Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.
Abstract
Menselijk bloed staartvinnen, Schistosoma spp., hebben een complexe levenscyclus met ongeslachtelijke en seksuele ontwikkeling fasen binnen een slak intermediaire en zoogdieren definitieve gastheer, respectievelijk. De mogelijkheid om te isoleren en in stand houden van de fasen van de levenscyclus van de verschillende omstandigheden in vitro cultuur heeft sterk vergemakkelijkt onderzoek naar de cellulaire, biochemische en moleculaire mechanismen tot regeling van de parasiet groei, ontwikkeling en gastheer interacties. Transmissie van schistosomiasis vereist ongeslachtelijke voortplanting en ontwikkeling van meerdere larvale stadia binnen de slak host; vanuit de infectieuze miracidium, door middel van primaire en secundaire sporocysts, naar de eindfase van de cercarial is dat besmettelijk voor de mens. In deze paper presenteren we een stapsgewijze protocol voor massale broedeieren en isolatie van Schistosoma mansoni miracidia van eieren die zijn verkregen uit de lever van geïnfecteerde muizen en hun latere invoering in in vitro cultuur. Verwacht wordt dat het gedetailleerde protocol nieuwe onderzoekers deelnemen en verbreden van dit belangrijke terrein van Schistosoma onderzoek zal bevorderen.
Introduction
Het menselijk bloed staartvinnen Schistosoma spp., zijn de causatieve agenten van schistosomiasis, een verwaarloosde tropische ziekten teistert een geschatte 230 miljoen mensen wereldwijd1. De meest voorkomende soort, Schistosoma mansoni, is geografisch verdeeld in Zuid-Amerika, de Caribische archipel, het Midden-Oosten en sub-Saharisch Afrika2. De levenscyclus van S. mansonien andere schistosomes, is complex, waarbij een zoogdieren definitieve host en zoetwater slakken van het geslacht Biology die als obligate intermediaire gastheer dienen.
S. mansoni mannelijke en vrouwelijke volwassen worm paren leven in de achterste mesenterische aders van de zoogdieren host reproduceren, resulterend in de release van bebroede eieren (ova) die worden ingediend in de kleine venules van de intestinale mucosa. Eieren vervolgens breekt door de muren van het vaartuig, migreren door mucosal weefsels, en uiteindelijk Voer de intestinale lumen waar zij met de uitwerpselen zijn ongeldig. Wanneer eicellen zoetwater en vrijzwemmende larven (miracidia) broedsel invoert, moeten in korte orde, vinden ze een geschikte Biology slak te infecteren om voort te zetten van de levenscyclus. Deze infectie-proces omvat miracidial gehechtheid aan de slakkengang buiten lichaamsoppervlak gevolgd door actieve penetratie en vermelding van de larve in de gastheer. Kort na binnenkomst begint het miracidium te werpen haar ciliated epidermale Buitenlamellen zoals het vormt een syncytium die als de nieuwe buitenoppervlak (vlies) van de volgende larvale stadium, de primaire of moeder sporocyst fungeren zal. Door middel van ongeslachtelijke voortplanting, elke primaire sporocyst produceert en een tweede generatie van sporocysts, het zogenaamde secundaire of dochter sporocysts, die op zijn beurt, genereren en vrijgeven van grote aantallen van de laatste fase van de intramolluscan, de cercaria3 releases . Bij ontsnappen uit de slak host zijn vrijzwemmende cercariae geschikt voor het aansluiten en direct het penetreren van de huid van een mens of andere geschikte zoogdieren gastheer. Bij binnenkomst in hun nieuwe host, cercariae transformeren naar de parasitaire schistosomula fase en het vasculaire systeem binnen te dringen. Zij, beurtelings, migreren naar de longen en vervolgens naar de hepatische ader waar ze rijpen tot volwassen wormen, mannelijke en vrouwelijke paren vormen en reizen naar de mesenterische aderen te voltooien hun levenscyclus.
Geslaagd intramolluscan of "slak fase" ontwikkeling van larvale schistosomes is essentieel voor de voortzetting van de cyclus van menselijke host-naar-host-transmissie. Is de periode van de volgende vermelding van de vrijzwemmende miracidium in de slak host en haar vroege transformatie tot het stadium van de primaire sporocyst van cruciaal belang. Afhankelijk van de fysiologische en immunologische compatibiliteit tussen host en parasiet is het in deze fase van larvale ontwikkeling dat eerste succes of falen om infecties is vastbesloten4,5,6 . Verdere ontwikkeling van de primaire sporocysts geschikt voor het produceren aardlingen secundaire sporocysts, die vervolgens mens-infectieuze cercariae genereren, verder vereisen een tolerante fysiologische hostomgeving dat voorziet in alle van de parasiet groei en reproductieve moet.
Tot op heden, is weinig bekend over de onderliggende fysiologische, biochemische en moleculaire processen controleren Schistosoma-slak interacties, met name de moleculen en de trajecten betrokken bij larvale ontwikkeling en voortplanting reguleren of modulerende de immuunrespons van de gastheer. Eenvoudige toegang tot grote aantallen van deze larvale stadia omstandigheden in vitro cultuur waarmee experimentele manipulatie zou aanzienlijk vergemakkelijken de ontdekking van ontwikkelings trajecten en onderliggende mechanismen van celgroei, differentiatie en reproductie. Kritische parasiet trajecten of mechanismen, vastgesteld door middel van in vitro experimenten, kunnen vervolgens worden gebruikt larvale groei/reproductie in de slak host verstoren, of identificeren van slak host immuun mechanismen die betrokken zijn bij de erkenning en de eliminatie van de stadia van miracidial of sporocyst.
In dit artikel en een video presentatie, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een methode voor het isoleren van grote aantallen vrijzwemmende S. mansoni miracidia voor in vitro cultuur die vervolgens kan worden onderworpen aan follow-up experimentele binnenbrengen manipulatie (Zie Figuur 1 voor een schematisch overzicht van de werkstroom protocol). Hoewel soortgelijke procedures zijn beschreven eerder7,8,9, vonden we dat een gedetailleerd protocol nuttig voor onderzoekers die tewerkstellen van dit model aan te pakken nog steeds onbeantwoorde vragen met betrekking zijn zou willen tot intramolluscan larval ontwikkeling, cellulaire proliferatie en Schistosoma-slak immuun-interacties. Bovendien, zou kunnen deze aanpak gemakkelijk worden aangepast voor isolatie van eieren uit andere medisch belangrijke darm zoals blaas-woning S. haematobium, staartvinnen lever of Long staartvinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenverzorgers en experimentele procedures werden goedgekeurd door het dier zorginstellingen en gebruik Comité van de Universiteit van Wisconsin-Madison onder Protocol geen. V005717. Het volgende protocol betekent werken in een Biosafety Level 2 (BSL2)-faciliteit voor menselijke pathogenen, hoewel geen van de stadia van de Schistosoma afgebeeld in dit protocol besmettelijk voor mens of andere zoogdieren zijn. Volg institutioneel beleid voor de verwerking van risico groep 2 (RG2) menselijke pathogenen.
Opmerking: We gebruiken vrouwelijke Swiss-Webster muizen (6 - week oud) als gevolg van hun hogere gevoeligheid voor infectie10, waardoor grotere ei lasten oplevert. Tucker et al. beschrijven de slak en muis infectie-protocollen die worden gebruikt in dit systeem model11. De Tabel van materialen staan alle specifieke uitrusting, materialen, reagentia en dierlijke bronnen die nodig zijn voor het uitvoeren van deze experimentele protocol.
1. de verwerking van besmette levers
- Euthanaseren muizen, 6-7 weken na infectie, door CO2 verstikking (snelheid van 10-30% van het volume van de kamer per minuut). Monitor muizen voor beëindiging van de ademhaling en hartslag.
Opmerking: Doorgaans tot 20 muizen mogen worden verwerkt op een bepaald moment. - Na het overbrengen van euthanized muizen een kabinet bioveiligheid, plaats van muizen op hun rug en hun ventrale oppervlak spuiten met 70% ethanol. Laat weken voor 1 min.
- Knijpen en optrekken van de huid van de onderbuik en dwars door de basis van de beknelde huid zich het dichtst bij de buik met een steriele chirurgische schaar. Trek de gesneden huid anteriorly (dat wil zeggen, naar het hoofd) te onthullen van de lever. Merk op dat de lever moet worden vergroot en als gevolg van een ei-geïnduceerde granulomateuze reactie (figuur 2A gevlekt).
- Verwijderen van de lever en plaats deze in een bekerglas van 200 mL steriele 1,2% NaCl oplossing met pen/strep.
- Herhaal stap 1.3 en 1.4 met resterende muizen.
Opmerking: Twintig muizen worden meestal verwerkt in een één oogst. - Plaats de lever in een steriele petrischaal en verwijder niet-lever vet/bindweefsel met steriel pincet.
- Bijgesneden/schoongemaakt levers overbrengen in een fles van de steriele 250 mL centrifuge met ~ 200 mL steriele 1,2% NaCl-oplossing met pen/strep.
- Krachtig schudden van de fles met de lever en met behulp van een steriele Wegwerp pipet, het verwijderen van de overtollige oppervlak schuim/zwevend puin. Langzaam uit de resterende zoutoplossing giet in een container of wastafel met 1% bleekwater (ontsmettingsmiddel).
- ~ 200 mL verse zoutoplossing aan de levers toevoegen en herhaalt u stap 1.8 drie keer.
2. lever extractie en miracidial isolatie
- Plaats de lever in een kleine steriele roestvrij stalen blender beker en voeg ~ 2 mL van 1.2% NaCl-oplossing (figuur 2B).
- Dekking van de cup met folie en een petrischaal ter voorkoming van lekkages, en mix voor 1 min door afwisselend hoge en lage snelheid (20 s lage snelheid/10 s hoge snelheid; herhaling) (figuur 2C).
- Verdeel de blended lever schorsing in steriele 250 mL centrifuge flessen (voor 20 levers gebruik 4 flessen).
- Steriele zoutoplossing met antibiotica aan ~ 200 mL totale volume/fles toevoegen. Weeg-/ balans flessen vóór centrifugeren.
- Centrifuge de blended levers bij 290 x g gedurende 15 min bij 4 oC. zachtjes af supernatant in een container met bleekmiddel vóór de teruggooi giet.
- Herhaal stap 2.4-2.5 keer. Zorg ervoor dat grondig resuspendeer lever sediment vóór centrifugeren.
- Na het verwijderen van de laatste saline wassen (stap 2.6), 200 mL steriele vijverwater met pen/strep toevoegen aan de Ingehuld leverweefsel, schudden om resuspendeer sediment, en spoel de suspensie met een gesteriliseerde maatkolf van de 1-L dat volledig met aluminium bedekt is folie, met uitzondering van de bovenkant 3 cm van de hals (figuur 2D).
Opmerking: Gebruik twee flessen (= 10 levers) per 1-L-kolf. Vijverwater simuleert de natuurlijke zoetwater omgeving nodig ter stimulering van miracidial uitbroeden van de eieren. - Met behulp van steriele vijverwater, vullen opwaarts naar de kolf tot ongeveer 3 cm boven de folie die betrekking hebben op de nek. Dan, zonder vertraging (zoals miracidia binnenkort beginnen om uit te komen), verwijderen van de resterende schuim en leverweefsel drijvend aan de oppervlakte door snel pipetteren tot ~ 12 mL vijverwater met puin en teruggooi het in een aparte buis negeren. Vervangen door nieuwe steriele vijverwater.
- Herhaal schoonmaak stap 2.8, drie keer, controleren op aanwezigheid van miracidia in de buis van de teruggooi. Niet langer de herhaling van de reiniging van stap als miracidia in de wash-oplossing verschijnen.
- Na de laatste wash, Voeg langzaam ~ 12 mL warme steriele vijverwater (vooraf opgewarmd tot 30 oC) een temperatuur om verloop te maken met schone, steriele warm water bovenop.
Opmerking: Dit is het beste gerealiseerd door langzaam ontladen water langs de kant van de hals van de kolf te mengen. - Plaats een kleine petrischaal cover over de opening van de kolf en een helder licht schijnen over de bovenkant van de kolf boven de folie cover voor het verlichten van de hogere oppervlakte van water.
Opmerking: Meestal binnen 5-10 min, zwemmen miracidia, aangetrokken door het licht, zal concentreren in groten getale binnen de eerste 2-3 cm voor vijverwater (figuur 3A).
3. Miracidial oogsten en teelt
- Wanneer miracidia hebben vergaard op het oppervlak na 10 min, met behulp van een steriele overdracht Pipetteer, ~ 8 mL vijverwater en overdracht aan een steriele 15 mL centrifugebuis verwijderen. Plaats de buis met miracidia op ijs.
- Voeg terug 8 mL warme steriele vijverwater langs de binnenkant van de maatkolf en wacht een ander 10 min.
- Met nieuwe buizen telkens, herhaal stap 3.1 en 3.2 drie keer. Na de 4th -collectie, houden de laatste buis op ijs gedurende 10 minuten zodat de miracidia te regelen. Deze set van buizen bestaat uit de eerste oogst.
- Centrifuge buizen met miracidia bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 oC in een vooraf gekoeld, gekoelde centrifuge.
- Onmiddellijk verwijderen van de meeste van de bovendrijvende substantie (~ 7 mL) voorzichtig niet te verstoren, de parasiet pellet (figuur 3B).
- Zwembad alle miracidia uit deze eerste oogst in een buis, dan spoel alle van de oorspronkelijke buisjes met ~ 1 mL steriele vijverwater en toevoegen aan de "gebundelde" buis.
- Toestaan van parasieten te vestigen op ijs voor ~ 5 min, en nogmaals centrifugeren van de parasieten bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 oC.
- Zorgvuldig Verwijder het supernatant en voeg dat 6-8 mL steriel Chernin evenwichtig zoutoplossing (CBSS +; zie tabel van materialen) met pen/strep.
- Zachtjes de miracidia en aliquot hen in een 24-well cultuur plaat (1 mL per putje), gevolgd door de buis te spoelen in 6-8 mL CBSS + en toevoeging van 1 mL voor rinse aan elk putje opschorten. Incubeer parasieten bij 26 oC onder normoxic omstandigheden. Concentraties van geïsoleerde miracidia zal variëren, maar zal meestal gemiddeld ~ 7000/mL.
- Als parasieten nog steeds te op de lichtbron concentreren zijn, herhaalt u stappen 3.1 tot 3.9 te blijven oogsten van eind-broedeieren miracidia maar verhogen het tijdsinterval tussen collecties aan 15-20 min.
Opmerking: Deze nieuwe reeks buizen vertegenwoordigt de tweede oogst. Echter, omdat miracidial nummers meestal lage zijn, larven van alle buizen meestal zijn gebundeld in een enkele cultuur putje met 2 mL CBSS +. - Op 24u na de oogst en teelt, resuspendeer zachtjes sporocysts in hun putten door pipetteren.
- Wacht een paar minuten om parasieten te vestigen aan de onderkant van de putten. Zodra zij hebben geregeld, verwijder voorzichtig het supernatant (~1.5 mL), dat de meeste van de ciliated epidermale platen werpen door miracidia tijdens de larvale transformatie zal bevatten. Deze "transformatie" supernatant kan worden verwijderd of opgenomen in de vervolgstudies van larvale secretoire producten.
- 1,5 mL verse CBSS + aan elke goed en voorzichtig pipet aan resuspendeer sporocysts toevoegen. Herhaal stap 3.12 desgewenst verder wassen of omzetten in een ander medium is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De overgrote meerderheid van miracidia zal meestal zijn verzameld in de eerste twee "oogsten". Incubatie van geïsoleerde miracidia in CBSS + Triggert het miracidium-aan-sporocyst transformatieproces (Figuur 4A- C). Binnen het eerste uur wells volgende overdracht aan cultuur met CBSS +, de meerderheid van de miracidia staken zwemmen (figuur 4A). Om 6 uur in cultuur momenteel miracidia actief vergieten hun ciliated epidermale platen (figuur 4B). Samenvallen met dit afwerpende proces, larven vormen hun buitenste syncytieel tegumental bedekking als ze tot primaire sporocysts transformeren. Allermeest naar de parasieten zullen hebben afgerond larvale transformatie, steeds volledig gevormde sporocysts, door 24-48 h na teelt in CBSS + (figuur 4C). Na 4 dagen van cultuur in CBSS + alleen, kan sporocyst overleving worden verwacht dat dalen tot ~ 80%. Echter sporocysts gekweekt voor 1 dag in de ROZS + en vervolgens overgedragen aan volledige Bge (cBge) medium voor 3 dagen meestal leiden betere overlevingskans van de patiënt en larven met een robuustere uitstraling (Figuur 4 d tot). Levensvatbaarheid van de sporocyst in het algemeen blijft stabiel tussen 4 en 7 dagen in de cBge met de voortdurende stijging van de larvale groei gedurende deze tijd in cultuur ten opzichte van CBSS + alleen.
Figuur 1 . Overzicht van protocol workflow. Schematisch overzicht van de belangrijke stappen die betrokken zijn bij het isolement en de teelt van miracidia afgeleid van muizen geïnfecteerd met de menselijk bloed fluke, S. mansoni. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verwerking van de besmette levers. (A) muis lever zwaar besmet met S. mansoni eieren. Let op de uitgebreide grootte, abnormale kleur en de aanwezigheid van granulomen in de besmette lever (rechts) in vergelijking met een normale niet-geïnfecteerde lever (links). (B) Washed muis levers na overdracht naar steriele roestvrij stalen blender beker. Levers waren dan gemengd voor één minuut met behulp van steriele folie en petrischaal ter dekking van de cup, dus het vermijden van lekkages (C). Na het mengen, was de lever homogenaat, met eieren, meerdere malen in een zoutoplossing gewassen en geresuspendeerde in steriele vijverwater, voordat wordt overgebracht naar een maatkolf van 1 L met aluminiumfolie (D bedekt). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Oogsten S. mansoni miracidia. Actief zwemmen miracidia geconcentreerd door aantrekkelijkheid aan het licht bij de bovenkant van de maatkolf (A). 10-min tussenpozen, zijn parasieten geoogst Pipetteer en geplaatst bij 4 ° C tot het immobiliseren van de larven. Miracidia zijn vervolgens gewassen in CBSS + door centrifugeren en verzameld in een enkele buis (B) net voor distributie aan putjes van de plaat van een cultuur. CBSS +; Chernin van evenwichtige zoutoplossing (Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Miracidial transformatie naar primaire sporocysts en hun onderhoud in vitro . S. mansoni miracidia en sporocysts geplaatst in in vitro cultuur voor verschillende tijdstippen na oogsten. Nieuw geoogste miracidia binnen 1 uur van de cultuur in CBSS + (A). Na 6 uur van cultuur miracidia begonnen te werpen hun ciliated epidermale platen (pijlen) zoals zij transformeren tot primaire sporocysts (B). Allermeest naar de miracidia hebben na 24u in CBSS + volledig getransformeerd naar primaire sporocysts (C). Sporocysts werden omgezet in CBSS + gedurende 24 uur, dan overgebracht en onderhouden in cBge medium voor 3 dagen (D). Sporocysts in het algemeen lijken meer robuuste en hogere overlevingskans van de patiënt op 4 dagen na teelt in aanwezigheid van cBge, in vergelijking met de CBSS + alleen. CBSS +, Chernin van evenwichtige zoutoplossing; cBge medium, volledige B. glabrata embryonale cel medium (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia van S. mansoni, geïsoleerd en gemanipuleerd zoals hierin beschreven kunnen infecteren alleen de slak tussengelegen host, en dus niet vertegenwoordigen een menselijke biohazard tijdens deze fase van larvale ontwikkeling. Echter, accidentele blootstelling/om infectie te voorkomen van slakken, moet worden gewaakt voor het uitvoeren van miracidial isolatie op een andere locatie van gebieden waar ziektegevoelige Biology slak aanwezig of onderhouden kan worden. Een logeerkamer, geregistreerd als BSL2 ruimte, wordt sterk aanbevolen. In Bovendien, alle wassen oplossingen worden gebruikt bij de behandeling van levers en larvale isolement moeten worden behandeld met een ontsmettingsmiddel (b.v., 1% bleekwater) voor de buitengebruikstelling.
Opgemerkt moet worden dat chirurgische verwijdering van lever van muizen geïnfecteerde en hun verdere verwerking vóór vermenging/homogenisering worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast (BSC) onder aseptische condities. Echter, om praktische redenen (gemak van het manipuleren van de laboratoriummonsters) alle andere procedures worden gedaan op een ontsmet benchtop met behulp van steriele recipiënten (bijvoorbeeldblender bekers, kolven, flessen en buizen, overdracht pipets, etc.) en steriele oplossingen die bevatten antibiotica (zoute, vijverwater, CBSS). Antibiotica worden toegevoegd aan alle oplossingen als verdere voorzorgsmaatregel tegen geïntroduceerde bacteriële besmetting. Bovendien, tijdens de miracidial isolatie en oogsten stappen (Protocol secties 2 en 3), is een kleine petrischaal cover geplaatst over de kolf openen om te minimaliseren van buiten besmetting tijdens de eerste verwijdering van schuim/lever puin en latere overdracht van geconcentreerde miracidia van de kolf gecentrifugeerd buizen.
Normaal gesproken oogsten we miracidia uit 20 besmette muis lever in één partij, waaruit wij larvale opbrengsten van ongeveer 5000 larven per lever schatten. Opbrengsten kunnen echter aanzienlijk variëren afhankelijk van de intensiteit van de infectie van individuele muizen resulterend in-charges-variatie in miracidial terugvorderingen. Isolatie kan worden uitgevoerd met behulp van minder beginnen levers, hoewel de methode die wij hebben beschreven is algemeen toepasbaar voor 10-20 levers. Wanneer 20 levers worden verwerkt, na de laatste resuspensie van de lever pellets in steriele vijverwater (Protocol sectie 2, stap 2.7), moeten de schorsingen gelijkelijk worden verdeeld in twee maatkolven van 1000 mL (2 flessen/kolf). Als 10 levers of minder worden gebruikt, wordt de oorspronkelijke lever homogenates (Protocol deel 2, stap 2.3) kan worden gedistribueerd naar 2 flessen en gewassen schorsingen vervolgens overgebracht naar een één maatkolf voor verdere verwerking. Één of 2 levers ook kunnen worden verwerkt, maar de hoeveelheid (hoeveelheden) extractie, wassen en broedeieren oplossingen moeten proportioneel, verlaagd met finale gewassen sediment in vijverwater worden overgebracht naar een 10 folie bedekte maatkolf mL te concentreren Miracidia.
Om te maximaliseren miracidial opbrengsten met een minimum van lever puin verontreiniging, is het ook belangrijk voor het uitvoeren van de vijver water wast (Protocol deel 2, stappen 2,7-2,9) zo snel en efficiënt mogelijk. Zodra de eieren zijn blootgesteld aan vijverwater, miracidial broedeieren doet zich kort daarna, hoewel de tijd voordat de larvale verschijning op de lichtbron in de hals van de kolf kan variëren van 5-20 min na het uitkomen begint. Om het verlies van parasieten te beperken tijdens de vijver water schoonmaken wassen stappen het is cruciaal dat het visueel controleren elke vijverwater voor vroege aankomst miracidia in het Opper water laag van de hals van de kolf. Bovendien, zodra miracidia 15 mL collectie buizen worden overgebracht en worden geplaatst op ijs, zal zij niet langer zwemmen activiteit en regelen naar de onderkant van de buis. Echter na het centrifugeren te pellet larven (sectie 3, stappen 3.4-3.5), zal miracidia weer starten om te zwemmen als water is toegestaan om te warmen. Daarom is het belangrijk om de vijverwater snel, maar zonder de pellet te verstoren of pipetteren omhoog zwemmen parasieten.
Zoals eerder vermeld, opbrengsten van geïsoleerde miracidia kunnen variëren afhankelijk van het aantal volwassen worm paren aanwezig in individuele muizen (infectie-intensiteit) en consistentie van de protocollen van de initiële infectie. Miracidia zijn sterk phototropic en de meerderheid (80-90%) zal concentreren op de lichtbron in de eerste periode van de oogst. De resterende 10-20% van de miracidia zullen blijven uitkomen en meer accumuleren langzaam tijdens de tweede periode van de oogst. Meest (> 95%) miracidia binnengebracht cultuur en onderhouden bij 26 oC in CBSS + medium zal hebben omgezet naar primaire sporocysts binnen 24-48 uur van de teelt. Op dit moment wordt meestal larvale levensvatbaarheid > 90%. Na 4 dagen in CBSS + alleen levensvatbaarheid druppels aanzienlijk (70-80%). Echter resulteert over te schakelen van het kweekmedium van CBSS + om te voltooien Bge middellange 24u volgende eerste CBSS teelt in hogere overlevingskans van de patiënt en meer robuuste groei. Wij onderhouden regelmatig korte sporocyst culturen onder normoxic omstandigheden. Sporocysts zijn echter heel gevoelig voor zuurstofniveaus, en met name reactieve zuurstof soorten die schadelijke oxidatieve schade7kunnen toebrengen. C.J. Bayne-4 en anderen hebben gemeld dat de algehele gezondheid en levensvatbaarheid van de sporocysts in vitro aanzienlijk zijn verbeterd wanneer culturen worden gehandhaafd onder hypoxische voorwaarden. Verlaagde zuurstofniveaus kunnen worden verkregen door vergassing (met stikstof) individuele afgesloten kolven of door stikstof-verrijking van de gasfase van de incubator4.
Als de hierboven genoemde methoden om een te isoleren en te kweken van Schistosoma zijn miracidia en sporocysts beschreven eerder. Het werd al vroeg erkend dat miracidial fototropie kan worden gebruikt om te trekken en zwemmen larven concentreren en dat geïsoleerde miracidia zou snel geïmmobiliseerdet in hyperosmotic zoutoplossingen (tussen 120-160 Mnd/Kg)8. Verder werd waargenomen dat onderhoud in zoutoplossingen in de transformatie van miracidia naar primaire sporocysts, de eerste intramolluscan larvale stadium9,12 resulteerde. Complexe media hebben ook geformuleerd ter ondersteuning van de langerlopende in vitro groei en ontwikkeling van de S. mansoni sporocyst fasen9,13,14,15, evenals de cellen afgeleid van de slak host Biology glabrata16. Deze formuleringen opgenomen van verschillende commerciële media en kunnen werden aangevuld met aminozuren, zouten, lipiden, reductoren en suikers. Volledige media formuleringen opgenomen ook warmte-geïnactiveerd foetale runderen of paard serum in verschillende concentraties. We hebben gevonden dat goede warmte-inactivering (HI) was cruciaal voor de overleving van de sporocyst en op lange termijn ontwikkeling in vitro. We vinden dat incubatie van serum (ontdooide, 100 mL flessen) in 60 oC waterbaden voor 60 min, met zacht mengen elke 10 min voor uniforme verwarming was het meest effectieve. Daarnaast testen we meestal verschillende percelen van serum van een potentiële leverancier voor larvale cultuur compatibiliteit. Ten slotte, de oprichting van de eerste (en momenteel alleen) authentiek molluskenfauna cellijn, de B. glabrata embryonale (Bge) cellijn door Hansen16 was een grote doorbraak dat aanzienlijk vooruitgang in de larvale Schistosoma vergemakkelijkt teelt inspanningen. Geïsoleerd S. mansoni miracidia, wanneer geplaatst in co-cultuur met Bge cellen ontwikkeld van primaire, secundaire/dochter sporocysts17, en uiteindelijk tot de eindfase cercarial18,19. Dus, zijn continu in vitro kweek van de gehele slak-fase van de levenscyclus van S. mansoni geboekt. Het Bge cel medium gebruikt in onze cultuur-systeem ondersteunt zowel sporocyst groei/ontwikkeling en het onderhoud van de Bge cellijn.
Kortom, hebben wij beschreven en geïllustreerd visueel een gedetailleerd protocol voor de massa een isolatie en de teelt van de etappe vrijzwemmende miracidial van S. mansoni. Deze miracidia, wanneer onderworpen aan de juiste kweekomstandigheden, zich kunnen ontwikkelen tot opeenvolgende primaire en secundaire sporocyst generaties, en uiteindelijk cercariae. Met de ontwikkeling en de voortdurende verfijning van hulpprogramma's die momenteel beschikbaar voor het manipuleren van genen en gen expressie in vitro via transgene, interferentie van RNA en genoom bewerken (bijvoorbeeld, CRISPR/Cas9) benaderingen, is het dat efficiënt voor ogen methoden voor de isolatie en de teelt van miracidia van uiteenlopende trematode soorten20 zal blijven om te kunnen kopen van materialen voor verdere vooruitgang van het onderzoek op dit gebied nodig zijn. Deze methode vult keurig een eerder beschreven protocol voor isoleren en kweken vrijzwemmende cercariae van S. mansoni te vergemakkelijken in vitro transformatie tot aan de zoogdieren schistosomula stadium21, voor eventuele teelt tot ovigerous volwassen wormen22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Gedeeltelijk gefinancierd door NIH grant RO1AI015503. Schistosoma-geïnfecteerde muizen werden verstrekt door de NIAID Schistosomiasis Resource Center in het biomedisch onderzoeksinstituut (Rockville, MD) door middel van NIH-NIAID Contract HHSN272201000005I voor distributie via BEI middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S.
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
