Summary
Эта статья описывает протокол для крупных стерильных изоляции и коллекции свободноплавающих miracidia человеческой крови fluke Schistosoma mansoni и их последующей обработки для введения в культуру в пробирке .
Abstract
Человеческой крови сосальщики, Шистосомы spp., имеют сложный жизненный цикл, который включает бесполыми и сексуальной фаз развития внутри улитки промежуточные и млекопитающих окончательного хозяина, соответственно. Способность изолировать и поддерживать различные жизненного цикла этапов в vitro условиях культура в значительной степени способствовало расследований сотовой, биохимических и молекулярных механизмов, регулирующих паразита роста, развития и принимающих взаимодействий. Передача о шистосомоза требует бесполое размножение и развитие нескольких личиночных стадий в узле Улитка; от инфекционных miracidium, через первичных и вторичных sporocysts, в cercarial стадии, инфекционный для людей. В этой статье мы представляем пошаговые протокол для массового штриховки и изоляции Schistosoma mansoni miracidia из яйца, полученные от печень инфицированных мышей, и их последующее введение в культуру в пробирке . Предполагается, что подробный протокол будет поощрять новых исследователей заниматься и расширения этой важной области schistosome исследований.
Introduction
Человека кровь сосальщики Schistosoma spp., уже возбудителей о шистосомоза, забытых тропических болезней, от которых страдает примерно 230 миллионов человек во всем мире1. Наиболее распространенных видов, Schistosoma mansoni, географически распределены в Южной Америке, Карибском архипелаге, Ближнем Востоке и к югу от Сахары Африке2. Жизненный цикл S. mansoniи другие шистосомоз, сложные, включающие млекопитающих принимающей окончательные и пресноводных улиток род Biomphalaria , которые служат в качестве облигатного промежуточных хозяев.
S. mansoni мужского и женского взрослого червя пар, живущих в задней брыжеечных вен воспроизводить млекопитающих хост, что привело к освобождению эмбриональные яйца (равнина), которые становятся подал в небольшой венул слизистой оболочки кишечника. Яйца, а затем перерывы через стенки сосудов, мигрируют через слизистых тканей и в конечном итоге введите просвета кишечника, где они будут аннулированы с калом. Когда яйцеклетки введите штрих пресной воды и свободноплавающих личинки (miracidia), они должны в короткие сроки, найти подходящую Biomphalaria улитки, чтобы заразить для того чтобы продолжать его жизненного цикла. Этот процесс инфекции включает miracidial привязанность к улитки космическое тело поверхности следуют активного проникновения и вход личинка в хозяина. Вскоре после вступления miracidium начинает проливать его внешней мерцательного эпидермального пластины, как он образует синцития, которая станет новой внешней поверхности (оболочки) следующий личиночной стадии первичной или мать Спороциста. Бесполое размножение каждой первичной Спороциста производит и выпускает второго поколения sporocysts, называют вторичные или дочь sporocysts, которые в свою очередь, создания и выпуска большого числа intramolluscan стадии, видовой3 . После побега из узла Улитка свободноплавающих cercariae способны подключения и непосредственно проникая кожи человека или другие подходящие млекопитающих хоста. После вступления в их новый хост cercariae преобразование на паразитарные schistosomula сцену и вторгнуться в сердечно-сосудистой системы. Они, в свою очередь, мигрируют в легких, а затем печеночной вены, где они Зрелые для взрослых червей, образуют мужских и женских пар и поехать брыжеечных вен для завершения их жизненного цикла.
Успех intramolluscan или «улитка этап» развитие личинок шистосомоз имеет важное значение для продолжения цикла человека хост узел передачи. Критически важное значение имеет период следующую запись свободноплавающих miracidium в узле улитки и превращение его ранних до стадии первичной Спороциста. В зависимости от физиологического и иммунологическая совместимость между хозяином и паразитом именно во время этой фазы развития личинок что первоначальный успех или неудача для установления инфекции определяется4,5,6 . Последующее развитие первичных sporocysts бесполым производить вторичные sporocysts, которые затем генерировать человека инфекционный cercariae, далее требуют разрешительной физиологических хост-среды, которая обеспечивает для всех паразита роста и репродуктивных потребностей.
На сегодняшний день мало что известно о лежащих в основе физиологических, биохимических и молекулярных процессов управления schistosome Улитка взаимодействия, особенно на молекулы и тропинки участвует в регулировании развития личинок и воспроизводства, или модулирующая хоста иммунных реакций. Свободный доступ к большое количество этих личиночной стадии в vitro условиях культуры, которые позволяют экспериментальных манипуляций значительно облегчит обнаружение пути развития и основных механизмов роста клеток, дифференциация и размножение. Критические паразита пути или механизмов, выявленных с помощью экспериментов в пробирке , может затем использоваться для нарушить личиночной роста/воспроизведение в узле Улитка, или для идентификации Улитка хост иммунные механизмы признания и ликвидации miracidial или Спороциста этапов.
В этой статье и видео презентации, мы предоставляем подробное описание метода для изоляции большого числа свободноплавающих S. mansoni miracidia для введения в культуру в пробирке , который затем может быть подвергнут последующих экспериментальных манипуляция (см. рис. 1 на Схематический обзор протокола рабочего процесса). Хотя аналогичные процедуры были описаны ранее7,8,9, мы чувствовали, что подробный протокол будет полезным для исследователей, которые хотят использовать эту модель для решения до сих пор без ответа вопросы, связанные с intramolluscan развития личинок, пролиферации и schistosome Улитка иммунных взаимодействий. Кроме того этот подход может быть легко адаптирована для изоляции яиц от других медицински важных трематоды мочевого пузыря жилья S. haematobium, печень сосальщиков или легких сосальщики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все Уход за животными и экспериментальной процедуры были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитетом из университета Висконсин-Мэдисон протоколом не. V005717. Следующий протокол включает в себя работу в объекте 2-го уровня биобезопасности (BSL2) для патогенов человека, хотя ни один из этапов schistosome, изображенные в этом протоколе инфекционный людей или других млекопитающих. Следуйте институциональную политику для обработки 2 группы риска (RG2) патогенов человека.
Примечание: Мы используем самок мышей Swiss-Уэбстер (6 - старый неделю) из-за их более высокой подверженности инфекции10, тем самым давая больше яйцо бремя. Tucker et al. описывают мыши и улитка инфекции протоколы, используемые в этой модели системы11. Таблица материалов перечислены все конкретного оборудования, материалов, реагентов и животных источников, необходимых для выполнения этот экспериментальный протокол.
1. Обработка зараженных печень
- Усыпить мышей, 6-7 недель после заражения, CO2 удушение (норма 10-30% от объема камеры в минуту). Монитор мыши для прекращения дыхания и пульса.
Примечание: Как правило, до 20 мыши могут быть обработаны в определенное время. - После передачи Усыпленных мышей биобезопасности кабинета, поместите мышь на их спинах и брызги их вентральной поверхности с 70% этиловом спирте. Дайте впитаться в течение 1 мин.
- Пинч и подтянуть кожу нижней части живота и сократить через базу ущипнул кожи ближе к живота с стерильные хирургические ножницы. Потяните вырезать кожу кпереди (т.е. к голове) выявить печени. Обратите внимание, что печень следует расширить и рябой благодаря яйцо индуцированные гранулематозный ответа (рисунок 2A).
- Удаление печени и поместите его в стакан, содержащие 200 мл стерильного 1,2% NaCl решение содержащий перо/стрептококк.
- Повторите шаги 1.3 и 1.4 с остальных мышей.
Примечание: Двадцать мыши обычно обрабатываются в одном урожая. - Место печень в стерильных Петри и удаление жира/соединительной ткани-печень стерильным пинцетом.
- Передать подстриженные чистить печень стерильные центрифуги 250 мл флакон, содержащий ~ 200 мл стерильного раствора NaCl 1,2% с пером/воспаление.
- Энергично встряхните флакон, содержащий печень и, используя Стерильные одноразовые пипетки, удалите избыток поверхности пены/плавучий мусор. Медленно слить оставшееся физиологический раствор в контейнер или приемник содержащий Блич 1% (дезинфекции).
- Добавить ~ 200 мл свежего физраствора в печень и повторите шаг 1.8 еще три раза.
2. печени добычи и miracidial изоляции
- Место печень в чашку маленький стерильный блендер из нержавеющей стали и добавить ~ 2 мл раствора NaCl 1,2% (рис. 2B).
- Обложка Кубок с фольгой и Петри для предотвращения разливов и смешать 1 мин, чередуя низкой и высокой скорости (низкая скорость/10 s высокая скорость 20 s; повтор) (рис. 2 c).
- Равномерно распределять смесовые печени подвеска в стерильных центрифуги 250 мл бутылки (для 20 печень использовать 4 бутылки).
- Добавьте стерильного физиологического раствора с помощью антибиотиков в ~ 200 мл общий объем/бутылка. Вес/баланс бутылки перед центрифугированием.
- Центрифуги, смесовые печень на 290 x g 15 мин на 4 oC. осторожно слить supernatants в контейнер с хлоркой до отмены.
- Повторите шаги 2,4-2,5 раз. Не забудьте тщательно Ресуспензируйте печени отложений до центрифугирования.
- После отмены последнего солевых мыть (шаг 2.6), добавить 200 мл стерильной воды с пером/воспаление гранулированных ткани печени, трясти Ресуспензируйте отложений, и передавать подвеска стерилизованные 1-L объемные настой, который был полностью покрыт с алюминием фольга, за исключением верхней 3 см шеи (Рисунок 2D).
Примечание: Используйте две бутылки (= 10 печень) за флакон 1 Л. Прудовой воды имитирует естественный пресноводной среде необходимо для стимулирования miracidial штриховки из яиц. - С помощью стерильных пруд водой, заполните вверх Фляга для приблизительно 3 см выше Фольга покрытия на шее. Затем, без промедления (как miracidia вскоре начинают люка), удалить остаточные пены и ткани печени, плавающей на поверхности, быстро закупорить вверх ~ 12 мл воды пруда, содержащие мусора и отбрасывая его в отдельном отбросить пробки. Замените свежей стерильные пруд водой.
- Повторите очистки 2.8 шаг, еще три раза, проверка на наличие miracidia в трубке отменить. Прекратить повторение Очистка шаг, если miracidia появляются в промывочный раствор.
- После последнего мыть медленно добавьте ~ 12 мл теплого стерильного пруд воды (предварительно разогретую до 30 oC) для создания градиента температуры с чистой, стерильные теплой водой на вершине.
Примечание: Лучше всего это достигается медленно выполняя воды вдоль стороны колбу шеи, чтобы избежать смешивания. - Место небольшой Петри крышка над отверстием колбу и светить яркий свет в верхней части колбы над защитное покрытие для освещения на верхней поверхности воды.
Примечание: Как правило, в течение 5-10 мин, бассейн miracidia, привлекли к свету, будет сосредоточена в большом количестве воды (рис. 3A) в течение первых 2-3 см.
3. Miracidial уборки и выращивания
- Когда miracidia накопили на поверхности после 10 мин, с использованием стерильных передачи пипетки, удалите ~ 8 мл воды и перевода в стерильных пластиковых 15 мл пробирок. Место труб, содержащих miracidia на льду.
- Добавьте обратно 8 мл теплого стерильного пруд воды вдоль внутри объемной колбу и ждать еще 10 мин.
- Используя новые трубы каждый раз, повторите шаги 3.1 и 3.2 еще три раза. После 4й коллекции сохраните окончательный трубки на льду за 10 минут позволить miracidia урегулировать. Этот набор трубок состоит из первого урожая.
- Пробирок, содержащие miracidia на 290 x g 1 мин на 4 oC в предварительно охлажденным охлажденных центрифуги.
- Немедленно удалите большую часть супернатант (~ 7 мл), стараясь не нарушить паразита Пелле (рис. 3B).
- Бассейн все miracidia от этого первого урожая в одну трубку, затем промойте все оригинальные труб с ~ 1 мл стерильной воды и добавить в «пуле» трубки.
- Разрешить паразитов поселиться на льду за ~ 5 мин и снова центрифуга паразитов на 290 x г за 1 мин на 4 oC.
- Тщательно удалить супернатант и добавить 6-8 мл стерильного Чернин сбалансированного солевого раствора (CBSS +; см. таблицу материалы) содержащий перо/воспаление.
- Осторожно приостановите miracidia и Алиготе, их в 24-ну культуры плиту (1 мл на колодец), следуют промывка труб в 6-8 мл CBSS + и добавление 1 мл промывки в каждой скважине. Инкубируйте паразитов в 26 oC в нормоксические условиях. Концентрации изолированных miracidia будут отличаться, но обычно будет в среднем ~ 7000/мл.
- Если паразитов по-прежнему сосредоточены на источнике света, повторите шаги 3.1 3.9 для продолжения уборки miracidia конце штриховкой, но увеличить интервал времени между коллекции до 15-20 мин.
Примечание: Этот новый набор трубок представляет второй урожай. Однако потому что miracidial чисел обычно являются низкими, личинок из всех труб обычно объединяются в одной культуры, также содержащий 2 мл CBSS +. - На 24 ч после сбора урожая и культивирования нежно ресуспензируйте sporocysts в их скважин, закупорить.
- Подождите несколько минут, чтобы позволить паразитов поселиться в нижней части скважины. После того как они поселились, тщательно удалите супернатант (~1.5 мл), который будет содержать большую часть мерцательного эпидермального пластин пролить miracidia во время личинок преобразования. Это «превращение» супернатанта может отказаться или включены в последующие исследования личиночной секреторных продуктов.
- Добавьте 1,5 мл свежего CBSS + каждый хорошо и аккуратно пипеткой Ресуспензируйте sporocysts. Повторите шаг 3.12 Если далее мытья или меняется на другой носитель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подавляющее большинство miracidia обычно будет были собраны в первых двух «урожай». Инкубация изолированных miracidia в СГБМ + инициирует процесс трансформации miracidium Спороциста (Рисунок 4A- C). В течение первого часа следующие передачи культуры скважин, содержащие CBSS +, большинство miracidia прекратить плавания (рис. 4A). В 6 ч в культуре miracidia занимаются активно пролить их мерцательного эпидермального пластины (рис. 4В). Совпадающих с этим пролить процессом, Личинки формируют их внешнее покрытие-синцитиальный tegumental как они превращаются в основной sporocysts. Большинство паразитов завершит личиночной трансформации, став полностью сформированный sporocysts, 24-48 ч после культивирования в СГБМ + (рис. 4 c). После 4 дней культуры в СГБМ + самостоятельно можно ожидать Спороциста выживания сократится до ~ 80%. Однако sporocysts культивировали на 1 день в СГБМ + и затем переданы полного среднего Булак ДжиИПи Инжиниринг (cBge), за 3 дня обычно приводят к лучшей выживаемости и личинки с более надежный внешний вид (рис. 4 d). Спороциста жизнеспособность в целом остается стабильной между 4 и 7 дней в cBge с продолжающееся увеличение роста в это время в культуре, по сравнению с CBSS + только.
Рисунок 1 . Обзор протокола процесса. Схематическое изложение основных этапов в изоляции и выращивания miracidia, полученных от мышей, инфицированных с человеческой крови fluke, S. mansoni. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Обработка зараженных печень. (A) Мышь печени сильно заражены S. mansoni яйца. Обратите внимание, увеличенный размер, Аномальные цвет и присутствие гранулемы в зараженных печени (справа) по сравнению с нормальной неинфицированных печени (слева). (B) мыть мышь печень после передачи Кубка стерильные блендер из нержавеющей стали. Печень были затем смешивается на одну минуту с использованием стерильных фольги и Петри для покрытия Кубок, таким образом избегая разливов (C). После смешивания, печени огневки, содержащие яйца, промывают несколько раз в солевой раствор и высокомобильна в стерильной воды, прежде чем передаются объемные колбу 1-L покрыта алюминиевой фольгой (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Заготовка S. mansoni miracidia. Активно плавание miracidia, в основном путем привлечения к свету в верхней части объемные колбу (A). Интервалом 10-мин паразитов собирают пипетки и помещается на 4 ° C для иммобилизации личинки. Miracidia затем промывают в СГБМ + центрифугированием и собраны в одной трубе (B) непосредственно перед распределением скважин плиты культуры. CBSS +; Чернин сбалансированного солевого раствора (Таблица материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Miracidial преобразование к основным sporocysts и их обслуживания в пробирке . S. mansoni miracidia и sporocysts, помещены в культуру в пробирке для разных времен после сбора урожая. Недавно собранный miracidia в течение 1 ч культуры в СГБМ + (A). После 6 h культуры miracidia начали пролить их мерцательного эпидермального пластины (стрелки), как они превращаются в основной sporocysts (B). После 24 ч в СГБМ + большая часть miracidia полностью изменили для первичной sporocysts (C). Sporocysts были превращены в СГБМ + за 24 ч, а затем переданы и поддерживается в среде cBge на 3 дня (D). Sporocysts обычно появляются более надежные и имеют более высокие показатели выживания на 4 дня после культивирования в присутствии cBge, по сравнению с CBSS + самостоятельно. CBSS +, Чернин сбалансированного солевого раствора; cBge средний, полный B. glabrata эмбриональных клеток средних (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia S. mansoni, изолированные и манипулировать, как описано в настоящем документе, может заразить только Улитка промежуточного узла и поэтому не представляют человека биологической во время этой фазы развития личинок. Однако чтобы избежать случайного воздействия/инфекции улиток, уход следует выполнять miracidial изоляции в месте, отличном от районов, где восприимчивых видов Biomphalaria Улитка может быть настоящей или сохранить. Отдельную комнату, зарегистрирована как BSL2 пространства, настоятельно рекомендуется. Кроме того, все мыть, что решения, используемые в обработке печень и личинок изоляции следует относиться с дезинфицирующим средством (например, 1% отбеливатель) перед удалением.
Следует отметить, что хирургическое удаление печень от инфицированных мышей и их последующей обработки до смешивания/гомогенизации выполняются в биологической безопасности кабинета (BSC) в асептических условиях. Однако по практическим соображениям (легкости манипулирования массовых проб) все другие процедуры выполняются на вылеченные benchtop использования стерильных контейнеров (например, блендер чашки, фляги, бутылки и трубки, пипец передачи, и т.д.) и стерильных растворов содержащие антибиотики (физиологический, пруд вода, СГБМ). Антибиотики добавляются все решения как дополнительной меры предосторожности против введено микробной контаминации. Кроме того во время miracidial изоляции и уборки шаги (протокол разделы 2 и 3), небольшой Петри крышка размещается над колбу, открытие для сведения к минимуму внешнего загрязнения во время первоначального удаления пены/печени мусора и последующей передачей концентрированные miracidia от Фляга для центрифуг трубы.
Как правило мы урожай miracidia из 20 зараженные мыши печень в один пакет, из которого мы оцениваем личиночной урожайность около 5000 личинок в печени. Однако урожайность может значительно изменяться в зависимости от интенсивности инфекции отдельных мышей, что приводит к партии партии различия в miracidial восстановление. Изоляции может осуществляться с помощью меньше начальной печень, хотя метод мы описали как правило применяется для 10-20 печень. При обработке 20 печень, после окончательного ресуспендирования печени окатышей в стерильной воды (раздел 2, шаг 2.7 протокол), подвески должны поровну распределены в два 1000 мл флаконы (2 бутылки/колба). Если используются 10 печень или меньше, оригинальные гомогенатах печени (протокол раздел 2, шаг 2.3) могут быть распределены на 2 бутылки и промывают суспензий, затем передан один объемный Фляга для дальнейшей обработки. Один или 2 печень также могут быть обработаны, но количествах (томов) добычи, мыть и инкубационные решения следует сократить пропорционально, финал, промывают отложений в пруд воды передаются в 10-мл фольги, покрытой объемные колбу сконцентрироваться miracidia.
Чтобы максимизировать урожайность miracidial с минимальным печени мусора загрязнения, также важно для выполнения пруд вода моет (протокол раздел 2, шаги 2.7-2.9), как быстро и эффективно как можно скорее. После того, как яйца подвергаются воздействию воды, miracidial отрождение происходит вскоре после этого, хотя время, прежде чем личиночной появление на источник света в колбу шеи может варьироваться от 5-20 мин после вылупления начинается. Чтобы ограничить потери паразитов во время очистки воды пруда шаги, важно, чтобы визуально проверить каждого водоема мыть для раннего прибытия miracidia в слое верхней воды колбу шеи. Кроме того после того как miracidia передаются 15 мл коллекции трубок и размещены на льду, они будут прекратить плавание деятельности и оседают на дно трубки. Однако после центрифугирования Пелле личинки (раздел 3, шаги 3.4-3.5), miracidia будет снова начинают плавать, если вода теплая. Таким образом важно удалить прудовой воды быстро, но без нарушая гранулы или закупорить вверх плавание паразитов.
Как упоминалось ранее, урожайность изолированных miracidia может варьироваться в зависимости от числа взрослого червя пар в отдельных мышей (интенсивность инфекции) и последовательность протоколов первичной инфекции. Miracidia сильно phototropic и большинство (80-90%) будет сосредоточена на источник света за первый период сбора урожая. Оставшиеся 10-20% miracidia будет продолжать люк и более медленно накапливаются в течение второго периода сбора урожая. Наиболее (> 95%) miracidia введена в культуру и поддерживается на 26 oC в СГБМ + среде будет превратили в первичных sporocysts в течение 24-48 ч культивирования. В это время, обычно является личиночной жизнеспособность > 90%. После 4 дней в СГБМ + только жизнеспособность значительно падает (70-80%). Однако переключение питательной среды от СГБМ + для завершения Bge средних 24 h ниже первоначального CBSS культивирования приводит к более высокие показатели выживания и более высокие темпы роста. Мы постоянно поддерживать краткосрочных Спороциста культур в условиях нормоксические. Однако sporocysts весьма чувствительны, уровень кислорода и особенно реактивнооксигенных видов, которые могут нанести пагубные оксидативное повреждение7. C.J. Bayne4 и другие сообщили значительно улучшилось общее состояние здоровья и жизнеспособности sporocysts в vitro когда культур поддерживаются в гипоксических условиях. Опустил кислорода может быть получена путем газом (азотом) индивидуального Колб closeable, или путем обогащения азотом газовой фазы в инкубатор4.
Как приведенные выше, методы для стерильных изоляции и культивирования schistosome miracidia и sporocysts были описаны ранее. На раннем этапе было признано, что фототропизма miracidial может использоваться для привлечения и сконцентрировать плавательный личинок и что изолированные miracidia может быть быстро иммобилизованных в гиперосмотических солевые растворы (между 120-160 МОС/кг)8. Далее было отмечено, что содержание в соляных растворов привели к трансформации miracidia для первичной sporocysts, первый intramolluscan личиночной стадии9,12. Комплекс средств массовой информации также были разработаны для поддержки долгосрочного роста в пробирке и развития S. mansoni Спороциста этапы9,13,14,15, а также клетки производные от хоста Улитка Biomphalaria glabrata16. Эти формулировки включены различные коммерческие средства массовой информации и возможно были дополнены аминокислоты, соли, липиды, восстановителей и сахаров. Полный СМИ составы также включены тепла инактивированная плода говядину или лошадь сыворотки в различных концентрациях. Мы обнаружили, что надлежащее тепло инактивация (HI) имеет решающее значение для выживания Спороциста и долгосрочного развития в пробирке. Мы нашли что инкубации сыворотки (талые, 100-мл бутылки) в 60 oC капилляре 60 мин, с нежным смешивания каждые 10 минут для равномерного Отопление было наиболее эффективным. Кроме того мы обычно проверить несколько партий сыворотки с потенциальным поставщиком для личинок культуры совместимости. Наконец создание первой (и в настоящее время только) подлинные моллюска клеточной линии, эмбриональных клеток линии (Bge) B. glabrata Хансен16 был крупный прорыв, что значительно облегчило достижения в личиночной schistosome культивирование усилия. Изолированные miracidia S. mansoni , помещенный в культуру, сопредседатель с Bge клеток разработаны от начальной до средней/дочь sporocysts17и в конечном итоге к стадии cercarial18,19. Таким образом был достигнут непрерывный в витро выращивания всего улитки фазы жизненного цикла S. mansoni . Булак ДжиИПи Инжиниринг клеток средство, используемое в нашей системе культуры поддерживает Спороциста роста/развития и поддержания Bge клеточной линии.
В целом мы описал и визуально иллюстрированный подробный протокол для массовых стерильных изоляции и выращивания на стадии свободноплавающих miracidial S. mansoni. Эти miracidia, когда они подвергаются воздействию условий соответствующей культуры, способны разработке последовательных первичных и вторичных Спороциста поколений, и в конечном итоге cercariae. С развитие и постоянное совершенствование инструментов, имеющихся в настоящее время для манипулирования генов и ген выражение в vitro через трансгенных, РНК-интерференция и геном редактирования (например, ТРИФОСФАТЫ/Cas9) подходы, предполагается, что эффективное методы для изоляции и выращивания miracidia от различных видов Трематодные20 будет по-прежнему будут необходимы для того, чтобы приобрести материалы для дальнейшего продвижения научных исследований в этой области. Этот метод хорошо дополняет ранее описанных протокол для изоляции и культивирования свободноплавающих cercariae S. mansoni для облегчения преобразования в vitro млекопитающих schistosomula этап21, для возможного Выращивание ovigerous взрослых червей22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Частично финансируется гранта NIH RO1AI015503. Schistosome инфицированных мышей были предоставлены NIAID шистосомоз ресурсный центр биомедицинских научно-исследовательском институте (Роквилл, MD) через низ-NIAID контракт HHSN272201000005I для распространения через BEI ресурсов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S.
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
