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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour décrire une technique d’amplification de prion simple, rapide et efficace, la méthode de conversion induite par le tremble en temps réel (RT-QuIC).

Abstract

La technique RT-QuIC est sensibles in vitro acellulaires prion amplification basée principalement sur le mauvais repliement épépiné et l’agrégation de substrat protéique (PrP) de prion recombinante graines prion en utilisant comme modèle pour la conversion. RT-QuIC est une nouvelle technique de haut débit qui est analogue au Real Time polymerase chain reaction (PCR). Détection de la croissance de fibrilles amyloïdes est basée sur la teinture thioflavine T, qui produit une fluorescence lors de l’interaction spécifique avec les riches protéines ᵦ-feuille. Ainsi, la formation d’amyloides peut être détectée en temps réel. Nous avons tenté de développer un test de dépistage non-invasif fiable pour détecter les prions de la maladie (MDC) dépérissement chronique extrait fécale. Ici, nous avons spécifiquement adapté la technique RT-QuIC pour révéler la PrPSc ensemencement d’activité dans les excréments de cervidés infectés de cervidés. Au départ, l’activité ensemencement des selles extraits que nous préparé a été relativement faible en RT-QuIC, probablement à cause d’inhibiteurs potentiels de dosage dans les matières fécales. Pour améliorer l’activité ensemencement d’extraits de matières fécales et supprimer les inhibiteurs potentiels de dosage, nous avons homogénéisé les échantillons les dans une mémoire tampon contient des détergents et des inhibiteurs de la protéase. Aussi, nous avons soumis les échantillons à différentes méthodes pour se concentrer sur la base de la précipitation de protéines à l’aide de sodium acide phosphotungstique et force centrifuge la PrPSc . Enfin, les extraits de matières fécales ont été testés par optimisé RT-QuIC qui comprenait le remplacement de substrat dans le protocole pour améliorer la sensibilité de détection. Ainsi, nous avons établi un protocole pour la détection sensible du prion CWD ensemencement d’activité dans les excréments de cervidés pré-cliniques et cliniques par RT-QuIC, qui peut être un outil pratique pour le diagnostic non invasif de DLG.

Introduction

Les maladies à prions ou encéphalopathies spongiformes transmissibles (est) sont des maladies neurodégénératives comme la maladie de Creutzfeldt - Jakob (SCJ) chez l’homme, encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) chez les bovins, la tremblante chez les ovins et les caprins et gaspillage chronique maladie (CWD) chez les cervidés 1,2. Est se caractérisent par l’aspect distinctif spongiforme et la perte de neurones dans le cerveau. Selon l’hypothèse de « protéine seule », prions sont principalement composées de PrPSc (« Sc » pour la tremblante) 3, une isoforme forme anormale de la protéine prion cellulaire hôte codé, PrPC. PrPSc résulte de la conversion de la PrPC dans une conformation enrichie en ᵦ-feuilles 4,5,6 , qui peut agir comme une graine de lier et de convertir les autres molécules PrPC . Les molécules nouvellement créées de la PrPSc sont incorporés dans un croissant polymère 7,8 , qui se brise en petits oligomères, résultant en plus grand nombre de noyaux infectieuses. PrP-Sc est sujette à l’agrégation et est partiellement résistante aux protéases 9,10.

CWD affecte sauvages et d’élevage de wapiti (Cervus canadensis), le cerf mulet (Odocoileus hemionus), le cerf de Virginie (WTD ; Odocoileus virginianus), l’orignal (Alces alces) et le renne (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Il est considéré comme la plus contagieuse maladie à prions avec transmission horizontale, favorisée par des interactions de cervidés et de persistance dans l’environnement de l’infectivité 14,15. Contrairement à d’autres maladies à prions, où l’accumulation de PrPSc et l’infectiosité sont confinés au cerveau, gros débris ligneux ceux-ci sont également présents dans les tissus périphériques et les liquides organiques par exemple salive, l’urine et fèces 16,17, 18.

Immunohistochemistry est considéré comme l’étalon-or pour le diagnostic de la DLG détecter les PrPSc distribution et spongiforme lésions 19,20. ELISA et dans de plus rares cas, la tache occidentale sont également utilisés pour le diagnostic de DLG. Ainsi, diagnostic des maladies à prions actuelle repose essentiellement sur la détection des prions dans les tissus post-mortem. Diagnostic ante-mortem CWD est disponible en prenant des amygdales ou des biopsies de tissu lymphoïde associé aux muqueuses recto-anal (test RAMALT) ; Toutefois, cette procédure est invasive et nécessite la capture des animaux. Ainsi, l’utilisation de spécimens facilement accessibles, tels que l’urine et les selles, serait une façon pratique pour la détection du prion CWD. Toutefois, le port de ces excréments des concentrations relativement faibles de prions inférieure au seuil de détection des méthodes actuelles de diagnostic. Par conséquent, un outil de diagnostic de débit plus sensible et plus élevée est nécessaire. In vitro le systèmes de conversion, comme la protéine misfolding cyclique amplification assay (PMCA) 21, amyloïde ensemencement dosage et conversion induite par le tremble en temps réel (RT-QuIC) dosage 22,23, 24 sont des outils très puissants pour exploiter la capacité propageant des PrPSc à reproduire in vitro le processus de conversion de prion et ainsi amplifier la présence de quantités infimes de PrPSc à des niveaux détectables 25 ,26. La méthode RT-QuIC, cependant, tire parti du fait que le produit de conversion enrichi en feuillet β structure secondaire peut lier spécifiquement thioflavine T (Th-T). Par conséquent, PrP recombinante (PRPR) lors de la conversion ensemencée se développe en fibrilles amyloïdes qui se lient Th-T et peuvent ainsi être détectées en temps réel par la mesure de la fluorescence du Th-T exprimée en unités (RFU) de la fluorescence relative au fil du temps. Une fois contrôlé, la RFU peut être utilisée pour évaluer les activités d’ensemencement relatives et paramètres quantitatifs tels que la phase de latence. La phase de latence représente le temps (h) requis pour atteindre le seuil, au cours de laquelle PRPR conversion dès les premiers stades de la réaction est inférieure au seuil de détection de la fluorescence de Th-T. La fin de la phase de latence apparente, concomitante à la formation d’un noyau amyloïde suffisante (nucléation/allongement), se produit lorsque la fluorescence Th-T dépasse le niveau de seuil et devient positive. La croissance de la substance amyloïde fibrilles peuvent être détectées en temps réel et de l’initiale PrPSc ou semie activité contenue dans l’échantillon est amplifiée par la segmentation qui génère plus de graines. Ces graines induisent à son tour une rapide phase exponentielle de croissance de fibres amyloïdes.

Parce que ce test est capable de détecter aussi bas que 1 fg des PrPSc 24, la haute sensibilité qualifie cette technique pour atteindre ante mortem ou diagnostic non invasif en détectant les PrPSc dans divers tissus périphériques, excréments ou autre types de spécimens ayant de faibles niveaux d’infectiosité. RT-QuIC constitue certainement avantages par rapport aux autres épreuves pour sa reproductibilité, praticité, rapidité (moins de 50 h) et de faibles coûts par rapport aux essais biologiques. Elle évite les complexités techniques comme la sonication utilisé dans PMCA ; en outre, il est pratiqué dans une microplaque ruban étanche qui minimise le risque de contamination des aérosols de chaque puits. Le format multipuit permet l’analyse des échantillons jusqu'à 96 dans la même expérience. Pour contrer le problème récurrent de faux positifs et de la conversion spontanée du PRPR dans les essais de conversion in vitro , la mise en œuvre d’un seuil (cut-off) en RT-QuIC est très utile. En effet, selon les résultats du contrôle négatif (RFU moyenne des échantillons négatifs + 5 SD 27), une ligne de base est mis en place d'où on peut faire la discrimination entre les échantillons positifs et négatifs. L’utilisation de quatre répétitions de chaque échantillon peut donc aider à définir un échantillon positif quand au moins 50 % des répliques montre un signal positif, c'est-à-dire franchir le seuil de 28. L’homologie entre les graines et le substrat n’est pas nécessaire dans le RT-QuIC, comme par exemple dans une étude antérieure, hamster PRPR a trouvé un substrat plus sensible par rapport au substrat homologue en humain PrPvMCJ épépiné et tremblante du mouton ensemencées réactions 29. hamster-moutons chimérique PRPR a également été suggéré d’être un substrat plus adapté que PRPR humain pour détecter des prions de MCJ variante humaine 30. Ainsi, l’utilisation de substrats PRPR provenant de différentes espèces est très fréquente dans ce test. Ce test a été appliqué avec succès à plusieurs maladies à prions, comme sporadique MCJ 31,32,33, genles maladies de prion ETIC 34, l’ESB 35,36,37, tremblante 23,36et CWD 38,39,40,41, 42. Des études utilisant traitement liquide céphalorachidien, sang, salive et urine comme graines à RT-QuIC étaient tous réussis pour détecter les PrPSc 38,39,40,41, 42. afin de favoriser la capacité de détection dans des échantillons tels que le plasma sanguin contenant des inhibiteurs de la formation d’amyloïde, Orrú et al. (2011) a élaboré une stratégie pour éliminer les inhibiteurs potentiels de formation amyloïde par peignage PrPSc immunoprécipitation (IP) étape et RT-QuIC, nommé « renforcée QuIC » test (eQuIC). En outre, une étape de remplacement de substrat a été employée après ~ 24 h temps de réaction afin d’améliorer la sensibilité. En fin de compte, comme bas que 1 ag du PrPSc a été détecté par eQuIC, 30.

Afin de purifier des extraits de matières fécales et d’éliminer les inhibiteurs de dosage possible dans les selles, les échantillons de matières fécales recueillis aux stades précliniques et cliniques de wapiti à l’infection expérimentale orale ont été homogénéisés dans un tampon contenant des détergents et des inhibiteurs de la protéase. Les extraits de matières fécales ont été davantage soumis à différentes méthodes pour concentrer les PrPSc dans les échantillons utilisant la précipitation de protéines par précipitation de sodium phosphotungstique acide (NaPTA). La méthode de précipitation de NaPTA, tout d’abord décrite par Safar al. 43, est utilisée pour concentrer le PrPSc dans les échantillons de test. L’incubation de NaPTA avec les résultats de l’échantillon dans les précipitations préférentielle de PrPSc plutôt PrPC. Toutefois, le mécanisme moléculaire est encore incertain. Cette étape a également aidé contenant et empêcher la conversion spontanée du PRPR, ce qui est observé dans certains cas. Enfin, les extraits de matières fécales ont été testés par optimisé RT-QuIC en utilisant la souris PRPR (aa 23-231) comme substrat et y compris le remplacement de substrat dans le protocole pour améliorer la sensibilité de détection.

Les résultats présentés ici montrent que cette méthode améliorée peut détecter des concentrations très faibles de prions CWD et augmente la sensibilité de détection et de spécificité dans les fèces par rapport à un protocole sans remplacement de précipitation et de substrat NaPTA. Potentiellement, cette méthode peut être appliquée à d’autres tissus et les fluides corporels et peut être d’une grande utilité pour la surveillance de la CWD chez les cervidés sauvages et en captivité.

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Protocol

1. RT-QuIC matières fécales à l’aide de

  1. préparation des excréments de cervidés extraits
    1. Make homogénat fécale en ajoutant 1 g de matières fécales à 10 mL de selles extrait tampon (phosphate de sodium de 20 mM, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, PMSF 1 mM et 1 x toutes les inhibiteurs de la protéase, sans EDTA) pour donner une concentration finale de 10 % (p/v). Le tampon d’homogénéisation peut être préparé avant l’utilisation et stocké à -20 ° C.
    2. Homogénéisez pelotes fécales (1 g) et tampon (10 mL) dans des tubes (par exemple, les tubes de M gentleMACS) en utilisant un dissociator avec un programme prédéterminé du fabricant pour les protéines pendant 1 min à température ambiante. Répétez cette opération deux ou trois fois jusqu'à ce que les échantillons de matières fécales sont complètement homogénéisés dans la mémoire tampon.
    3. Sceller les tubes avec parafilm et placez-les sur un agitateur basculant de plate-forme ou rotatif pour une incubation de 1 h à température ambiante.
    4. Centrifuger les tubes à 18 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    5. Recueillir les surnageants qui contiennent la protéine extrait et aliquote dans 1,5 mL tubes. Aliquotes peuvent être stockées à-80 ° C pour les autres applications.
  2. Extraits de la concentration de la PrP Sc dans les selles
    Remarque : afin de concentrer les prions CWD dans les échantillons de matières fécales extrait, ce qui améliore la sensibilité de détection par RT-QuIC, une étape de précipitation de protéines est ajoutée pour le protocole.
    1. Méthode de précipitation NaPTA
    2. Ajouter 250 µL de 10 % (p/v) de N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) à 1 mL de protéine fécale extrait pour donner une concentration finale de sarkosyl de 2 % (v/v).
    3. Sceller les tubes contenant les échantillons avec parafilm et incuber à 37 ° C pendant 30 min sous agitation constante à 1 400 tr/min dans un thermomixer.
    4. Ajuster le mixage des extraits protéiques fécale et sarkosyl avec une solution contenant 10 % (p/v) d’acide phosphotungstique sodique et 170 mM de chlorure de magnésium, pH 7,4 pour obtenir une concentration finale de 0,3 % (p/v) de sodium phosphotungstique acide dans les échantillons de.
    5. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 2 h avec une agitation constante à 400 tr/min.
    6. Centrifuger les échantillons à 14 ° C pour 30 min à 15 800 x g. supprimer les surnageants soigneusement.
    7. Laver les boulettes en les resuspendant dans le tampon de lavage (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton X 100, 10 mM EDTA, 0,5 % sodium Désoxycholate (p/v) et 0,1 % sarkosyl (p/v)).
    8. Centrifuger les échantillons à 14 ° C à 15 min à 15 800 x g. supprimera les surnageants soigneusement.
    9. Remettre en suspension les pellets dans 100 µL (extrait 1/10 du volume initial de la protéine fécale) de tampon de dilution RT-QuIC.
      NOTE : RT-QuIC tampon de dilution (phosphate de sodium de 20 mM, pH 6,9, 130 mM NaCl, SDS 0,1 % (p/v) et 1 X N2 supplément) est établi avant l’utilisation. Un volume total de 10 mL est filtré à travers un filtre de seringue 0,2 µm filtres acrodisc à l’aide d’une seringue et puis conservé à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    10. Stocker les échantillons de NaPTA traité à-20 ° C jusqu'à leur utilisation dans test de RT-QuIC.
  3. RT-QuIC dosage
    1. préparer une solution fraîche 10 mM Th-T (0,032 g d’e-T dans 10 mL de double distillée H 2 O).
    2. Faire une dilution de 01:10 de la solution dans double distillée H 2 O pour faire une concentration finale de Th-T de 1 mM le filtre à travers une seringue de filtres acrodisc 0,2 µm filtrer à l’aide d’une seringue Th-T.
    3. Décongeler le substrat recombinante de PrP (PRPR, aa 23-231) souris (10 µg/mL par réaction RT-QuIC) stockée à -80 ° C sur la glace.
    4. Charge 500 µL de substrat PRPR simultanément dans 100 kDa taille exclusion filtre microtubes et centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min à température ambiante (un tube/filtre peut être utilisé jusqu'à deux fois).
    5. Transférer le substrat éluée dans un tube stérile de 1,5 mL et les conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
    6. Tampon de dilution décongeler RT-QuIC conservé à -20 ° C.
      7. Tampon de dilution
    7. faire des dilutions de la graine (extrait de protéine fécale) en RT-QuIC :
      Échantillon non dilué : utiliser l’extrait de protéine fécale non dilué
      dilué 2 x 10 -1
      dilué 2 x 10 -2
      dilué 2 x 10 -3
    8. préparer les solutions de RT-QuIC mélange réactionnel :
      (solution saline tamponnée au Phosphate) PBS) : 5 X
      NaCl : solution de NaCl préparé en double distillée H 2 O. mère de 2 M
      Les 100 mM EDTA : solution de EDTA préparé en double distillée H 2 O.
    9. Avant l’utilisation de toutes les solutions (étape 1.3.8), filtrer chaque solution séparément avec un filtre de seringue 0,2 µm filtres acrodisc à l’aide d’une seringue et gardez-les stérile à la température ambiante.
    10. Préparer un volume total de RT-QuIC mélange réactionnel selon le nombre d’échantillons (98 µL volume de réaction par échantillon et de quatre répétitions par exemple) à utiliser pour s’assurer d’avoir assez de mélange pour toutes les réactions plus 10 % de ce volume.
      1. Utiliser un tube de 15 mL pour préparer le mélange réactionnel RT-QuIC (phosphate de sodium de 20 mM, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL PRPR substrat et l’eau bidistillée à ajuster la concentration finale PRPR dans la réaction) en utilisant le sol stock butions.
      2. Toutes les solutions bien mélanger en pipetage et descendre à l’aide d’une pipette avec une pointe de filtre. Éviter autant que possible l’utilisation du vortex.
      3. Verser le mélange dans un réservoir de pipetage jetable 50 mL.
      4. Utiliser une pipette multicanaux pour charger 98 µL du mélange de réaction RT-QuIC dans chaque puits d’une plaque 96 puits à fond.
    11. Ajouter à chaque RT-QuIC réaction 2 µL de non dilué ou de l’extrait de protéine fécale en série dilué 10 fois. Chaque échantillon d’essai dans quatre réplicats.
      Remarque : Pour chaque expérience, des dilutions d’échantillons de matières fécales (allant de non dilué à 2 x 10 -3) de CWD-négatif et vérifiées positifs CWD animaux sont utilisées comme témoins négatifs et positifs, respectivement.
    12. Sceller la plaque avec un ruban d’étanchéité avant incubation dans un lecteur de plaque à 42 ° C pendant 25 h avec des cycles répétés de 1 min double orbital secouant (700 tr/min) et 1 min de repos tout au long de l’incubation.
    13. Paramètres de mesure de fluorescence Define :
      Excitation : 450 nm
      Emission : 480 nm
      bas lire, nombre de clignotements : 20
      gain manuel : 1000 (dépend de la machine)
      temps d’intégration : 20 µs
    14. retirer la plaque du lecteur de plaque à la fin du 25 h.
    15. Tourner la plaque à 3 000 x g pendant 3 minutes afin d’éviter une contamination potentielle entre les puits.
    16. Retirer le joint de la plaque.
    17. Préparer une nouvelle plaque de 96 puits en ajoutant 90 µL de RT-QuIC mélange réactionnel contenant le substrat frais et frais fluorescence colorant e-T comme décrit dans section 1.3.1 à 1.3.6.
    18. Bien sur plaque de transférer 10 µL de chaque puits de la première plaque au 96 nouvellement préparé.
    19. Flasque de la nouvelle et poursuivre le dosage RT-QuIC pour h 50 supplémentaires suivant la procédure décrite à l’étape 1.3.13. Cette étape supplémentaire de 50 h fera le temps total de réaction de 75 h.
      Remarque : Toutes les procédures de test de RT-QuIC sont font sous coffret biosécurité.
    20. Recueillir les données.
      1. Lecture et document le signal de fluorescence Th-T de chaque puits chaque 15 min.
      2. Collecter les données des cycles totales à l’aide du logiciel d’analyse de données et le transfert dans une feuille de calcul avec la moyenne des quatre réactions.
      3. Tracer les moyennes des données. L’axe des abscisses correspondant à du temps de réaction de RT-QuIC (h) et l’axe des ordonnées correspondant aux unités de fluorescence relative (RFU). Chaque courbe correspond à une dilution d’un échantillon connu.
      4. Dans chaque expérience, délimiter un seuil de calculer les valeurs moyennes plus élevées de contrôle négatif plus 5 écarts-types comme décrit dans le courant publié littérature 41.
        REMARQUE : Toutes les répétitions qui ont franchi le seuil défini sont considérées comme positives. Si au moins deux des quatre réplicats franchir le seuil, l’échantillon est alors considéré comme positif.

2. Purification de la protéine Prion Recombinant (PRPR)

  1. croissance du stock bactérienne et l’expression de PRPR
    Remarque : l' Escherichia coli (e.coli) souche Rosetta (DE3) transformée avec vecteur animal-24 codant la PrP (résidus 23-231) la souris a été utilisée pour préparer le PRPR.
    1. Décongeler stock de glycérol de Rosetta (DE3) transformé avec pEt-24 mPrP(23-231) sur glace.
    2. Streak LB (Luria Bertani) des plaques avec une concentration finale de kanamycine de 50 µg/mL et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C. Assurez-vous que les plaques sont à l’envers pour éviter la condensation d’humidité dans les milieux solides contenant la bactérie. Préparer deux plaques pour s’assurer d’avoir une croissance dans au moins une des deux plaques.
    3. Préparer 1 L de LB et autoclave pour le rendre stérile.
    4. Supplément 1 L de milieu LB stérile avec 1 mL de kanamycine (50 mg/mL) et 1 mL de chloramphénicol (34 mg/mL).
    5. Prélever une colonie de chaque plaque à l’aide d’une anse à inoculation jetables pour ensemencer 3 mL de milieu LB contenant la kanamycine et au chloramphénicol.
    6. Place des mini-cultures dans un incubateur à 37 ° C sous agitation constante à 225 tr/min pendant 5-6 h.
    7. Ajouter les mini-cultures au reste de l’original 1 l de médias LB avec Express Autoinduction système 1 pour l’induction de l’expression protéique.
    8. Place de la culture dans le flacon de 2 L, ou plus, dans un incubateur à 37 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 20 à 24 h.
    9. Divisé tubes à centrifuger 4 x 250 mL de la culture de 1 L.
    10. Tournez en bas des tubes contenant de la culture à 3 750 x g pendant 20 min à température ambiante.
    11. Jeter le surnageant et recueillir les pellets bactériennes dans les tubes de centrifugeuse 50 mL, puis congeler à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure. Les pellets qui en résultent ont pesé 3 à 4 g pour un rendement de bonnes protéines.
  2. Préparation de corps d’inclusion
    1. décongeler le culot congelé (3 à 4 g) à 37 ° C pendant quelques minutes.
    2. Geler le diabolo, une fois de plus pendant 10 min à-80 ° C et décongeler à nouveau. Répétez cette étape de gel et dégel deux fois plus.
    3. Resuspendre le culot bactérien dans 1 X réactif de lyse (p. ex. BugBuster Master Mix) par pipetage soigneusement. Utilisez 5 mL du réactif pour 1 g de granulés bactérienne. Assurez-vous de complètement homogénéiser le mélange.
    4. Incuber l’homogénat sur un balancier pendant 20 min à température ambiante.
    5. Centrifuger l’homogénat à 16 000 x g pendant 20 min à température ambiante.
    6. Jetez les surnageants en le versant soigneusement OFF.
    7. Homogénéiser les boulettes dans le même volume de 1 X réactif de lyse tel qu’utilisé dans l’étape précédente.
    8. Incuber l’homogénat pendant 15 minutes sur un rocker à température ambiante.
    9. Ajouter un volume suffisant de 01:10 (0,1 x) réactif de lyse pour obtenir un volume total de l’homogénat de 40 mL. Mix par inversion pour s’assurer d’homogénéiser bien.
    10. Centrifuger l’homogénat à 7 900 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    11. Jeter le surnageant en versant délicatement it.
    12. Resuspendre le culot dans 40 mL de 0,1 x réactif de lyse.
    13. Centrifuger l’homogénat à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    14. Jeter le surnageant soigneusement en le versant et stocker les granulés contenant les corps d’inclusion à-20 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
  3. Purification de protéine
    1. décongeler à température ambiante, les corps d’inclusion.
    2. Dissoudre les corps d’inclusion décongelés dans 14 mL de 8 M guanidine-HCl (chlorhydrate de Guanidine 38 g 0,1 M NaPO 4 pH 8,0 et remplir la suspension avec H 2 O à 50 mL ; ne pas ajuster le pH à la solution finale) à solubiliser les protéines.
    3. Veillez à homogénéiser par pipetage de haut en bas.
    4. Incuber le lysat sur un rocker à température ambiante pendant 50 min.
    5. Préparer 18 g de résine de Ni-NTA perles (18 g pour le granule bactérienne de 3 à 4 g) ; Rincez-les avec 100 mL d’eau à l’aide de vide et un filtre supérieur de bouteille 100 mL 0,22 µm.
      1. Placer le 18 g de perles de résine Ni-NTA en tube de 50 mL et ajouter un volume suffisant de tampon (100 mM phosphate de sodium, 10 mM Tris, pH 8,0, chlorhydrate de guanidine 6 M, pH 8) pour rendre le volume final de dénaturer à 50 mL.
      2. Équilibrer les perles dans le tampon de dénaturation pendant 50 min sur un rocker à température ambiante.
    6. Centrifuger le corps d’inclusion lysat à 16 000 x g pendant 5 min enlever les débris insolubles.
    7. Ajouter le surnageant aux talons équilibrés et jeter les pellets.
    8. Mettre le mélange sur un balancier pendant 40 min à température ambiante pour permettre la liaison aux protéines de résine Ni-NTA.
      Remarque : Perles chélates de Nickel sont utilisés pour purifier les PrP par son affinité de nickel. La région N-terminale de histidine-rich de la PrP restitue l’affinité de nickel (II), qui permet à la protéine lier au nickel ions sans n’importe quelle balise-son.
    9. Des FPLC de lavage avec de l’eau pour nettoyer les deux lignes (A et B).
    10. Exécutez la dénaturation tampon (100 mM phosphate de sodium, 10 mM Tris, pH 8,0, chlorhydrate de guanidine de 6 M, pH 8) par le biais de ces deux lignes (A et B) pour amorcer le système (la colonne n’est pas encore fixée.)
    11. Charger la résine sur la colonne. N’oubliez pas de minimiser les bulles d’air.
    12. Fixer la colonne sur le FPLC et passer un dégradé linéaire de 100 % tampons A la dénaturation et 0 % de repliement tampon B (phosphate de sodium de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8,0) dans un premier temps à 0 % dénaturation tampon et 100 % repliement tampon à la fin. Ce glissement progressif fonctionne à un débit de 0,75 mL/min pendant 240 min et est nécessaire pour le pliage adéquat de la PrP.
      Remarque : Au cours du processus de purification par chromatographie, la PrP dénaturé est tout d’abord lentement replié sur la résine en appliquant un dégradé linéaire de repliement tampon pour remplacer le tampon de dénaturation. Cette étape supprime également la guanidine-HCl chaotropes.
    13. S’assurer que 100 % tampon repliement continue de couler à travers la colonne pendant une 30 min supplémentaire à 0,75 mL/min.
    14. Rinçage ligne A avec de l’eau, suivie de la mémoire tampon d’élution (phosphate de sodium 100 mM, 10 mM Tris, imidazole de 500 mM, pH 5,8) sans passer par la colonne. Cela va nettoyer le tampon de dénaturation qui a été remplacé maintenant par le tampon d’élution dans le système AKTA.
    15. Protéine élution à 2 mL/min en exécutant un dégradé linéaire pendant 40 min à 100 % de repliement tampon B et 0 % tampons d’élution A dans un premier temps à 0 % repliement buffer et 100 % d’élution.
      Remarque : La forte concentration de l’imidazole en mémoire tampon d’élution concourront PrP ' liaison s à du nickel (II). Le sommet de la principale protéine devrait commencer à éluer environ 1/3 de la voie par le gradient.
      1. Regardez le chromatogramme pour OD 280 nm à accroître.
    16. Recueillir seulement les tubes contenant la protéine au centre du grand pic.
      Remarque : Les fractions éluées de 2 mL chacun sont collectées dans des tubes de 15 mL.
    17. Diluer la protéine contenue dans les tubes immédiatement avec environ 1/3 volume (1 mL) de tampon de dialyse (phosphate de sodium 10 mM, pH 5,8).
    18. Placer immédiatement les tubes sur la glace.
    19. Piscine de la protéine éluée contenue dans les tubes.
    20. Pauvre la protéine en dialyse Cassettes (poids moléculaire limite 10 kDa).
    21. Mettre les cassettes dans un tampon de dialyse préalablement réfrigérées (3,6 L) pendant 2 h à 4 ° C, puis transférer les cassettes dans un tampon de dialyse frais (3,6 L) pour la nuit. Faire assurer que le tampon de dialyse est sous agitation constante.
    22. Filtre de protéine après dialyse à travers un filtre de seringue 0,2 µm filtres acrodisc à l’aide d’une seringue.
    23. Mesurer la concentration de la protéine à l’aide d’un kit de dosage de protéines BCA.
    24. Concentré ou diluer si nécessaire d’ajuster la concentration de protéine à 0,3 mg/mL.
      Remarque : Vérifier la pureté par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
    25. Faire 1 ml de protéine dans des microtubes à centrifuger et immédiatement conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure comme décrit dans le protocole RT-QuIC.

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Representative Results

Les extraits de selles CWD établis à 10 % (p/v) ont été en mesure d’amorcer la réaction de RT-QuIC, mais la sensibilité de détection est faible 27. En utilisant une mémoire tampon spécifique pour l’homogénéisation fécale a été une étape essentielle pour éviter la fluorescence de fond élevé en RT-QuIC réactions concomitantes à l’utilisation du substrat PRPR souris plutôt que du PRPR cerf qui a permis d’obtenir plus précis résultats 27. L’addition des précipitations NaPTA réduit la conversion spontanée du PRPR dans RT-QuIC (Figure 1) sans entrave pour l’amplification de l’activité d’ensemencement des réactions (Figure 2). Bien que meilleure amplification a été observée lors de traitement NaPTA, résultant des signaux fluorescents des échantillons de selles CWD-positifs étaient encore faible (Figure 1). En outre, l’amplification de prion de certains échantillons atteint un plateau constant à des niveaux de fluorescence faible. Ceci indique la saturation des réactions, qui peut être due à la dégradation/dénaturation du PRPR ou la formation d’agrégats de hors-sentier qui consomment le PRPR piscine 30. Afin d’améliorer l’amplification des prions et améliorer la sensibilité de détection, une étape de remplacement de substrat a été incorporée dans le protocole. L’introduction de substrat remplaçante au protocole RT-QuIC (Figure 2) augmente la sensibilité (77 % ; 14 des 18 échantillons en RT-QuIC étaient positifs) et la spécificité (100 %, aucun des contrôles négatifs en RT-QuIC positif tourné) de détection (voir 1 table de Cheng et al. 27). Enfin, toutes ces étapes (Figure 3) a conduit à l’optimisation d’un protocole fiable et sensible pour la détection des prions CWD, éprouvette contenant de faibles niveaux d’infectiosité RT-QuIC.

Remplacement de substrat a été introduit après les 25 premières heures de réaction RT-QuIC, par réaction de réapprovisionnement tampon contenant le substrat frais et frais fluorescence teindre Th-T. En introduisant l’étape de remplacement du substrat dans le protocole, le temps de réaction RT-QuIC a été prolongé de 50 h à 75 h. Comme illustré à la Figure 2 avec l’incorporation de remplacement du substrat, une amélioration significative de l’amplification du prion a été observée.

Figure 1
Figure 1 : conversion spontanée réduite du substrat PRPR souris en RT-QuIC ensemencé avec purifiée CWD négatif fécale homogénat. Fécales homogénats de wapiti non infectés (C181-006) ou le cerf mulet ont été homogénéisés dans les fèces extrait du tampon pour obtenir une concentration finale de 10 % (p/v). Pour la purification, ces homogénats les ont été traitées et 10 fois concentrées par précipitation de NaPTA. Les non-purifiés fécales homogénats (un), des formes NaPTA purifié et concentrés (b) dilués comme indiqué servaient à quatre réactions RT-QuIC avec souris PRPR comme substrat des semences. Les axes des ordonnées afficher des unités de fluorescence relatives Th-T, que les x-axes représentent le temps de réaction. Une réduction de conversion spontanée a été vu dans les fèces NaPTA-purifié (b). Données utilisées de Cheng et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Améliorer la détection des prions CWD dans les selles à l’aide de remplacement du substrat. Fécales homogénats de wapitis individuels (C051-05, C052-05) oralement infectées par des prions CWD ont été purifiées et concentrées par précipitation de NaPTA. Imprégnées d’insecticide NaPTA échantillons ont été dilués entre 2 x 10-1 à 2 x 10-3 utilisé pour les réactions RT-QuIC quatre semences avec substrat PRPR souris. Le RT-QuIC test a été réalisé sans remplacement de substrat (une) dans un temps normal de 50 h ou avec l’incorporation de remplacement de substrat pour une période d’incubation prolongée de 75 h (b). Pour ces derniers, remplacement de substrat a été introduit après les 25 premières heures de réaction RT-QuIC. Quatre-vingt-dix pour cent du volume de réaction a été retirés et remplacés par fraîchement préparée RT-QuIC réactionnel contenant le substrat PRPR et Th-T. En introduisant l’étape de remplacement du substrat dans le protocole, le temps de réaction RT-QuIC a été prolongé de 50 h 75 h. données utilisées de Cheng et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : diagramme décrivant la PrPSc fécale extraction de cervidés infectés par le MDC et l’ensemencement amplification activité et prions à l’aide de RT-QuIC dosage. Des échantillons de matières fécales provenant d’animaux infectés par le MDC sont homogénéisés dans une mémoire tampon d’extraction fécale, soumis à la méthode de précipitation NaPTA et analysées par dosage RT-QuIC. Ce dernier a été réalisé en introduisant une étape de remplacement du substrat. L’incorporation de mesures de remplacement NaPTA et substrat a entraîné une réduction de conversion spontanée et amélioration forte amplification activité et prions l’ensemencement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

RT-QuIC travaillait auparavant pour détecter des débris ligneux prions dans l’urine et les selles extraits de cerfs de Virginie et le cerf mulet oralement infecté 38. Le système indiqué dans ce manuscrit est une adaptation de la méthode de l’essai RT-QuIC. Des étapes supplémentaires ont été incorporées dans le test de RT-QuIC « classique » pour améliorer la détection et la sensibilité de l’essai pour prions CWD dans les matières fécales des animaux infectés.

La faible sensibilité de détection dans les matières fécales extraits nous a conduit à l’amélioration du protocole RT-QuIC. Pour atteindre sensibles in vitro la détection des prions dans les fèces, étapes essentielles ont été ajoutés pour la préparation de l’échantillon afin d’éliminer les éléments qui interfèrent avec la conversion de prion et/ou la propagation et améliorent la sensibilité de détection. Incorporant le remplacement de substrat dans le protocole de RT-QuIC et traitement NaPTA/sarkosyl était critique pour la détection des semis d’activité chez le wapiti de CWD-infecté préclinique et clinique et pour renforcer les limites de détection de la conversion de prion dans les extraits de matières fécales .

NaPTA précipitation est une technique courante, généralement accompagnée d’extraction sarkosyl d’isoler et de concentrer les PrPSc à un niveau détectable. NaPTA est connue de préférence précipiter PrPSc sur PrPC 43 sarkosyl est un détergent connu pour faciliter la transformation du prion en faibles concentrations dans un système libre de cellule 44. Conformément à cela, en utilisant une combinaison de NaPTA et sarkosyl pourrait générer un rendement plus élevé des agrégats fibrillaires in vitro , comme le montre avant 45,46,47. Cette méthodologie a été préalablement incorporée RT-QuIC test pour détecter les périphériques CWD prions avec succès dans le spécimen comme purifiée de salive et sang total 39 40. Notre étude fournit la première preuve qu’incorporant NaPTA/sarkosyl purification dans le protocole de préparation des échantillons fécaux permet de détecter de prion DLG par RT-QuIC. Par ailleurs, avec cette méthodologie, nous avons pu réduire la conversion spontanée du PRPR substrat dans des homogénats de selles CWD négatif dans test de RT-QuIC.

Un mécanisme potentiel a été proposé pour expliquer l’effet du substrat remplacement 30. Dans les premiers tours de réaction (avant l’ajout du substrat frais), seulement une petite quantité de graines est ajoutée aux réactions RT-QuIC. Alors que seulement une partie du PRPR est incorporée dans les réactions ensemencées, le reste du substrat puisse soit être épuisé en interagissant avec les parois du puits de plaque de réaction pour former des agrégats non amyloïde ou modifiable d’un formulaire qui est moins enclin à être converti par voir RT-QuIC DED produits plutôt que les graines originales. En conséquence, le taux d’incorporation du PRPR aux graines est lent, et la formation de fibrilles n’est pas détectable dans la phase de latence. Comme les produits de RT-QuIC ensemencés cultivés dans la phase de latence sont enfin allongés pour parvenir à un « stade de montage rapide », prions peuvent être rapidement amplifié par la segmentation par agitation ou latéral ajout de petits agrégats. À ce stade, le substrat frais ajouté à la réaction est facilement incorporé dans les produits ensemencés plutôt que formant des agrégats non spécifiques. L’incorporation de l’étape de remplacement de substrat dans notre protocole est une modification qui augmente la sensibilité ; C’est utile pour détecter les graines du prion dans les échantillons avec une très faible quantité du PrPSc d’animaux pré-cliniques et/ou contenant des composés inhibiteurs.

À l’aide de test RT-QuIC plutôt que PMCA, qui est la première protéine in vitro mauvais repliement test d’amplification décrit 21, présente plusieurs avantages. Dans PMCA, les tubes sont incubés et sonication dans un bain d’eau contenu dans le sonicateur ; les tubes positionnés à la périphérie du sonicateur montrent moins l’efficacité de l’amplification par rapport aux tubes placés dans le centre de 48. Le système RT-QuIC quaking semble être plus facile à contrôler. L’utilisation d’un format 96 puits est un réel avantage de RT-QuIC, cependant, le mb-PMCA développé par Moudjo et al. 49 , 50, a montré des avantages similaires, mais encore moins est utilisé dans PMCA.

Comme substrat, RT-QuIC utilise PRPR recombinant pour la conversion ; en revanche, PMCA plus souvent utilise l’homogénat normal du cerveau. En outre, en RT-QuIC aucune homologie de séquence n’est requis entre les graines et le substrat 51–53.

La présence de cofacteurs est nécessaire pour la réplication de prion dans PMCA et le produit obtenu est contagieuse. Cependant, dans test de RT-QuIC, le PrP amplifié n’est pas infectieuse. Lors d’essais in vitro de l’amplification, la survenue de réactions faussement positives très probablement en raison de la conversion spontanée de la PrPC est un problème récurrent. Par conséquent, le dosage et les conditions utilisées dans cette étude ont été adaptées afin de minimiser ces perturbations afin de maximiser la différence ensemencée PRPR-conversion / conversion spontanée.

En conclusion, le traitement de NaPTA/sarkosyl permet la suppression des inhibiteurs de dosage dans les fèces et réduit la conversion spontanée. Fait intéressant, le traitement n’a pas gêné l’activité semie de precipitatedPrPSc. En outre, la sensibilité de détection a été significativement améliorée lorsque le remplacement de substrat a été adoptée en même temps.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à m. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) pour des formations et le plasmide bactérien expression de cervidés PrP. SG est pris en charge par le programme de la Chaire de recherche du Canada. Nous reconnaissons le financement de cette recherche au SG de Génome Canada, Alberta Prion Research Institute et ministère de l’Agriculture et la foresterie par Génome Alberta et l’Université de Calgary, à l’appui de ce travail. Nous reconnaissons une subvention de recherche de la Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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Numéro 127 Prions immunologie maladie du dépérissement chronique RT-QuIC essai in vitro conversion avec diagnostic détection selles
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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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