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Immunology and Infection

मल सामग्री में CWD Prions का पता लगाने के लिए वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण परख

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक सरल, तेज और कुशल prion प्रवर्धन तकनीक, वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण (RT-त्वरि) विधि का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

RT-त्वरि तकनीक है एक संवेदनशील इन विट्रो सेल मुक्त prion प्रवर्धन परख पर आधारित मुख्य रूप से बीज का खुलासा और संयोजक prion प्रोटीन के एकत्रीकरण (पीआरपी) सब्सट्रेट रूपांतरण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में prion बीज का उपयोग कर. RT-त्वरि एक उपंयास उच्च प्रवाह तकनीक है जो वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के अनुरूप है । amyloid फाइब्रिल विकास का पता लगाना डाई Thioflavin टी, जो ᵦ-शीट रिच प्रोटीन के साथ विशिष्ट बातचीत पर fluoresces पर आधारित है । इस प्रकार, amyloid गठन वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है । हम एक विश्वसनीय गैर इनवेसिव स्क्रीनिंग परीक्षण का पता लगाने के लिए विकसित करने की कोशिश की जीर्ण बर्बाद कर रोग (CWD) prions मल निकालने में । यहां, हम विशेष रूप से आरटी-त्वरि तकनीक अनुकूलित किया है CWD संक्रमित cervids के मल में पीआरपीअनुसूचित जाति बोने की गतिविधि प्रकट करते हैं । शुरू में, हम तैयार मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि RT-त्वरि में अपेक्षाकृत कम था, संभवत: मल सामग्री में संभावित परख अवरोधकों के कारण. मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि में सुधार और संभावित परख अवरोधकों को हटाने के लिए, हम एक बफर में मल के नमूनों homogenized डिटर्जेंट और चिढ़ाने अवरोधकों युक्त । हम भी विभिंन तरीकों से नमूनों को प्रस्तुत करने सोडियम phosphotungstic एसिड का उपयोग प्रोटीन वर्षण के आधार परअनुसूचित जाति , और केंद्रापसारक बल पर ध्यान केंद्रित । अंत में, मल अर्क अनुकूलित RT-त्वरि द्वारा परीक्षण किया गया था जो प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन शामिल करने के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार. इस प्रकार, हम पूर्व के मल में CWD prion सीडिंग गतिविधि के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की नैदानिक और आरटी द्वारा नैदानिक cervids-त्वरि, जो गैर इनवेसिव CWD निदान के लिए एक व्यावहारिक उपकरण हो सकता है.

Introduction

Prion रोग या संक्रामक spongiform encephalopathies (त्से तुंग) मनुष्यों में neurodegenerative-Creutzfeldt रोग (Jakob) सहित CJD विकार हैं, गोजातीय spongiform मस्तिष्क (बीएसई) में मवेशी, भेड़ और बकरियों में scrapie, और जीर्ण अपव्यय रोग (CWD) मे cervids 1,2. TSEs विशिष्ट spongiform उपस्थिति और मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की हानि की विशेषता है । "केवल प्रोटीन" परिकल्पना के अनुसार, prions मुख्य रूप से पीआरपीअनुसूचित जाति (scrapie के लिए ' अनुसूचित जाति ') 3, मेजबान इनकोडिंग सेलुलर prion प्रोटीन, पीआरपीसीका एक खुलासा isoform से बना रहे हैं । पीआरपी पीआरपीसी के रूपांतरण सेअनुसूचित जाति के परिणाम में एक अनुरूप ᵦ-शीट्स 4,5,6 जो एक बीज के रूप में कार्य करने के लिए बांध और अंय पीआरपीसी अणुओं में बदल सकते हैं । नव जनित पीआरपीअनुसूचित जाति अणुओं एक बढ़ती बहुलक 7,8 जो छोटे oligomers में टूट जाता है, संक्रामक नाभिक के उच्च संख्या में जिसके परिणामस्वरूप में शामिल कर रहे हैं । पीआरपीअनुसूचित जाति के एकत्रीकरण के लिए प्रवण है और आंशिक रूप से 9,10को छेड़ने के लिए प्रतिरोधी है ।

CWD को प्रभावित करता है जंगली और खेतिहर एल्क (Cervus canadensis), खच्चर हिरण (Odocoileus hemionus), सफेद पूंछ हिरण (WTD; Odocoileus virginianus), मूस (Alces Alces), व हिरन (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. यह क्षैतिज संचरण के साथ सबसे संक्रामक prion रोग माना जाता है cervid बातचीत और infectivity के पर्यावरणीय हठ 14,15द्वारा इष्ट । अंय prion रोगों के विपरीत जहां पीआरपीअनुसूचित जाति संचय और infectivity मस्तिष्क तक ही सीमित हैं, CWD में ये भी परिधीय ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ में पाया जाता है जैसे लार, मूत्र, और मल 16,17, 18.

Immunohistochemistry पीआरपी का पता लगाने के लिए CWD निदान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता हैअनुसूचित जाति वितरण और spongiform घावों 19,20. एलिसा और अधिक दुर्लभ मामलों में, पश्चिमी दाग भी CWD निदान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इस प्रकार, वर्तमान prion रोग निदान मुख्य रूप से पोस्टमार्टम ऊतकों में prions का पता लगाने पर आधारित है । CWD के लिए पूर्व-मार्टम निदान tonsils या recto-गुदा म्यूकोसा-जुड़े लसीकावत् ऊतक (RAMALT) बायोप्सी लेने के द्वारा उपलब्ध है; हालांकि, इस प्रक्रिया आक्रामक है और जानवरों के कब्जे की आवश्यकता है । इस प्रकार, मूत्र और मल के रूप में आसानी से सुलभ नमूनों का उपयोग, CWD prion का पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका होगा. हालांकि, उन मलमूत्र बंदरगाह अपेक्षाकृत कम prions की सांद्रता वर्तमान निदान विधियों का पता लगाने की सीमा के नीचे । नतीजतन, एक अधिक संवेदनशील और उच्च प्रवाह नैदानिक उपकरण की जरूरत है । इन विट्रो में जैसे प्रोटीन चक्रीय प्रवर्धन परख (PMCA) 21, amyloid सीडिंग परख, और वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण (RT-त्वरि) परख 22,23, 24 बहुत शक्तिशाली उपकरण को स्वयं का दोहन करने के लिए पीआरपीअनुसूचित जाति के प्रचार की क्षमता इन विट्रो prion रूपांतरण की प्रक्रिया में नकल है और इस तरह पीआरपीअनुसूचित जाति के मिनट की मात्रा की उपस्थिति बढ़ाना 25 ,26. आर टी-त्वरि विधि, तथापि, इस तथ्य का लाभ लेता है कि β-पत्रक द्वितीयक संरचना में समृद्ध रूपांतरण उत्पाद विशेष रूप से thioflavin t (Th-t) बाइंड कर सकते हैं । इसलिए, संयोजक पीआरपी (rPrP) पर वरीयता प्राप्त रूपांतरण amyloid तंतुओं में बढ़ता है जो गु-t बांध और इस तरह गु के प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है-टी समय के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के रूप में व्यक्त की । एक बार निगरानी की, RFU इस तरह के अंतराल चरण के रूप में रिश्तेदार बोने की गतिविधियों, और मात्रात्मक मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंतराल चरण (एच) दहलीज तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके दौरान प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरण में rPrP रूपांतरण गु-T प्रतिदीप्ति की पता लगाने की सीमा के नीचे है । स्पष्ट अंतराल चरण के अंत, एक पर्याप्त amyloid नाभिक (nucleation/बढ़ाव) के गठन के लिए सहवर्ती, तब होता है जब गु टी प्रतिदीप्ति सीमा स्तर से अधिक है और सकारात्मक हो जाता है । amyloid तंतुओं के विकास के वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है और प्रारंभिक पीआरपीअनुसूचित जाति या बोने की क्रिया नमूना में निहित है जो अधिक बीज उत्पंन द्वारा परिलक्षित है । बारी में इन बीजों amyloid फाइबर विकास की एक तेजी से घातीय चरण प्रेरित ।

क्योंकि इस परख के रूप में कम के रूप में पता लगाने में सक्षम है 1 पीआरपीअनुसूचित जाति के 24fg, उच्च संवेदनशीलता इस तकनीक के लिए विभिंन परिधीय ऊतकों, मलमूत्र या अंय में पीआरपीअनुसूचित जाति का पता लगाने से पूर्व मार्टम या गैर इनवेसिव निदान प्राप्त करने के लिए उत्तीर्ण infectivity के निम्न स्तर बंदरगाह नमूना के प्रकार. RT-त्वरि निश्चित रूप से अपने reproducibility, व्यावहारिकता, तेजी (कम से ५० ज) और कम लागत के लिए परख की तुलना में अंय परख पर लाभ प्रदान करता है । यह PMCA में इस्तेमाल किया sonication जैसे तकनीकी जटिलताओं से बचा जाता है; इसके अलावा, यह एक टेप में किया जाता है-सील microplate जो एक अच्छी तरह से एयरोसोल संदूषण के जोखिम को कम करता है । बहु-कुआं स्वरूप एक ही प्रयोग में ९६ नमूनों तक के विश्लेषण को सक्षम बनाता है । में झूठी सकारात्मक और rPrP के सहज रूपांतरण की आवर्तक समस्या का मुकाबला करने में इन विट्रो रूपांतरण परख एक दहलीज के कार्यांवयन में (कट-ऑफ) RT-त्वरि बहुत उपयोगी है । दरअसल, नकारात्मक नियंत्रण (नकारात्मक नमूनों की औसत RFU + 5 एसडी 27) के परिणामों के आधार पर, एक आधार रेखा से सेट अप किया जाता है जिसमें सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच भेदभाव हो सकता है. प्रत्येक नमूने के लिए चार की प्रतिकृति का उपयोग इस प्रकार के रूप में एक नमूना परिभाषित करने में मदद कर सकते है सकारात्मक जब कम से ५०% की प्रतिकृतियां एक सकारात्मक संकेत दिखाने के लिए, यानी कट पार 28। बीज और सब्सट्रेट के बीच समरूपता RT-त्वरि में की आवश्यकता नहीं है, उदाहरण के रूप में एक पिछले अध्ययन में, हंसटर rPrP एक अधिक संवेदनशील सब्सट्रेट मानव पीआरपी में मुताबिक़ सब्सट्रेट की तुलना में पाया गया थाvCJD वरीयता प्राप्त और भेड़ scrapie अस्तव्यस्त प्रतिक्रियाओं 29. हंसटर-भेड़ chimeric rPrP भी मानव rPrP की तुलना में एक और अधिक अच्छी तरह से अनुकूल सब्सट्रेट होने का सुझाव दिया गया था CJD prions 30मानव संस्करण का पता लगाने । इस प्रकार, विभिंन प्रजातियों से rPrP सब्सट्रेट का उपयोग इस परख में बहुत आम है । इस परख सफलतापूर्वक कई prion रोगों के लिए लागू किया गया है, जैसे छिटपुट CJD 31,३२,३३, genेटिक prion रोग ३४, बीएसई ३५,३६,३७, scrapie 23,३६, और CWD ३८,३९,४०,४१, ४२. RT-त्वरि में बीज के रूप में प्रसंस्कृत मस्तिष्कमेरु द्रव, पूरे रक्त, लार, और मूत्र का उपयोग कर अध्ययन सभी पीआरपीअनुसूचित जाति ३८का पता लगाने के लिए सफल रहे थे,३९,४०,४१, ४२. ऐसे रक्त प्लाज्मा कि amyloid गठन, Orrú एट अलके अवरोधक शामिल हो सकते है के रूप में नमूनों में पता लगाने की क्षमता को बढ़ावा । (२०११) द्वारा amyloid गठन के संभावित अवरोधकों को दूर करने के लिए एक रणनीति विकसित की मुसलिम पीआरपीअजा immunoprecipitation (आईपी) स्टेप और आरटी-त्वरि, नाम दिया गया "एन्हांस्ड त्वरि" परख (eQuIC). इसके अलावा, एक सब्सट्रेट प्रतिस्थापन चरण के बाद नियोजित किया गया था ~ 24 प्रतिक्रिया समय के एच में आदेश संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए. अंततः, के रूप में के रूप में कम के रूप में 1 पीआरपीअनुसूचित जाति के एजी 30eQuIC द्वारा detectable था ।

आदेश में मल के अर्क को शुद्ध करने के लिए और मल में संभव परख अवरोधकों को हटाने, मल प्रयोगात्मक मौखिक संक्रमण पर एल्क से नैदानिक और नैदानिक चरणों में एकत्र नमूनों डिटर्जेंट और चिढ़ाने अवरोधकों युक्त बफर में homogenized थे । मल निष्कर्षों आगे विभिंन तरीकों को प्रस्तुत किया गया सोडियम phosphotungstic एसिड (NaPTA) वर्षण के माध्यम से प्रोटीन वर्षण का उपयोग नमूनों में पीआरपीअनुसूचित जाति ध्यान केंद्रित । NaPTA वर्षण विधि, पहले सफर एट अल द्वारा वर्णित है । ४३, परीक्षण नमूनों में पीआरपीअनुसूचित जाति ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पीआरपीसीके बजाय पीआरपीअनुसूचित जाति के तरजीही वर्षण में नमूना परिणामों के साथ NaPTA की मशीन । हालांकि, आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट है । यह कदम भी शामिल है और rPrP, जो कुछ मामलों में मनाया जाता है के सहज रूपांतरण को रोकने में मदद की । अंत में, मल अर्क अनुकूलित आरटी द्वारा परीक्षण किया गया त्वरि माउस rPrP (एए 23-231) का उपयोग कर एक सब्सट्रेट के रूप में और प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन सहित पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए.

यहाँ परिणाम प्रदर्शित करता है कि इस विधि में सुधार CWD prions के बहुत कम सांद्रता का पता लगा सकते हैं और NaPTA वर्षा और सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के बिना एक प्रोटोकॉल की तुलना में मल नमूनों में पता लगाने और विशिष्टता की संवेदनशीलता बढ़ जाती है. इस विधि संभावित अंय ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ के लिए लागू किया जा सकता है और जंगली और कैप्टिव cervids में CWD निगरानी के लिए महान उपयोग की जा सकती है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. भ-त्वरि मल सामग्री का उपयोग कर

  1. की तैयारी cervid मल का अर्क
    1. मल को जोड़कर मल कर homogenate कर के 1 जी की सामग्री के 10 मिलीलीटर में से जोड़ें बफर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच ७.१, १३० मिमी NaCl, ०.०५% 20 के बीच, 1 mM PMSF और 1x पूर्ण चिढ़ाने अवरोधकों, EDTA मुक्त) को 10% की एक अंतिम एकाग्रता (डब्ल्यू/ homogenization बफर के उपयोग से पहले तैयार किया जा सकता है और पर संग्रहित-20 & #176; ग.
    2. Homogenize मल छर्रों (1 जी) और बफर (10 मिलीलीटर) ट्यूबों में (जैसे, gentleMACS मीटर ट्यूबों) के साथ एक dissociator का उपयोग कर एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम के लिए प्रोटीन के लिए निर्माता से कमरे के तापमान पर 1 मिनट. इस चरण को दोहराएं दो से तीन बार जब तक कि मल नमूने पूरी तरह से homogenized बफ़र में हैं ।
    3. parafilm के साथ ट्यूबों सील और कमरे के तापमान पर एक 1 एच की मशीन के लिए एक कमाल का मंच या रोटरी शेखर पर उंहें जगह है ।
    4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १८,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    5. supernatants जो प्रोटीन के अर्क होते है और उंहें १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में aliquot इकट्ठा । Aliquots पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C आगे अनुप्रयोगों के लिए.
  2. । मल में पीआरपी Sc का एकाग्रता अर्क
    ध्यान दें: आदेश में CWD prions के लिए मल निकालने के नमूने में ध्यान केंद्रित, जिससे आरटी द्वारा पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार-त्वरि, एक प्रोटीन वर्षा कदम जोड़ा जाता है प्रोटोकॉल के लिए ।
    1. NaPTA वर्षण विधि
    2. Add २५० & #181; L के 10% (w/v) के N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) से 1 मल प्रोटीन निकालने के लिए 2% के sarkosyl के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए (v/
    3. ट्यूब जो parafilm और ३७ पर मशीन के साथ नमूनों में शामिल सील & #176, एक thermomixer में १,४०० rpm पर लगातार मिलाते के तहत 30 मिनट के लिए सी ।
    4. एक स्टॉक 10% (डब्ल्यू/वी) सोडियम phosphotungstic एसिड और मैग्नीशियम क्लोराइड के १७० मिमी, पीएच ७.४ के नमूनों में ०.३% (डब्ल्यू/वी) सोडियम phosphotungstic एसिड की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए युक्त एक शेयर समाधान के साथ मल प्रोटीन निकालने और sarkosyl के मिश्रण को समायोजित करें ।
    5. ३७ पर नमूनों की मशीन & #176; सी के लिए 2 एच ४०० rpm पर लगातार मिलाते के साथ ।
    6. के नमूनों पर 14 & #176; C के लिए 30 मिनट पर १५,८०० x g. supernatants को सावधानीपूर्वक निकालें ।
    7. धोने बफर में उन्हें reसस्पैंड द्वारा छर्रों धोने (10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ७.५, १०० मिमी NaCl, ०.५% ट्राइटन-एक्स १००, 10 मिमी EDTA, ०.५% सोडियम deoxycholate (डब्ल्यू/वी), और ०.१% sarkosyl (डब्ल्यू/
    8. के नमूनों पर 14 & #176; ग के लिए 15 मिनट में १५,८०० x g. supernatants को सावधानीपूर्वक निकालें ।
    9. १०० में छर्रों reसस्पेंड & #181; एल (1/10 मल प्रोटीन निकालने की मूल मात्रा के) RT-त्वरि कमजोर पड़ने बफर के.
      नोट: RT-त्वरि कमजोर पड़ने बफर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच ६.९, १३० मिमी NaCl, ०.१% एसडीएस (डब्ल्यू/वी) और 1 एक्स N2 पूरक) उपयोग करने से पहले तैयार किया जाता है. 10 मिलीलीटर का कुल वॉल्यूम एक ०.२ & #181 के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है; m acrodisc सिरिंज एक सिरिंज का उपयोग कर फ़िल्टर और फिर पर संग्रहित-20 & #176; C तक उपयोग.
    10. स्टोर NaPTA इलाज नमूनों पर-20 & #176; ग जब तक उंहें RT में उपयोग-त्वरि परख ।
  3. भ-त्वरि परख
    1. एक ताजा 10 mM th-t शेयर समाधान तैयार (th के ०.०३२ g-t 10 मिलीलीटर में डबल आसुत एच 2 ओ) ।
    2. गु के 1:10 के एक कमजोर पड़ने-टी स्टॉक समाधान डबल आसुत एच 2 में गु के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1 मिमी के टी यह एक ०.२ & #181 के माध्यम से फिल्टर; एम acrodisc सिरिंज फिल्टर एक सिरिंज का उपयोग कर.
    3. गल माउस संयोजक पीआरपी (rPrP, aa 23-231) सब्सट्रेट (10 & #181; g/mL प्रति भ-त्वरि प्रतिक्रिया) पर संग्रहित-८० & #176; ग पर बर्फ.
    4. लोड ५०० & #181; rPrP सब्सट्रेट के एल में एक समय में १०० केडीए आकार बहिष्करण फ़िल्टर microtubes और 5 मिनट के लिए १४,००० x g पर कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक (एक ट्यूब/फ़िल्टर उपयोग किया जा सकता दो बार).
    5. एक बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूब में eluted सब्सट्रेट हस्तांतरण और 4 पर रखने के लिए & #176; C तक उपयोग.
    6. गल भ-त्वरि कमजोर पड़ने बफर अकांउट पर-20 & #176; ग.
    7. में बीज (मल प्रोटीन निकालने) के कमजोर पड़ने-त्वरि कमजोर पड़ने बफर बनाने:
      पतला नमूना: मल प्रोटीन निकालने का प्रयोग करें पतला
      पतला 2 x 10 -1
      पतला 2 x 10 -2
      पतला 2 x 10 -3
    8. आरटी के लिए स्टॉक समाधान तैयार-त्वरि प्रतिक्रिया मिश्रण:
      फॉस्फेट-बफर खारा ( पंजाब): 5x
      NaCl: 2 मीटर डबल आसुत में तैयार NaCl का स्टॉक सॉल्यूशन ज 2 ओ.
      EDTA: १०० मिमी स्टॉक समाधान EDTA में तैयार डबल आसुत ज 2 ओ
    9. सभी समाधानों (step 1.3.8) के उपयोग से पहले, प्रत्येक समाधान को ०.२ & #181 के माध्यम से अलग से फ़िल्टर करें; मी acrodisc सिरिंज एक सिरिंज का उपयोग कर फिल्टर और उन्हें कमरे के तापमान पर बाँझ रखना.
    10. नमूनों की संख्या के अनुसार RT-त्वरि प्रतिक्रिया मिश्रण की कुल मात्रा तैयार करें (९८ & #181; L प्रति नमूना प्रतिक्रिया की मात्रा और चार नमूने प्रति प्रतिकृति) इस मात्रा के 10% से अधिक इस्तेमाल किया जा करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त मिश्रण है.
      1. आरटी-त्वरि प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट, pH ६.९, ३०० mm NaCl, 1 mm EDTA, 10 & #181; एम गु-टी, 10 & #181; जी/एमएल rPrP सब्सट्रेट, और डबल आसुत जल प्रतिक्रिया में rPrP अंतिम एकाग्रता को समायोजित करने के लिए) स्टॉक सोल का उपयोग utions
      2. मिश्रण सभी समाधान अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting एक फिल्टर टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके । जितना संभव हो भंवर के उपयोग से बचें ।
      3. एक ५० मिलीलीटर डिस्पोजेबल pipetting जलाशय में मिश्रण डालो ।
      4. का उपयोग एक मल्टीचैनल पिपेट लोड करने के लिए ९८ & #181; भ-त्वरि प्रतिक्रिया मिश्रण के एल एक कुआं में एक ९६-अच्छी तरह से ऑप्टिकल नीचे प्लेट.
    11. जोड प्रत् येक भ-त्वरि प्रतिक्रिया 2 & #181; अनपतला या 10 गुना से पतला मल प्रोटीन निकालने का L । चार प्रतिकृति में प्रत्येक नमूने का परीक्षण ।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग में, मल नमूनों के सीरियल कमजोर पड़ने (unपतला से लेकर 2 x 10 -3 ) से CWD-नकारात्मक और सत्यापित CWD-सकारात्मक जानवरों के रूप में उपयोग किया जाता है नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण, क्रमशः.
    12. एक प्लेट रीडर में ४२ पर मशीन से पहले एक सील टेप के साथ प्लेट सील & #176; 1 मिनट के दोहराया चक्र के साथ 25 घंटे के लिए सी डबल कक्षीय मिलाते (७०० rpm) और 1 मशीन भर में आराम मिनट ।
    13. प्रतिदीप्ति माप सेटिंग्स निर्धारित करें:
      उत्तेजना: ४५० एनएम
      उत्सर्जन: ४८० एनएम
      नीचे पढ़ें, चमक की संख्या: 20
      मैनुअल लाभ: १००० (मशीन पर निर्भर करता है)
      एकीकरण समय: 20 & #181; एस
    14. 25 एच के अंत में प्लेट रीडर से थाली निकालें
    15. 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर प्लेट नीचे स्पिन कुओं के बीच संभावित संदूषण से बचने के लिए ।
      16. प्लेट से सील हटा
    16. .
    17. ९० & #181 जोड़कर एक नया ९६-well प्लेट तैयार; आर टी-त्वरि प्रतिक्रिया ताजा सब्सट्रेट और ताजा प्रतिदीप्ति डाई गु-टी युक्त मिश्रण के रूप में खंड 1.3.1 में वर्णित के रूप में 1.3.6.
    18. अंतरण 10 & #181; L पहली थाली के प्रत्येक कुआं से नए तैयार ९६ अच्छी तरह से थाली.
    19. नई प्लेट सील और कदम 1.3.13 में वर्णित कदम के बाद अतिरिक्त ५० ज के लिए आरटी-त्वरि परख जारी है । ५० ज का यह अतिरिक्त कदम ७५ एच.
      की कुल प्रतिक्रिया समय कर देगा नोट: आर टी-त्वरि परख की सभी प्रक्रियाओं को सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया जाता है ।
    20. डेटा एकत्र करें ।
      1. पढ़ें और प्रत्येक अच्छी तरह से हर 15 मिनट के गु-T प्रतिदीप्ति संकेत दस्तावेज़
      2. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कुल चक्र के डेटा एकत्र और quadruplicate प्रतिक्रियाओं के औसत के साथ एक स्प्रेडशीट में स्थानांतरण.
      3. प्लाट के फलां डाटा का यूज करते हैं । x-अक्ष से संबंधित RT-त्वरि (h) की प्रतिक्रिया समय के लिए और y-अक्ष संबंधित प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) से मेल खाती है । प्रत्येक वक्र एक ज्ञात नमूना के कमजोर पड़ने से मेल खाती है ।
        4. प्रत्येक प्रयोग में
      4. , नकारात्मक नियंत्रण प्लस 5 मानक विचलन का उच्चतम माध्य मानों की गणना करके एक थ्रेशोल्ड demarcate वर्तमान प्रकाशित साहित्य में वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > ४१ .
        नोट: सभी प्रतिकृतियां जो परिभाषित सीमा पार सकारात्मक माना जाता है । यदि चार से कम दो बाहर सीमा पार प्रतिकृति, नमूना तो सकारात्मक माना जाता है ।
< p class = "jove_title" > 2. संयोजक Prion प्रोटीन का शुद्धिकरण (rPrP)

  1. बैक्टीरियल स्टॉक और rPrP
    की अभिव्यक्ति की वृद्धि नोट: ई कोलाई ( ई. कोलाई ) तनाव Rosetta (DE3) वेक्टर पीईटी-24 एंकोडिंग के साथ तब्दील माउस पीआरपी (अवशेषों 23-231) rPrP तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. गल ग्लिसरॉल स्टॉक ऑफ Rosetta (DE3) बर्फ पर पीईटी-24 mPrP (23-231) के साथ बदल.
    2. लकीर पौंड (Luria Bertani) ५० के कनमीसिन के अंतिम एकाग्रता के साथ प्लेटें & #181; जी/एमएल और एक ३७ & #176 में रात भर की मशीन; सी मशीन । सुनिश्चित करें कि प्लेटें उल्टा करने के लिए ठोस बैक्टीरिया युक्त मीडिया में नमी संघनित्र से बचने कर रहे हैं । दो प्लेटों में वृद्धि के लिए सुनिश्चित करने के लिए दोनों प्लेटों में से एक है ।
    3. पौंड के 1 L तैयार करें और इसे बाँझ बनाने के लिए आटोक्लेव.
    4. पूरक 1 कनमीसिन के 1 मिलीलीटर (५० मिलीग्राम/एमएल) और क्लॉरॅंफेनिकोल (३४ मिलीग्राम/एमएल) के 1 मिलीलीटर के साथ बाँझ पौंड मीडिया के एल
    5. एक डिस्पोजेबल टीका पाश का उपयोग करके एक थाली के एक कॉलोनी उठाओ लगाना कनमीसिन और क्लॉरॅंफेनिकोल युक्त पौंड मध्यम के 3 मिलीलीटर.
    6. जगह मिनी एक मशीन में संस्कृतियों ३७ में & #176; C 5-6 h.
      7. के लिए २२५ rpm पर लगातार झटकों के साथ
    7. जोड़ें मिनी-पौंड मीडिया के मूल 1 एल के आराम करने के लिए संस्कृतियों के साथ एक साथ एक्सप्रेस Autoinduction प्रणाली 1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए ।
    8. 2 एल कुप्पी, या बड़ा में संस्कृति प्लेस, एक मशीन में ३७ & #176 पर 20-24 h.
      9. के लिए २०० rpm पर लगातार झटकों के साथ सी ।
    9. भाजित 1 एल संस्कृति में 4 x २५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों ।
    10. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ३,७५० x g पर संस्कृति युक्त ट्यूबों नीचे स्पिन ।
    11. supernatant को त्यागें और ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में बैक्टीरियल छर्रों इकट्ठा, तो उन पर स्थिर-८० & #176 आगे प्रसंस्करण तक; सी । परिणामस्वरूप छर्रों एक अच्छा प्रोटीन उपज के लिए 3 से 4 जी तौला है ।
  2. को शामिल करने की तैयारी शरीर
    1. गल जमी गोली (3 से 4 जी) पर ३७ & #176; C कुछ मिनटों के लिए.
    2. 10 मिनट के लिए गोली एक और समय रुक-८० & #176; सी और गल फिर से । दो अधिक बार जमने और गल के इस कदम को दोहराएं ।
    3. 1x में बैक्टीरियल गोली reसस्पेंड & #160; lysis रिएजेंट (उदा. BugBuster मास्टर मिक्स) द्वारा pipetting धन्यबाद. बैक्टीरियल गोली के 1 जी के लिए एजेंट के 5 मिलीलीटर का प्रयोग करें । मिश्रण पूरी तरह से homogenize करने के लिए सुनिश्चित करें.
    4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए एक झूली कुरसी पर homogenate की मशीन ।
    5. १६,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए homogenate केंद्रापसारक ।
    6. को ध्यान से supernatants इसे बंद करके छोड़ें.
    7. पिछले चरण में उपयोग के रूप में 1x lysis रिएजेंट की एक ही मात्रा में छर्रों Homogenize ।
    8. कमरे के तापमान पर एक झूली कुरसी पर 15 मिनट के लिए homogenate की मशीन ।
    9. 1:10 (0.1 x) के एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें lysis एजेंट ४० मिलीलीटर की कुल homogenate मात्रा प्राप्त करने के लिए । अच्छी तरह से homogenize करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए उलटा करके मिक्स ।
    10. केंद्रापसारक homogenate पर 15 मिनट के लिए ७,९०० x g पर 4 & #176; C.
    11. को सावधानी से घनघोर supernatant से त्यागें.
    12. 0.1 x lysis रिएजेंट के ४० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    13. केंद्रापसारक homogenate पर 15 मिनट के लिए १६,००० x g पर 4 & #176; C.
    14. इसे डालने से supernatant ध्यान से त्यागें और शामिल शरीर में गोली की दुकान-20 & #176; C आगे संसाधन तक ।
  3. प्रोटीन शोधन
    1. गल. कमरे के तापमान पर समावेशी निकायों.
    2. 8 एम guanidine के 14 मिलीलीटर में गल समावेशी निकायों को भंग-एचसीएल (३८ ग्राम guanidine हाइडरोक्लॉराइड में ०.१ मीटर नापो 4 पीएच ८.० और एच 2 ओ से ५० मिलीलीटर के साथ निलंबन भरें; अंतिम समाधान पर पीएच समायोजित न करें) solubilize प्रोटीन के लिए ।
    3. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से homogenize करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. ५० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक झूली कुरसी पर lysate मशीन
    5. नी-NTA राल मोती के 18 जी तैयार (3 से 4 जी बैक्टीरियल गोली के लिए 18 जी); उंहें १०० मिलीलीटर पानी के साथ कुल्ला वैक्यूम और एक १०० मिलीलीटर ०.२२ & #181; एम बोतल शीर्ष फ़िल्टर ।
      1. ५० एमएल ट्यूब में नी-NTA राल मोतियों की 18 जी जगह और denaturing बफर (१०० मिमी सोडियम फॉस्फेट, 10 मिमी Tris, पीएच ८.०, 6 एम guanidine हाइडरोक्लॉराइड, पीएच 8) के लिए अंतिम मात्रा ५० मिलीलीटर के लिए बनाने के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें.
      2. कमरे के तापमान पर एक झूली कुरसी पर ५० मिनट के लिए denaturing बफर में मोतियों Equilibrate ।
    6. 5 मिनट के लिए १६,००० x g पर समावेशन शरीर lysate के लिए अघुलनशील मलबे को दूर केंद्रापसारक ।
    7. equilibrated मोतियों को supernatant जोड़ें और छर्रों को त्यागें.
    8. कमरे के तापमान पर ४० मिनट के लिए एक झूली कुरसी पर मिश्रण डाल करने के लिए नी-NTA राल प्रोटीन बाध्यकारी अनुमति देते हैं ।
      नोट: निकेल chelate मोती अपने निकल अपनत्व द्वारा पीआरपी शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है । histidine-रिच एन-टर्मिनल क्षेत्र के पीआरपी निकल (द्वितीय) है, जो प्रोटीन निकल आयनों के लिए किसी भी अपने टैग के बिना बांध करने की अनुमति देता है के लिए अपनत्व प्रदान करता है ।
    9. को पानी से धोकर FPLC दोनों रेखाओं (A और B) को साफ करें ।
    10. भागो denaturing बफर (१०० mm सोडियम फॉस्फेट, 10 मिमी Tris, पीएच ८.०, 6 एम guanidine हाइडरोक्लॉराइड, पीएच 8) दोनों लाइनों (ए और बी) के माध्यम से प्रधानमंत्री को प्रणाली (कॉलम अभी तक संलग्न नहीं है.)
    11. स्तंभ पर राल लोड । हवाई बुलबुले को कम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    12. FPLC करने के लिए स्तंभ अनुलग्न करें और १००% denaturing बफ़र a और 0% बफ़र B (१०० mM सोडियम फॉस्फेट, 10 mM Tris, pH ८.०) से पहले 0% denaturing बफ़र और अंत में १००% reबफ़र के लिए से एक रैखिक ग्रैडिएंट चलाने । यह क्रमिक बदलाव २४० मिनट के लिए ०.७५ मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर चलाया जाता है और पीआरपी की उचित तह के लिए आवश्यक है ।
      नोट: क्रोमेटोग्राफिक शुद्धि प्रक्रिया के दौरान, विकृत पीआरपी पहली बार धीरे से राल पर denaturing बफर को बदलने के लिए बफर के एक रैखिक ढाल लागू करने से गुना है । इस कदम से chaotropic guanidine-एचसीएल भी निकलेगी ।
    13. सुनिश्चित करें कि १००% का खुलासा बफर ०.७५ मिलीलीटर पर एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए जारी है/
    14. कुल्ला लाइन के साथ एक पानी के बाद रेफरेंस बफर (१०० mm सोडियम फॉस्फेट, 10 मिमी Tris, ५०० mm imidazole, पीएच ५.८) कॉलम को दरकिनार । यह बाहर denaturing बफर जो अब अकटा प्रणाली में रेफरेंस बफर द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है साफ हो जाएगा ।
    15. Elute 2 मिलीलीटर/मिनट से १००% से ४० मिनट के लिए एक रैखिक ढाल चला कर बफर बी और 0% रेफरेंस बफर एक पर पहली बार करने के लिए 0% rethe बफर और १००% रेफरेंस बफर.
      नोट: रेफरेंस बफ़र में imidazole के उच्च एकाग्रता पीआरपी & #39; s बाइंडिंग निकल (II) के लिए प्रतिस्पर्धा करेंगे । प्राथमिक प्रोटीन चोटी के लिए ढाल के माध्यम से रास्ते के बारे में 1/3 elute शुरू कर देना चाहिए ।
      1. वाच वर्णलेख फॉर ओडी २८० एनएम बढाना.
    16. केवल बड़े शिखर के केंद्र में प्रोटीन युक्त ट्यूबों इकट्ठा ।
      नोट: 2 मिलीलीटर प्रत्येक के eluted अंश 15 मिलीलीटर ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं ।
    17. के बारे में 1/3 मात्रा (डायलिसिस बफर के 1 एमएल) के साथ तुरंत ट्यूबों में निहित प्रोटीन पतला (10 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच ५.८) ।
    18. तुरंत बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
    19. पूल eluted प्रोटीन ट्यूबों में निहित.
      20. डायलिसिस कैसेट्स में प्रोटीन खराब
    20. (आणविक वेट कट-ऑफ १० केडीए).
    21. में कैसेट डाल पूर्व ठंडा डायलिसिस बफर (३.६ एल) के लिए 2 ज पर 4 & #176; सी, तो एक ताजा डायलिसिस बफर (३.६ एल) में रात भर के लिए कैसेट स्थानांतरण । बनाने यकीन है कि डायलिसिस बफर लगातार आंदोलन के तहत है ।
    22. फिल्टर प्रोटीन के माध्यम से डायलिसिस के बाद एक ०.२ & #181; एम acrodisc सिरिंज एक सिरिंज का उपयोग कर फिल्टर.
    23. एक बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
    24. ध्यान केंद्रित करने या यदि आवश्यक कमजोर करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ०.३ मिलीग्राम/एमएल.
      नोट: एसडीएस द्वारा शुद्धता की पुष्टि-पृष्ठ और Coomassie नीले दाग.
    25. microcentrifuge ट्यूबों में प्रोटीन की 1 मिलीलीटर aliquots बनाने के लिए और तुरंत पर स्टोर-८० & #176; सी आगे RT-त्वरि प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उपयोग तक.

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Representative Results

10% (डब्ल्यू/वी) पर तैयार CWD मल अर्क बीज RT-त्वरि प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे, अभी तक पता लगाने की संवेदनशीलता कम था 27. मल homogenization के लिए एक विशिष्ट बफर का उपयोग करने के बजाय हिरण rPrP जो और अधिक विशिष्ट परिणाम प्राप्त करने की अनुमति के उपयोग के लिए सहवर्ती-त्वरि प्रतिक्रियाओं में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम था 27। NaPTA वर्षा के अलावा (चित्रा 2) प्रतिक्रियाओं के बोने की गतिविधि का प्रवर्धन बाधा के बिना आरटी-त्वरि में rPrP के सहज रूपांतरण (चित्रा 1) कम कर दिया. हालांकि बेहतर प्रवर्धन NaPTA उपचार पर मनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप CWD के प्रतिदीप्ति संकेतों-सकारात्मक मल नमूनों अभी भी कम थे (चित्रा 1). इसके अलावा कुछ नमूनों का prion प्रवर्धन कम प्रतिदीप्ति स्तर पर लगातार पठार पर पहुँच गया. यह प्रतिक्रियाओं के संतृप्ति इंगित करता है, जो गिरावट के कारण हो सकता है/विकार के rPrP या के गठन के बाहर मार्ग समुच्चय जो rPrP पूल 30भस्म । आगे prions के प्रवर्धन में सुधार लाने और पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, एक सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था. प्रारंभ-त्वरि प्रोटोकॉल के लिए सब्सट्रेट प्रतिस्थापन की शुरूआत (चित्र 2) संवेदनशीलता (७७%; rt-त्वरि में 18 नमूनों में से 14 को सकारात्मक किया गया) और विशिष्टता (१००%; rt-त्वरि में ऋणात्मक नियंत्रणों में से कोई भी धनात्मक नहीं) का पता लगाना (देखें एट अल चेंग से 1 टेबल । 27). अंत में, इन सभी चरणों (चित्रा 3) CWD prions के RT-त्वरि का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और संवेदनशील प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए नेतृत्व किया, infectivity के निम्न स्तर युक्त नमूना का उपयोग कर.

सब्सट्रेट प्रतिस्थापन RT-त्वरि प्रतिक्रिया के पहले 25 एच के बाद पेश किया गया था, ताजा सब्सट्रेट और ताजा प्रतिदीप्ति डाई गु टी युक्त प्रतिक्रिया बफर की भरपाई करके. प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम शुरू करके, आर टी-त्वरि प्रतिक्रिया समय ५० एच से ७५ एच तक बढ़ाया गया था । के रूप में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के शामिल होने के साथ चित्रा 2 में दिखाया गया है, prion प्रवर्धन के एक महत्वपूर्ण सुधार मनाया गया था.

Figure 1
चित्र 1: RT में माउस rPrP सब्सट्रेट की कम सहज रूपांतरण-त्वरि शुद्ध CWD-नकारात्मक मल homogenate के साथ वरीयता प्राप्त. मल गैर के homogenates संक्रमित एल्क (C181-006) या खच्चर हिरण मल निकालने बफर में homogenized थे 10% की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए (डब्ल्यू/ शुद्धि के लिए, इन मल homogenates संसाधित किया गया और 10-बार NaPTA वर्षण द्वारा केंद्रित । पतित मल homogenates (एक), NaPTA-शुद्ध और केंद्रित रूपों (ख) के रूप में संकेत पतला quadruplicate RT-त्वरि प्रतिक्रियाओं के साथ माउस rPrP के रूप में इस्तेमाल किया गया एक सब्सट्रेट के रूप में । y-अक्षों के सापेक्ष गु-T प्रतिदीप्ति इकाइयां दिखाते हैं, x-अक्ष प्रतिक्रिया समय दर्शाते हैं । सहज रूपांतरणों की कमी को NaPTA-शुद्धि मल नमूनों (b) में देखा गया था । चेंग एट अल से इस्तेमाल डेटा । 27. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2. मल में CWD prions के सुधार का पता लगाने सब्सट्रेट प्रतिस्थापन का उपयोग. व्यक्तिगत एल्क के मल homogenates (C051-05, C052-05) मौखिक रूप से CWD prions से संक्रमित शुद्ध और NaPTA वर्षण द्वारा केंद्रित किया गया । 2 x 10-1 से 2 x 10-3 के बीच NaPTA-उपचारित नमूनों को पतला किया गया था-माउस rPrP सब्सट्रेट के साथ quadruplicate RT-त्वरि प्रतिक्रियाओं के लिए प्रयुक्त । RT-त्वरि परख सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के बिना प्रदर्शन किया गया था (एक) ५० घंटे की एक नियमित अवधि में या ७५ एच (बी) की एक विस्तारित मशीन की अवधि के लिए सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के शामिल करने के साथ. बाद के लिए, सब्सट्रेट प्रतिस्थापन RT-त्वरि प्रतिक्रिया के पहले 25 ज के बाद पेश किया गया था । प्रतिक्रिया मात्रा का ९० प्रतिशत हटा दिया गया था और rPrP सब्सट्रेट और गु-टी युक्त हौसले से तैयार आरटी-त्वरि प्रतिक्रिया मिश्रण द्वारा प्रतिस्थापित किया गया. प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम शुरू करने से, RT-त्वरि प्रतिक्रिया समय ५० एच से ७५ ज. चेंग एट अल से इस्तेमाल डेटा को बढ़ाया गया था. 27. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह CWD से पीआरपीअनुसूचित जाति मल निष्कर्षण का वर्णन आरेख-संक्रमित cervids और सीडिंग गतिविधि और prion प्रवर्धन का उपयोग कर आरटी-त्वरि परख । CWD-संक्रमित पशुओं से मल के नमूनों में homogenized एक मल निष्कर्षण बफर, NaPTA वर्षा विधि के लिए प्रस्तुत और आरटी-त्वरि परख द्वारा परीक्षण किया जाता है । बाद एक सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम शुरू करने से प्रदर्शन किया गया था । NaPTA और सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम के शामिल करने के लिए सहज रूपांतरण और बोने की क्रिया और prion प्रवर्धन में मजबूत सुधार की कमी के परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

RT-त्वरि पहले मूत्र और मौखिक रूप से संक्रमित सफेद पूंछ हिरण और खच्चर हिरण के मल अर्क में CWD prions का पता लगाने के लिए कार्यरत था ३८। इस पांडुलिपि में दिखाया प्रणाली RT-त्वरि परख के एक अनुकूलित विधि है । अतिरिक्त कदम "शास्त्रीय" RT-त्वरि परख में शामिल किया गया पता लगाने और संक्रमित पशुओं के मल सामग्री में CWD prions के लिए परख की संवेदनशीलता में सुधार होगा ।

मल अर्क में पता लगाने की कम संवेदनशीलता हमें आरटी-त्वरि प्रोटोकॉल के सुधार के लिए नेतृत्व किया । में संवेदनशील प्राप्त करने के लिए इन विट्रो मल में prions का पता लगाने, prion रूपांतरण और/या प्रचार के साथ हस्तक्षेप और पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए घटक जो हटाने के लिए नमूना तैयारी के लिए महत्वपूर्ण कदम जोड़े गए. RT-त्वरि और NaPTA/sarkosyl उपचार के प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन शामिल पूर्व नैदानिक और नैदानिक CWD-संक्रमित एल्क में सीडिंग गतिविधि का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण था, और मल अर्क में prion रूपांतरण की पहचान की सीमा को बढ़ाने के लिए .

NaPTA वर्ष आमतौर पर एक आम तकनीक sarkosyl निष्कर्षण के साथ अलग और एक जासूसी स्तर परअनुसूचित जाति पीआरपी ध्यान केंद्रित है । NaPTA को अधिमानतः पीआरपीसी ४३ से अधिक पीआरपीअनुसूचित जाति के लिए जाना जाता है, जबकि sarkosyl एक डिटर्जेंट के लिए एक सेल मुफ्त प्रणाली ४४में कम सांद्रता में prion रूपांतरण की सुविधा जाना जाता है । इस के साथ संरेखण में, NaPTA और sarkosyl का एक संयोजन का उपयोग करते हुए इन विट्रो में fibrillar समुच्चय के एक उच्च उपज ४५,४६,४७से पहले दिखाए गए के रूप में उत्पन्न हो सकता है । इस पद्धति RT-त्वरि परख में पहले शामिल किया गया है परिधीय CWD prions सफलतापूर्वक ऐसे शुद्ध लार ३९ और पूरे रक्त ४०के रूप में नमूना में पता लगाने के लिए । हमारे अध्ययन पहले सबूत प्रदान करता है कि NaPTA/sarkosyl शुद्धि के प्रोटोकॉल में मल नमूना तैयारी में शामिल है सक्षम बनाता है CWD RT द्वारा prion डिटेक्शन-त्वरि. इसके अलावा, इस पद्धति के साथ हम CWD में rPrP सब्सट्रेट के सहज रूपांतरण-RT-त्वरि परख में नकारात्मक मल homogenates को कम करने में सक्षम थे.

एक संभावित तंत्र सब्सट्रेट प्रतिस्थापन के प्रभाव को समझाने के लिए प्रस्तावित किया गया है 30. प्रतिक्रिया के पहले दौर में (ताजा सब्सट्रेट के अलावा पहले), केवल बीज की एक छोटी राशि RT-त्वरि प्रतिक्रियाओं के लिए जोड़ा जाता है. जबकि केवल rPrP के एक हिस्से को वरीयता प्राप्त प्रतिक्रियाओं में शामिल किया गया है, सब्सट्रेट के बाकी या तो गैर-amyloid समुच्चय फार्म करने के लिए रिएक्शन प्लेट कुओं की दीवारों के साथ बातचीत द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक फार्म जो कम देखने के द्वारा परिवर्तित होने की संभावना है करने के लिए परिवर्तित किया जा ded RT-त्वरि उत्पादों के बजाय मूल बीज । नतीजतन, बीज के लिए rPrP की निगमन दर धीमी है, और फाइब्रिल गठन के अंतराल चरण में detectable नहीं है । के रूप में वरीयता प्राप्त आर टी-त्वरि अंतराल चरण में विकसित उत्पादों के अंत में एक "तेजी से विधानसभा चरण" तक पहुंचने के लिए लंबी हैं, prions मिलाते हुए या छोटे समुच्चय के पार्श्व इसके अलावा के माध्यम से विभाजन द्वारा तेजी से परिलक्षित किया जा सकता है । इस स्तर पर, ताजा सब्सट्रेट प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा आसानी से नहीं बल्कि विशिष्ट समुच्चय बनाने की तुलना में बीज उत्पादों में शामिल किया गया है । हमारे प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन कदम का निगमन एक संशोधन है कि वृद्धि की संवेदनशीलता थी; यह पूर्व नैदानिक पशुओं और/या युक्त निरोधात्मक यौगिकों से पीआरपीअनुसूचित जाति की एक बहुत कम राशि के साथ नमूनों में prion बीज का पता लगाने के लिए उपयोगी था ।

आर टी-त्वरि परख के बजाय PMCA है, जो इन विट्रो प्रोटीन का खुलासा प्रवर्धन परख 21वर्णित है, कई फायदे हैं । PMCA में ट्यूब और एक पानी sonicator के भीतर समाहित स्नान में sonicated हैं; sonicator की परिधि में तैनात ट्यूबों के केंद्र ४८में तैनात ट्यूबों की तुलना में प्रवर्धन की कम प्रभावकारिता दिखा. आरटी-त्वरि प्रणाली तड़पनेवाला को नियंत्रित करने के लिए आसान लगता है । एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग RT-त्वरि का एक वास्तविक लाभ है, तथापि, एमबी-PMCA द्वारा विकसित Moudjo एट अल । ४९ , ५०, समान लाभ दिखाया लेकिन अभी भी कम PMCA में उपयोग किया जाता है ।

सब्सट्रेट के रूप में, RT-त्वरि रूपांतरण के लिए संयोजक rPrP का उपयोग करता है; इसके विपरीत, ज्यादातर मामलों में PMCA सामान्य मस्तिष्क homogenate का उपयोग करता है. इसके अलावा, RT-त्वरि में कोई अनुक्रम समरूपता बीज और सब्सट्रेट ५१-५३के बीच की आवश्यकता है ।

cofactors की उपस्थिति PMCA में prion प्रतिकृति के लिए आवश्यक है और परिणामी उत्पाद संक्रामक है । हालांकि, RT-त्वरि परख में, प्रवर्धित पीआरपी संक्रामक नहीं है । इन विट्रो में प्रवर्धन परख झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं की वजह से सबसे शायद क्योंकि पीआरपीसी की सहज रूपांतरण की घटना एक आवर्ती समस्या है । इसलिए, परख और इस अध्ययन में इस्तेमाल की शर्तों के अनुरूप इस तरह की गड़बड़ी को कम करने के लिए बीज rPrP-रूपांतरण और सहज रूपांतरण के बीच अंतर को अधिकतम करने के लिए सिलवाया रहे थे ।

अंत में, NaPTA/sarkosyl उपचार मल में परख अवरोधकों को हटाने में सक्षम बनाता है और सहज रूपांतरण कम कर देता है । दिलचस्प है, उपचार precipitatedPrPअनुसूचित जातिके बोने की गतिविधि में बाधा नहीं था । सब्सट्रेट प्रतिस्थापन concomitantly अपनाया गया था जब इसके अलावा, पता लगाने की संवेदनशीलता काफी सुधार हुआ था.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रशिक्षण और cervid पीआरपी बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए Dr. Caughey (NIH रॉकी पर्वत प्रयोगशालाओं) के लिए आभारी हैं । एसजी कनाडा रिसर्च चेयर प्रोग्राम द्वारा समर्थित है । हम इस अनुसंधान के लिए धन स्वीकार जीनोम कनाडा, अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान और अलबर्टा कृषि और वानिकी जीनोम अलबर्टा के माध्यम से, और इस काम के समर्थन में कैलगरी विश्वविद्यालय से एसजी । हम पशु अनुसंधान के लिए मार्गरेट साध फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२७ Prions जीर्ण अपव्यय रोग आरटी-त्वरि इन विट्रो रूपांतरण परख निदान पता लगाना मल
मल सामग्री में CWD Prions का पता लगाने के लिए वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण परख
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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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