfectante).
- Adicionar ~ 200 mL de solução salina fresca para os fígados e repita o passo 1.8 mais três vezes.
2. fígado isolamento de extração e miracidial
- Coloque os fígados em um copo pequeno estéril aço inoxidável liquidificador e adicionar ~ 2 mL da solução de NaCl de 1,2% (Figura 2B).
- Cubra o copo com papel alumínio e uma placa de Petri para evitar derramamentos e misturar por 1 min, alternando-se baixa e alta velocidade (20 s baixa velocidade/10 s alta velocidade; repetir) (Figura 2).
- Distribua uniformemente a suspensão de fígado misturada em frascos estéreis 250 mL centrífuga (para 20 fígados usam 4 garrafas).
- Adicione uma solução salina estéril com antibióticos para o volume total de ~ 200 mL/frasco. Peso/equilíbrio garrafas antes da centrifugação.
- Centrífuga de fígados misturados a 290 x g durante 15 min em 4 óC. delicadamente despeje sobrenadantes em um recipiente com água sanitária antes de serem eliminados.
- Repita os passos de 2.4-2.5 uma vez. Certifique-se de completamente Ressuspender o sedimento fígado antes da centrifugação.
- Após descartar a última solução salina lavar (passo 2.6), adicionar 200 mL de água estéril lagoa com caneta/estreptococo no tecido hepático peletizadas, shake para Ressuspender o sedimento e a suspensão de transferência para um balão aferido de 1L esterilizado que foi completamente coberto com alumínio folha, exceto a parte superior do pescoço (Figura 2D) de 3 cm.
Nota: Use duas garrafas (= 10 fígados) por balão 1-L. Água da lagoa simula o ambiente de água doce natural necessário para estimular o miracidial para incubação de ovos. - Usando a água da lagoa estéril, encha o balão para cerca de 3 cm acima da folha cobrindo no pescoço. Então, sem demora (como miracidia logo começam a eclodir), retire a espuma residual e flutuando na superfície, pipetando rapidamente até ~ 12 mL de água da lagoa contendo os restos de tecido hepático e descartá-lo em um separado descartar o tubo. Substitua por água fresca lagoa estéril.
- Repita a limpeza passo 2.8, mais três vezes, verificando a presença de miracidia no tubo de descarte. Cesse a repetição da etapa de limpeza se miracidia aparece na solução de lavagem.
- Após a última lavagem, adicione lentamente ~ 12 mL de água da lagoa estéril quente (pré aquecida a 30 oC) para criar um gradiente de temperatura com água morna limpa e esterilizada por cima.
Nota: Isto é realizado melhor por descarregando lentamente a água ao longo da lateral do pescoço do frasco para evitar a mistura. - Coloque uma pequeno prato de Petri de capa sobre a abertura do frasco e brilhar uma luz brilhante na parte superior do balão acima a capa da folha para iluminar a superfície superior da água.
Nota: Normalmente, dentro de 5-10 min, natação miracidia, atraído pela luz, irá se concentrar em grandes números dentro o primeiros 2-3 cm de água da lagoa (Figura 3A).
3. Miracidial colheita e cultivo
- Quando miracidia reuniram-se na superfície após 10min, usando uma pipeta de transferência estéril, remova ~ 8 mL de água da lagoa e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloca o tubo contendo miracidia no gelo.
- Adicionar fundo 8 mL de água estéril quente ao longo do interior do balão volumétrico e esperar mais 10 minutos.
- Usando novos tubos de cada vez, repita as etapas de 3.1 e 3.2 mais três vezes. Após a coleta deth 4, mantenha o tubo final no gelo durante 10 minutos permitir que o miracidia resolver. Este conjunto de tubos compreende a primeira colheita.
- Tubos de centrífuga contendo miracidia a 290 x g por 1 min em 4 óC numa centrifugadora refrigerada pre-cooled.
- Imediatamente remova a maior parte do sobrenadante (~ 7 mL), tomando cuidado para não perturbar a pelota de parasita (Figura 3B).
- Piscina toda a miracidia desta primeira colheita em um tubo, então Lave todos os tubos originais com água da lagoa estéril ~ 1 mL e adicionar ao tubo de "pool".
- Permitir que os parasitas que se contentar em gelo ~ 5 min e centrifugue novamente os parasitas a 290 x g por 1 min em 4 oC.
- Cuidadosamente, remover o sobrenadante e adicionar que 6-8 mL estéril Chernin balanceamento de solução salina (CBSS +; ver tabela de materiais) contendo caneta/estreptococos.
- Suspenda suavemente o miracidia e alíquota-los em uma placa de cultura de 24 poços (1 mL por bem), seguido de lavagem do tubo em 6-8 mL CBSS + e adicionar 1 mL de lavagem a cada poço. Incube os parasitas em 26 oC sob condições normoxic. Concentrações de miracidia isolado irão variar, mas geralmente média ~ 7000/mL.
- Se parasitas ainda estão se concentrando na fonte luminosa, repita os passos 3.1 a 3.9 para continuar a colheita final-incubação miracidia mas aumentar o intervalo de tempo entre coleções de 15-20 min.
Nota: Este novo conjunto de tubos representa a segunda colheita. No entanto, porque os números de miracidial normalmente são baixos, as larvas de todos os tubos normalmente são agrupadas em uma única cultura bem contendo 2 mL CBSS +. - Em 24h pós-colheita e cultivo, Ressuspender delicadamente sporocysts em seus poços pipetando.
- Espere alguns minutos para permitir que os parasitas resolver no fundo dos poços. Uma vez que eles se instalaram, remova cuidadosamente o sobrenadante (~1.5 mL), que irá conter a maioria das placas ciliadas epidérmicas derramadas por miracidia durante transformação larval. Essa "transformação" sobrenadante pode ser descartada ou incorporada em estudos de seguimento de produtos secretoras larvas.
- Adicione 1,5 mL de CBSS fresco + para cada bem e delicadamente pipeta para Ressuspender sporocysts. Repita a etapa 3.12 se desejar ainda mais lavagem ou mudar para um meio diferente.
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Representative Results
A grande maioria dos miracidia normalmente será foram coletada os dois primeiros "colheitas". Incubação de miracidia isolado na CBSS + desencadeia o processo de transformação de miracidium-para-sporocyst (Figura 4A- C). Dentro da primeira hora seguinte transferência de cultura poços contendo CBSS +, a maioria dos miracidia cessar natação (Figura 4A). Às 6 h em cultura, miracidia estão ativamente derramamento suas placas epidérmicas ciliadas (Figura 4B). Coincidente com este processo de derramamento, larvas formam sua cobertura tegumentar sincicial exterior como elas se transformam para sporocysts primários. A maioria dos parasitas vai ter concluído a transformação larval, tornando-se totalmente formado sporocysts, pelo pós-cultivo de 24-48 h em CBSS + (Figura 4). Após 4 dias de cultura na CBSS + sozinho, sobrevivência sporocyst é susceptível de diminuir a ~ 80%. No entanto, sporocysts cultivadas para 1 dia em CBSS + e em seguida transferido para meio Bge (cBge) completo para 3 dias normalmente resultam em melhores taxas de sobrevivência e larvas com uma aparência mais robusta (Figura 4). Viabilidade de sporocyst geralmente permanece estável entre 4 e 7 dias em cBge com aumento continuado no crescimento larval durante este tempo em cultura, comparado a CBSS + sozinho.
Figura 1 . Visão geral do fluxo de trabalho protocolo. Resumo esquemático das principais etapas envolvidas no isolamento e cultivo de miracidia derivado de camundongos infectados com a sangue fascíola, S. mansoni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Processamento de fígados infectados. (A) fígado de rato fortemente infectado com ovos de S. mansoni . Observe o tamanho ampliado, cor anormal e a presença de granulomas no fígado infectado (à direita) comparado com um fígado não infectado normal (à esquerda). (B) lavado mouse fígados após transferência para copo liquidificador estéril de aço inoxidável. Fígados foram então misturados por um minuto usando folha estéril e placa de Petri para cobrir o copo, evitando derramamentos (C). Após a mistura, o fígado homogeneizado, contendo ovos, foi lavado várias vezes em solução salina e resuspended em água estéril, antes de ser transferido para um balão aferido de 1 L coberto com papel alumínio (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Colheita S. mansoni miracidia. Nadando ativamente miracidia concentrado pela atração de luz na parte superior do balão volumétrico (A). Em intervalos de 10 min, parasitas são colhidas com uma pipeta e colocadas a 4 ° C para imobilizar as larvas. Miracidia em seguida são lavados na CBSS + por centrifugação e coletados em um único tubo (B) apenas antes da distribuição para poços de uma placa de cultura. CBSS +; Chernin balanceamento de solução salina (Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Transformação de Miracidial a sporocysts primárias e sua manutenção em vitro . S. mansoni miracidia e sporocysts colocados em cultura em vitro para momentos diferentes pós-colheita. Miracidia recém colhido dentro de 1h de cultura na CBSS + (A). Após 6 h de cultura, miracidia começaram a lançar suas placas epidérmicas ciliadas (setas) como elas se transformam para sporocysts primárias (B). Após 24h em CBSS + maior parte o miracidia transformaram-se completamente ao sporocysts primários (C). Sporocysts foram transformados em CBSS + para 24h, então transferidos e mantidos em cBge médio por 3 dias (D). Sporocysts geralmente aparecem mais robustos e têm taxas mais altas de sobrevivência no pós-cultivo de 4 dias na presença de cBge, comparado a CBSS + sozinho. CBSS +, Chernin equilibrada solução salina; cBge médio, completa b. glabrata embrionárias celular médio (ver Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espaço BSL2, é altamente recomendada. Além disso, lavar todas as soluções usadas no processamento de fígados e isolamento de larvas devem ser tratadas com desinfetante (por exemplo, 1% de alvejante) antes do descarte.
Deve notar-se que infectados de remoção cirúrgica de fígados de ratos e seu posterior processamento antes da mistura/homogeneização são executadas em uma câmara de segurança biológica (CSB) sob condições assépticas. No entanto, por razões práticas (facilidade de manipular amostras em massa) todos os outros procedimentos são feitos em uma bancada desinfetada utilizando recipientes esterilizados (por exemplo, copos de liquidificador, frascos, garrafas e tubos, pipetas de transferência, etc) e soluções estéreis contendo antibióticos (água salina, lagoa, CBSS). Antibióticos são adicionados a todas as soluções como uma precaução adicional contra contaminação microbiana introduzida. Além disso, durante o isolamento miracidial e colheita passos (protocolo seções 2 e 3), uma pequeno prato de Petri tampa é colocada sobre o balão para minimizar a contaminação externa durante a remoção inicial dos restos de espuma/fígado e subsequente transferência de entrada miracidia concentrada do recipiente para tubos de centrifuga.
Normalmente, Nós colhemos miracidia de 20 fígados de rato infectado em um único lote, do qual estimamos larvas rendimentos de cerca de 5000 larvas por fígado. No entanto, rendimentos podem variar consideravelmente dependendo da intensidade da infecção de ratos individuais, resultando em variação de lotes em recuperações de miracidial. Isolamentos podem ser realizados usando menos fígados de partida, embora o método descrevemos é geralmente aplicáveis para 10-20 fígados. Quando 20 fígados são processados, seguindo o final ressuspensão das pelotas fígadas em água estéril (seção de protocolo 2, passo 2.7), as suspensões devem ser distribuídas igualmente em dois frascos de 1000 mL (2 garrafas/balão). Se 10 fígados ou menos são usados, o original homogenates fígado (protocolo seção 2, passo 2.3) podem ser distribuídos para 2 garrafas e lavado suspensões então transferidas para um balão volumétrico de único para processamento adicional. Uma ou 2 fígados também podem ser processados, mas quantidades (volumes) de extração, lavagem e soluções de incubação devem ser reduzidas proporcionalmente, com final lavado sedimento na água da lagoa sendo transferido para um balão de graduado de 10 mL para folha-cobertas para concentrar-se miracidia.
A fim de maximizar os rendimentos de miracidial com um mínimo de contaminação de detritos de fígado, também é importante realizar lavagens de água da lagoa (protocolo seção 2, passos 2,7-2,9) mais rapidamente e eficientemente quanto possível. Uma vez que os ovos são expostos à água da lagoa, miracidial eclosão ocorre logo depois, embora o tempo antes de aparência larval na fonte de luz no pescoço balão pode variar de 5 a 20 min após a eclosão do início. Para limitar a perda de parasitas durante a limpeza de água de lagoa passos é fundamental verificar visualmente cada água da lagoa lavagem miracidia chegando cedo na camada superior de água do pescoço do frasco. Além disso, uma vez que miracidia são transferidas para tubos de colheita de 15 mL e são colocados no gelo, eles irão cessar a actividade de natação e resolver para o fundo do tubo. No entanto, após a centrifugação de larvas (seção 3, passos 3.4-3.5) de Pelotas, miracidia novamente vai começar a nadar se a água for permitida para aquecer. Portanto, é importante remover a água da lagoa rapidamente, mas sem perturbar o sedimento ou pipetagem até natação parasitas.
Como mencionado anteriormente, rendimentos de miracidia isolado podem variar dependendo do número de pares de verme adulto presentes em ratos individuais (intensidade de infecção) e consistência dos protocolos de infecção inicial. Miracidia são fortemente phototropic e a maioria (80-90%) se concentrará na fonte de luz ao longo do primeiro período de colheita. Os restantes 10-20% de miracidia continuará a chocar e mais lentamente se acumulam durante o segundo período de colheita. Mais (> 95%) miracidia introduziu na cultura e mantida a 26 oC CBSS + médio será ter transformado a principais sporocysts dentro de 24-48 h de cultivo. Neste momento, a viabilidade larval é tipicamente > 90%. Depois de 4 dias em CBSS + viabilidade sozinha cai consideravelmente (70-80%). No entanto, o meio de cultura de CBSS + para completar Bge seguinte de média 24h de comutação cultivo inicial de CBSS resulta em maiores taxas de sobrevivência e crescimento mais robusto. Nós mantemos rotineiramente culturas sporocyst a curto prazo em condições normoxic. No entanto, sporocysts são bastante sensíveis aos níveis de oxigênio e especialmente de espécies reativas de oxigênio que podem infligir dano oxidativo deletérios7. Bayne CJ4 e outros relataram que a saúde geral e a viabilidade do sporocysts em vitro são significativamente melhoradas quando as culturas são mantidas em condições de hipóxicos. Níveis de oxigênio baixou podem ser obtidos por gaseamento (com nitrogênio) frascos closeable individuais, ou por nitrogênio-enriquecimento da fase de gás da incubadora4.
Como citados acima, métodos para isolar axénica e cultivo da esquistossomíase miracidia e sporocysts têm sido descritos anteriormente. Foi reconhecida desde o início que miracidial fototropismo poderia ser usado para atrair e concentrar-se larvas de natação e aquele miracidia isolado poderia ser rapidamente imobilizado em hiper-osmóticos de soluções salinas (entre 120-160 mOs/Kg)8. Além disso, observou-se que manutenção em soluções salinas resultou na transformação da miracidia sporocysts primárias, a primeira fase larval intramolluscan9,12. Meios complexos também foram formulados para oferecer suporte a longo prazo em vitro crescimento e desenvolvimento do S. mansoni sporocyst estágios9,13,14,15, bem como células derivado do host do gênero Biomphalaria glabrata16. Estas formulações incorporaram vários meios de comunicação comerciais e podem ter sido completadas com sais, aminoácidos, lipídios, agentes redutores e açúcares. Formulações de mídia completa também incluem inactivadas pelo calor fetal bovino ou soro de cavalo em diferentes concentrações. Encontramos que esse adequado calor-inactivação (HI) foi crucial para a sobrevivência sporocyst e desenvolvimento a longo prazo em vitro. Achamos que incubação do soro (frascos descongelados, 100 mL) em banho-maria oC 60 por 60 min, com suave mistura a cada 10 minutos para aquecimento uniforme foi mais eficazes. Além disso, geralmente testamos vários lotes do soro de um fornecedor em potencial para compatibilidade de cultura larval. Finalmente, o estabelecimento da linha celular primeiro (e atualmente única) autêntica de cozidos, b. glabrata embrionário (Bge) linhagem celular por Hansen16 foi um grande avanço que significativamente facilitado avanços em larval esquistossomíase esforços de cultivo. Isolado miracidia do S. mansoni , quando colocado em co-cultura com células Bge, desenvolvidas a partir de primário para o secundário e filha sporocysts17e, eventualmente, para a fase final cercarial18,19. Assim, o cultivo contínuo em vitro da fase do ciclo de vida do S. mansoni caracol inteiro foi conseguido. O meio celular Bge usado em nosso sistema de cultura suporta tanto sporocyst crescimento/desenvolvimento e manutenção da linha de celular Bge.
Em resumo, temos descrito e ilustrado visualmente um protocolo detalhado para o isolamento de massa axénica e cultivo da fase miracidial livres de S. mansoni. Estes miracidia, quando sujeitos a condições de cultura apropriado, são capazes de desenvolver a gerações sucessivas sporocyst primário e secundário e, eventualmente, cercárias. Com o desenvolvimento e aperfeiçoamento contínuo das ferramentas disponíveis atualmente para manipular genes e gene expressão em vitro através de transgénicos, interferência do RNA e genoma de edição (por exemplo, CRISPR/Cas9) abordagens, prevê-se que eficiente métodos para isolamento e cultivo de miracidia de diversas espécies de tremátodos20 continuará a ser necessário a fim de adquirir materiais para ainda mais o avanço da investigação neste domínio. Este método complementa muito bem um protocolo descrito anteriormente para isolar e cultivar livres cercárias de S. mansoni para facilitar em vitro transformação para o estágio de mamíferos schistosomula21, para eventual cultivo a ovígeras adulto vermes22.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Financiado em parte pela concessão de NIH RO1AI015503. Ratos infectados esquistossomíase foram fornecidos pela esquistossomose NIAID Resource Center, no Instituto de pesquisas biomédicas (Rockville, MD) através de HHSN272201000005I de contrato NIAID-NIH para distribuição por meio de recursos do BEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
