Summary

Массовые изоляции и культивирования In Vitro Intramolluscan стадий человеческой крови Fluke Schistosoma Mansoni

Published: January 14, 2018
doi:

Summary

Эта статья описывает протокол для крупных стерильных изоляции и коллекции свободноплавающих miracidia человеческой крови fluke Schistosoma mansoni и их последующей обработки для введения в культуру в пробирке .

Abstract

Человеческой крови сосальщики, Шистосомы spp., имеют сложный жизненный цикл, который включает бесполыми и сексуальной фаз развития внутри улитки промежуточные и млекопитающих окончательного хозяина, соответственно. Способность изолировать и поддерживать различные жизненного цикла этапов в vitro условиях культура в значительной степени способствовало расследований сотовой, биохимических и молекулярных механизмов, регулирующих паразита роста, развития и принимающих взаимодействий. Передача о шистосомоза требует бесполое размножение и развитие нескольких личиночных стадий в узле Улитка; от инфекционных miracidium, через первичных и вторичных sporocysts, в cercarial стадии, инфекционный для людей. В этой статье мы представляем пошаговые протокол для массового штриховки и изоляции Schistosoma mansoni miracidia из яйца, полученные от печень инфицированных мышей, и их последующее введение в культуру в пробирке . Предполагается, что подробный протокол будет поощрять новых исследователей заниматься и расширения этой важной области schistosome исследований.

Introduction

Человека кровь сосальщики Schistosoma spp., уже возбудителей о шистосомоза, забытых тропических болезней, от которых страдает примерно 230 миллионов человек во всем мире1. Наиболее распространенных видов, Schistosoma mansoni, географически распределены в Южной Америке, Карибском архипелаге, Ближнем Востоке и к югу от Сахары Африке2. Жизненный цикл S. mansoniи другие шистосомоз, сложные, включающие млекопитающих принимающей окончательные и пресноводных улиток род Biomphalaria , которые служат в качестве облигатного промежуточных хозяев.

S. mansoni мужского и женского взрослого червя пар, живущих в задней брыжеечных вен воспроизводить млекопитающих хост, что привело к освобождению эмбриональные яйца (равнина), которые становятся подал в небольшой венул слизистой оболочки кишечника. Яйца, а затем перерывы через стенки сосудов, мигрируют через слизистых тканей и в конечном итоге введите просвета кишечника, где они будут аннулированы с калом. Когда яйцеклетки введите штрих пресной воды и свободноплавающих личинки (miracidia), они должны в короткие сроки, найти подходящую Biomphalaria улитки, чтобы заразить для того чтобы продолжать его жизненного цикла. Этот процесс инфекции включает miracidial привязанность к улитки космическое тело поверхности следуют активного проникновения и вход личинка в хозяина. Вскоре после вступления miracidium начинает проливать его внешней мерцательного эпидермального пластины, как он образует синцития, которая станет новой внешней поверхности (оболочки) следующий личиночной стадии первичной или мать Спороциста. Бесполое размножение каждой первичной Спороциста производит и выпускает второго поколения sporocysts, называют вторичные или дочь sporocysts, которые в свою очередь, создания и выпуска большого числа intramolluscan стадии, видовой3 . После побега из узла Улитка свободноплавающих cercariae способны подключения и непосредственно проникая кожи человека или другие подходящие млекопитающих хоста. После вступления в их новый хост cercariae преобразование на паразитарные schistosomula сцену и вторгнуться в сердечно-сосудистой системы. Они, в свою очередь, мигрируют в легких, а затем печеночной вены, где они Зрелые для взрослых червей, образуют мужских и женских пар и поехать брыжеечных вен для завершения их жизненного цикла.

Успех intramolluscan или «улитка этап» развитие личинок шистосомоз имеет важное значение для продолжения цикла человека хост узел передачи. Критически важное значение имеет период следующую запись свободноплавающих miracidium в узле улитки и превращение его ранних до стадии первичной Спороциста. В зависимости от физиологического и иммунологическая совместимость между хозяином и паразитом именно во время этой фазы развития личинок что первоначальный успех или неудача для установления инфекции определяется4,5,6 . Последующее развитие первичных sporocysts бесполым производить вторичные sporocysts, которые затем генерировать человека инфекционный cercariae, далее требуют разрешительной физиологических хост-среды, которая обеспечивает для всех паразита роста и репродуктивных потребностей.

На сегодняшний день мало что известно о лежащих в основе физиологических, биохимических и молекулярных процессов управления schistosome Улитка взаимодействия, особенно на молекулы и тропинки участвует в регулировании развития личинок и воспроизводства, или модулирующая хоста иммунных реакций. Свободный доступ к большое количество этих личиночной стадии в vitro условиях культуры, которые позволяют экспериментальных манипуляций значительно облегчит обнаружение пути развития и основных механизмов роста клеток, дифференциация и размножение. Критические паразита пути или механизмов, выявленных с помощью экспериментов в пробирке , может затем использоваться для нарушить личиночной роста/воспроизведение в узле Улитка, или для идентификации Улитка хост иммунные механизмы признания и ликвидации miracidial или Спороциста этапов.

В этой статье и видео презентации, мы предоставляем подробное описание метода для изоляции большого числа свободноплавающих S. mansoni miracidia для введения в культуру в пробирке , который затем может быть подвергнут последующих экспериментальных манипуляция (см. рис. 1 на Схематический обзор протокола рабочего процесса). Хотя аналогичные процедуры были описаны ранее7,8,9, мы чувствовали, что подробный протокол будет полезным для исследователей, которые хотят использовать эту модель для решения до сих пор без ответа вопросы, связанные с intramolluscan развития личинок, пролиферации и schistosome Улитка иммунных взаимодействий. Кроме того этот подход может быть легко адаптирована для изоляции яиц от других медицински важных трематоды мочевого пузыря жилья S. haematobium, печень сосальщиков или легких сосальщики.

Protocol

Все Уход за животными и экспериментальной процедуры были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитетом из университета Висконсин-Мэдисон протоколом не. V005717. Следующий протокол включает в себя работу в объекте 2-го уровня биобезопасности (BSL2) для патогенов ч…

Representative Results

Подавляющее большинство miracidia обычно будет были собраны в первых двух «урожай». Инкубация изолированных miracidia в СГБМ + инициирует процесс трансформации miracidium Спороциста (Рисунок 4A- C). В течение первого часа следующие передачи культуры скважин,…

Discussion

Miracidia S. mansoni, изолированные и манипулировать, как описано в настоящем документе, может заразить только Улитка промежуточного узла и поэтому не представляют человека биологической во время этой фазы развития личинок. Однако чтобы избежать случайного воздействия/инфекции улиток, ух…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Частично финансируется гранта NIH RO1AI015503. Schistosome инфицированных мышей были предоставлены NIAID шистосомоз ресурсный центр биомедицинских научно-исследовательском институте (Роквилл, MD) через низ-NIAID контракт HHSN272201000005I для распространения через BEI ресурсов.

Materials

Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

References

  1. Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
  2. WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
  3. Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
  4. Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
  5. Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
  6. Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
  7. Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
  8. McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
  9. Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
  10. Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
  11. Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
  12. Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
  13. Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
  14. Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
  15. DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
  16. Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
  17. Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
  18. Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
  19. Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
  20. Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
  21. Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
  22. Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).

Play Video

Cite This Article
Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

View Video