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Immunology and Infection

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

Abstract

La técnica de RT-QuIC es una sensibilidad en vitro acelulares priones test de amplificación basado principalmente en el mal plegamiento y agregación de substrato de la proteína (PrP) de prión recombinante usando las semillas del prión como plantilla para la conversión. RT-QuIC es una técnica novedosa de alto rendimiento que es análoga a la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR). Detección de crecimiento de fibrilas amiloides se basa en el colorante tioflavina T, que aparece sobre la interacción específica con proteínas ricas hoja de ᵦ. Así, la formación de amiloide puede detectarse en tiempo real. Hemos intentado desarrollar una prueba de cribado no invasiva confiable para detectar priones de la enfermedad (CWD) emaciación crónica en extracto fecal. Aquí, específicamente hemos adaptado la técnica de RT-QuIC para revelar PrPSc siembra actividad en heces de CWD infectados cérvidos. Inicialmente, la actividad de siembra de los extractos fecales preparamos fue relativamente baja en RT-QuIC, posiblemente debido a potenciales inhibidores de análisis en la materia fecal. Para mejorar la actividad de siembra de los extractos de las heces y eliminar potenciales inhibidores de ensayo, homogeneizaron las muestras fecales en un tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. También hemos presentado las muestras a diferentes metodologías para concentrarse PrPSc en base a la precipitación de la proteína usando sodio ácido fosfotúngstico y la fuerza centrífuga. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC que incluyó el recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección. Así, estableció un protocolo para la detección sensible de priones CWD siembra actividad en heces de cérvidos preclínicos y clínicos por RT-QuIC, que puede ser una herramienta práctica para diagnóstico no invasivo de CWD.

Introduction

Enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Creutzfeldt - Jakob (ECJ) en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos, scrapie en ovejas y cabras y emaciación crónica enfermedad (CWD) en cérvidos 1,2. Las EET se caracterizan por la apariencia espongiforme distintivo y pérdida de neuronas en el cerebro. Según la hipótesis de "sólo proteína", priones están compuestos principalmente de PrPSc ('Sc' para scrapie) 3, una isoforma mal plegada de la proteína priónica celular codificada en host, PrPC. PrPSc resulta de la transformación de PrPC en una conformación enriquecida en hojas de ᵦ 4,5,6 que puede actuar como una semilla para enlazar y convertir otras moléculas de PrPC . Las moléculas de PrPSc recién generadas se incorporan en un crecimiento polímero 7,8 se rompe en pequeños oligómeros, dando por resultado un número mayor de núcleos infecciosos. PrPSc es propensa a la agregación y es parcialmente resistente a proteasas 9,10.

CWD afecta salvajes y cultivados elk (Cervus canadensis), venado bura (Odocoileus hemionus), venado de cola blanca (DMT; Odocoileus virginianus), alces (Alces alces) y renos (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Se considera la enfermedad más contagiosa del prión con transmisión horizontal favorecida por las interacciones de cérvidos y persistencia ambiental de infectividad 14,15. A diferencia de otras enfermedades priónicas en acumulación de PrPSc e infectividad se limitan al cerebro, en CWD estos también se encuentran en tejidos periféricos y fluidos corporales por ejemplo, saliva, orina y heces 16,17, 18.

Inmunohistoquímica se considera el estándar de oro para el diagnóstico CWD detectar PrPSc distribución y espongiforme lesiones 19,20. ELISA y en más raras ocasiones, mancha blanca /negra occidental también se utilizan para el diagnóstico CWD. Así, diagnóstico de enfermedades priónicas actual se basa principalmente en la detección de priones en tejidos post-mortem. El diagnóstico ante mortem para CWD está disponible tomando las amígdalas o biopsias de tejido linfoide asociado a mucosa recto-anal (RAMALT); sin embargo, este procedimiento es invasivo y requiere la captura de los animales. Así, el uso de muestras de fácil acceso, como la orina y las heces, sería una manera práctica para la detección de priones CWD. Sin embargo, esos puerto de excretas relativamente bajas concentraciones de priones por debajo del límite de detección actuales de métodos de diagnóstico. Por lo tanto, es necesaria una más sensible y de alto rendimiento herramienta de diagnóstico. In vitro sistemas de conversión, tales como proteína mal plegamiento de amplificación cíclica del análisis (EPCP) 21, amiloide siembra ensayo y conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC) ensayo 22,23, 24 son herramientas muy poderosas para explotar la capacidad uno mismo-propagación de PrPSc para imitar en vitro el proceso de conversión del prión y así ampliar la presencia de cantidades minuciosas de PrPSc a niveles detectables 25 ,26. El método de RT-QuIC, sin embargo, aprovecha el hecho de que el producto de conversión enriquecido en β-hoja estructura secundaria puede atar específicamente tioflavina T (Th-T). Por lo tanto, PrP recombinante (formará) sobre conversión de semilla crece en las fibrillas amiloideas que Th-T se unen y así se pueden detectar en tiempo real midiendo la fluorescencia del Th-T expresada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) con el tiempo. Una vez controlados, la RFU puede utilizarse para evaluar actividades siembra relativa y parámetros cuantitativos como la fase lag. La fase de retraso representa el tiempo (h) necesario para alcanzar el umbral, durante que formará la conversión en la etapa temprana de la reacción es por debajo del límite de detección de fluorescencia Th-T. Al final de la fase de retraso evidente, concomitante a la formación de un núcleo de amiloide suficiente (carga/alargamiento), ocurre cuando la fluorescencia Th-T supera el nivel umbral y se convierte en positivo. El crecimiento de amiloide fibrillas se pueden detectar en tiempo real y la inicial de PrPSc o siembra actividad contenida en la muestra es amplificado por la segmentación que genera más semillas. Estas semillas a su vez inducen una rápida fase exponencial de crecimiento de la fibra amiloide.

Debido a que este análisis sean capaz de detectar tan bajo como 1 fg de PrPSc 24, la alta sensibilidad califica esta técnica para lograr ante mortem o diagnóstico no invasivo mediante la detección de PrPSc en diversos tejidos periféricos, excretas u otros tipo de muestra que los bajos niveles de infectividad. RT-QuIC definitivamente proporciona ventajas sobre otros ensayos para su reproducibilidad, practicidad, rapidez (menos de 50 h) y bajos costos en comparación a las pruebas biológicas. Evita las complejidades técnicas como sonicación en EPCP; también, se realiza en una microplaca de cinta de sellado que minimiza el riesgo de contaminación de aerosoles de cada pozo. El formato multi-bien permite el análisis de hasta 96 muestras en el mismo experimento. Para contrarrestar el problema recurrente de los falsos positivos y la conversión espontánea de formará en los ensayos de conversión en vitro es muy útil la aplicación de un umbral (corte) en RT-QuIC. De hecho, basándose en los resultados del control negativo (RFU promedio de muestras negativas + 5 SD 27), una línea de base se establece que se puede hacer discriminación entre muestras positivas y negativas. El uso de cuatro repeticiones para cada muestra así puede ayudar a definir una muestra como positiva cuando al menos el 50% de las repeticiones muestran una señal positiva, es decir, cruzar el corte 28. La homología entre la semilla y el substrato no es necesaria en RT-QuIC, como por ejemplo en un estudio anterior, formará hámster fue encontrado ser un sustrato más sensible en comparación con el sustrato homólogo en humanos de PrPECJv sin semillas y scrapie ovino sembrado reacciones 29. oveja hámster quimérica formará también sugirió que un sustrato más adecuado que formará humana para la detección de priones ECJ variante humana 30. Por lo tanto, la utilización de sustratos formará de distintas especies es muy común en este ensayo. Este ensayo se ha aplicado con éxito a varias enfermedades del prión como la esporádica CJD 31,32,33, genenfermedades de prion ETIC 34, EEB 35,36,37, tembladera 23,36y CWD 38,39,40,41, 42. Estudios usando procesan líquido cefalorraquídeo, sangre, saliva y orina como semillas en RT-QuIC todos lograron detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. fomentar la capacidad de detección en muestras de plasma de la sangre que puede contener inhibidores de la formación de amiloide, Orrú et al. (2011) desarrolló una estrategia para eliminar potenciales inhibidores de la formación amiloide peinando PrPSc paso de inmunoprecipitación (IP) y RT-QuIC, llamado "mejorado QuIC" ensayo (eQuIC). Además, un paso de recambio de sustrato se empleó después de ~ 24 h de tiempo de reacción para mejorar la sensibilidad. En última instancia, como solo 1 ag de PrPSc era perceptible por el eQuIC 30.

Con el fin de purificar extractos de las heces y eliminar inhibidores de posible análisis en heces, muestras de heces recogidas en las fases preclínicas y clínicas de alce sobre infección oral experimental se homogeneizaron en tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. Los extractos de las heces más fueron sometidos a diferentes metodologías para PrPSc se concentran en las muestras utilizando la precipitación de la proteína en el ácido (NaPTA) precipitación de sodio fosfotúngstico. El método de precipitación de NaPTA, primero descrito por Safar et al. 43, se usa para PrPSc se concentran en las muestras de prueba. La incubación de NaPTA con la muestra de resultados en la precipitación preferencial de PrPSc en lugar de PrPC. Sin embargo, el mecanismo molecular es todavía incierto. Este paso también ayudó a contener y prevenir la conversión espontánea de formará, que se observa en algunos casos. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC usando ratón formará (aa 23-231) como sustrato y como recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección.

Los resultados aquí demuestran que este método mejorado puede detectar muy bajas concentraciones de priones CWD y aumenta la sensibilidad de detección y especificidad en muestras fecales en comparación con un protocolo sin reemplazo de precipitación y el substrato de NaPTA. Potencialmente, este método puede ser aplicado a otros tejidos y fluidos corporales y puede ser de gran utilidad para la vigilancia de CWD en cérvidos silvestres y en cautiverio.

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Protocol

1. Materia Fecal utilizando RT-QuIC

  1. preparación de heces de cérvidos extractos
    1. hacer fecal homogeneizado mediante la adición de 1 g de material fecal en 10 mL de heces Extraiga el tampón (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF 1 x completan los inhibidores de proteasa, libre de EDTA) para obtener una concentración final del 10% (p/v). El buffer de homogeneización puede ser preparado antes de la utilización y almacenado a -20 ° C.
    2. Homogeneizar pellets fecales (1 g) y el tampón (10 mL) en tubos (p. ej., gentleMACS M) utilizando un disociador con un programa preestablecido por el fabricante para las proteínas durante 1 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos o tres veces hasta que las muestras fecales son completamente homogeneizadas en el buffer de.
    3. Sellar los tubos con parafilm y colocar sobre un agitador oscilante plataforma o rotatorio para una incubación de 1 h a temperatura ambiente.
    4. Centrifugar los tubos a 18.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Recoger el sobrenadante que contiene la proteína extractos y alícuota en mL 1,5 tubos. Pueden conservarse alícuotas a-80 ° C para otras aplicaciones.
  2. Concentración de PrP Sc en heces extractos
    Nota: para concentrar priones CWD en las muestras de extracto de las heces, mejorando la sensibilidad de detección por RT-QuIC, se agrega un paso de precipitación de proteína en el protocolo.
    1. Método de precipitación de NaPTA
    2. Añadir 250 μl de 10% (p/v) de N-lauril sarcosinato (sarkosyl) a 1 mL de proteína fecal extracto para dar una concentración final de sarkosyl de 2% (v/v).
    3. Sellar los tubos que contienen las muestras con parafilm e incuban a 37 ° C durante 30 min, bajo agitación constante a 1.400 rpm en un Termomezcladores.
    4. Ajustar la mezcla de extracto de proteína fecal y sarkosyl con una solución que contenga 10% (w/v) de sodio ácido fosfotúngstico y 170 mM de cloruro de magnesio, pH 7,4 para obtener una concentración final de 0.3% (p/v) sodio ácido fosfotúngstico en las muestras de.
    5. Incubar las muestras a 37 ° C por 2 h con agitación constante a 400 rpm.
    6. Centrifugar las muestras a 14 ° C por 30 min a 15.800 x g. Quitar cuidadosamente los sobrenadantes.
    7. Lavar las pelotillas a resuspender en tampón de lavado (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% sodio desoxicolato (w/v) y 0.1% sarkosyl (w/v)).
    8. Centrifugar las muestras a 14 ° C por 15 min a 15.800 x g. Quitar cuidadosamente los sobrenadantes.
    9. Resuspender el pellet en 100 μl (1/10 del volumen original de la proteína fecal extracto) de tampón de dilución de RT-QuIC.
      Nota: RT-QuIC tampón de dilución (fosfato de sodio 20 mM, pH 6.9, 130 mM de NaCl, 0,1% SDS (p/v) y 1 X N2 suplemento) es preparado antes de la utilización. Un volumen total de 10 mL se filtra a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa y luego almacenado a-20 ° C hasta su uso.
    10. Tienda las NaPTA tratada las muestras a-20 ° C hasta utilizar en análisis RT-QuIC.
  3. Ensayo RT-QuIC
    1. preparar una solución fresca 10 mM Th-T (0,032 g de Th-T en 10 mL de doble destilada H 2 O).
    2. Hacer una dilución de 1:10 del Th-t solución stock en doble destilado de H 2 O el filtro a través de una jeringa acrodisc de 0.2 μm filtro utilizando una jeringa para una concentración final de Th-T de 1 mM.
    3. Descongelar el sustrato PrP (formará, aa 23-231) recombinante mouse (10 μg/mL por reacción RT-QuIC) almacenado a -80 ° C en hielo.
    4. La carga 500 μl de substrato formará en un momento en filtro de exclusión del tamaño kDa 100 microtubos y centrifugar a 14.000 xg por 5 min a temperatura ambiente (un tubo de filtro puede utilizarse hasta dos veces).
    5. Transferencia del sustrato eluído en un tubo estéril de 1.5 mL y guardar a 4 ° C hasta su uso.
    6. Deshielo RT-QuIC tampón de dilución de almacenado a -20 ° C.
      7. Tampón de dilución de
    7. hacer diluciones de la semilla (extracto fecal de proteína) en RT-QuIC:
      Muestra sin diluir: utilizar el extracto fecal de proteína sin diluir
      diluido 2 x 10 -1
      diluido 2 x 10 -2
      diluido 2 x 10 -3
    8. Preparar soluciones para la mezcla de reacción RT-QuIC:
      (solución salina tamponada con fosfato PBS): 5 X
      NaCl: 2 M stock solución de NaCl preparada en doble destilada H 2 O.
      100 mM EDTA: solución de EDTA en doble destilado H 2 O.
    9. Antes de la utilización de las soluciones (paso 1.3.8), filtrar cada solución por separado a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa y mantenerlos estéril a temperatura ambiente.
    10. Preparar un volumen total de mezcla de reacción RT-QuIC según el número de muestras (98 Volumen μl de reacción por muestra y cuatro réplicas por muestra) que se utilizará más el 10% de este volumen para asegurarse de tener suficiente mezcla para todas las reacciones.
      1. Uso un tubo de 15 mL para preparar la mezcla de reacción RT-QuIC (fosfato de sodio 20 mM, pH 6.9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μm Th-T, sustrato de formará de 10 μg/mL y agua bidestilada para ajustar la concentración final formará en la reacción) mediante la acción sol utions.
      2. Mezclar las soluciones bien mediante pipeteo arriba y abajo utilizando una pipeta con una punta de filtro. Evitar tanto como sea posible el uso de vórtice de.
      3. Vierta la mezcla en un depósito de pipetas desechables de 50 mL.
      4. Utilizar una pipeta multicanal para cargar 98 μl de mezcla de reacción RT-QuIC en cada pocillo de una placa de 96 pocillos óptico inferior.
    11. Añadir a cada RT-QuIC reacción 2 μl de aceite puro o extracto de la proteína fecal en serie diluida 10 veces. Cada muestra de prueba en cuatro repeticiones.
      Nota: En cada experimento, diluciones seriadas de muestras fecales (desde sin diluir hasta 2 x 10 -3) de CWD-negativo y verificado de CWD-positivo de animales se utilizan como controles positivos y negativos, respectivamente.
    12. Sellar la placa con una cinta de sellado antes de la incubación en un lector de placas a 42 ° C para 25 h con ciclos repetidos de 1 min doble orbital sacudir (700 rpm) y a 1 minuto de descanso a lo largo de la incubación.
    13. Definir configuración de medidas de fluorescencia:
      Excitación: 450 nm
      emisión: 480 nm
      fondo leer, número de destellos: 20
      ganancia Manual: 1000 (depende de la máquina)
      tiempo de integración: 20 μs
    14. Quite la placa del lector de la placa en el extremo de la h. 25
    15. Girar hacia abajo la placa a 3.000 x g durante 3 min evitar la posible contaminación entre los pozos de.
    16. Retire el sello de la placa de.
    17. Preparar una nueva placa de 96 pocillos, agregar 90 μl de mezcla de reacción RT-QuIC que contiene sustrato fresco y fresco de la fluorescencia del tinte Th-T como se describe en la sección 1.3.1 a 1.3.6.
    18. Transferir 10 μl de cada pocillo de la primera placa a 96 recién preparado de la placa bien.
    19. Sellar la placa de nuevo y continuar el ensayo RT-QuIC h 50 adicionales siguiendo los pasos descritos en el paso 1.3.13. Este paso adicional de 50 h hará que el tiempo de reacción total de 75 h.
      Nota: Todos los procedimientos de ensayo de RT-QuIC se hacen bajo gabinete de bioseguridad.
    20. Recopilar los datos.
      1. Lectura y documento de la señal de fluorescencia Th-T de cada pozo cada 15 min.
      2. Recopilar datos de ciclos total con software de análisis de datos y transferencia a una hoja de cálculo, el promedio de reacciones cuatriplicados.
      3. Parcela los promedios de los datos. El eje x corresponde a la época de la reacción de RT-QuIC (h) y el eje y corresponde a las unidades de fluorescencia relativa (RFU). Cada curva corresponde a una dilución de una muestra conocida.
      4. En cada experimento, demarcar un umbral mediante el cálculo de los valores más altos de la media del control negativo más 5 desviaciones estándar como se describe en corriente publicó literatura 41.
        NOTA: Todas las repeticiones que cruzó el umbral definido son consideradas positivas. Si por lo menos dos de cuatro repeticiones cruzar el umbral, la muestra entonces se considera positiva.

2. Purificación de la proteína de prión recombinante (formará)

  1. crecimiento de la población bacteriana y la expresión de formará
    Nota: la Escherichia coli (e. coli) cepa Rosetta (DE3) transformada con el vector pET-24 codificación la ratón PrP (residuos 23-231) se utiliza para preparar lo formará.
    1. Deshielo stock de glicerol de Rosetta (DE3) transformada con pEt-24 mPrP(23-231) en hielo.
    2. Raya LB (Luria Bertani) placas con una concentración final de 50 μg/mL de kanamicina e incubar durante una noche en una incubadora de 37 ° C. Asegúrese de que las placas estén boca abajo evitar la condensación de humedad en el medio sólido que contiene las bacterias. Preparar dos placas para asegurarse de que tienen un crecimiento de al menos una de las dos placas de.
    3. Preparar 1 L de LB y autoclave para hacer estéril.
    4. Suplemento 1 L de medio LB estéril con 1 mL de kanamicina (50 mg/mL) y 1 mL de cloranfenicol (34 mg/mL).
    5. Elegir una colonia de cada placa mediante el uso de un asa de inoculación desechables para inocular 3 mL de medio LB con kanamicina y cloranfenicol.
    6. Lugar las culturas de mini en una incubadora a 37 ° C con agitación constante a 225 rpm durante 5-6 h.
    7. Añadir las culturas mini al resto de la original 1 l de medio LB junto con Express autoinducción sistema 1 para la inducción de expresión de la proteína.
    8. Lugar de la cultura en matraz de 2 L, o más grande, en una incubadora a 37 ° C con agitación constante a 200 rpm durante 20-24 h.
    9. Divide la cultura 1 L en tubos de centrífuga de 4 x 250 mL.
    10. Girar por los tubos que contienen la cultura a 3.750 x g por 20 min a temperatura ambiente.
    11. Eliminar el sobrenadante y recoger los pellets bacterianos en tubos de centrífuga de 50 mL, luego congelarlas a-80 ° C hasta el procesamiento posterior. Los pellets resultantes han pesado 3 a 4 g para un rendimiento de proteína buena.
  2. Preparación de cuerpo de inclusión
    1. descongelar los pellets congelados (3 a 4 g) a 37 ° C durante pocos minutos.
    2. Congelar el sedimento una vez más por 10 min a-80 ° C y descongelar otra vez. Repita este paso de congelación y descongelación dos veces más.
    3. Resuspender el precipitado bacteriano de 1 X reactivo de lisis (e.g. BugBuster Master Mix) transfiriendo bien. Usar 5 mL del reactivo de 1 g de pellet bacteriano. Asegúrese de homogeneizar completamente la mezcla de.
    4. Incubar el homogeneizado en un eje de balancín por 20 min a temperatura ambiente.
    5. Centrifugar el homogeneizado a 16.000 x g por 20 min a temperatura ambiente.
    6. Descartar los sobrenadantes por cuidadosamente verter apagado
    7. Homogeneizar las pelotillas en el mismo volumen de 1 X reactivo de lisis en el paso anterior.
    8. Incubar el homogeneizado por 15 min en un eje de balancín a temperatura ambiente.
    9. Añadir un volumen suficiente de 1:10 (0.1 x) reactivo de lisis para obtener un volumen total de homogeneizado de 40 mL. Mezcla por inversión para asegurarse de que homogeneizar bien.
    10. Centrifugar el homogeneizado a 7.900 x g durante 15 min a 4 ° C.
    11. Eliminar el sobrenadante, vertiendo cuidadosamente lo
    12. Resuspender el pellet en 40 mL de 0.1 x reactivo de lisis.
    13. Centrifugar el homogeneizado a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    14. Descartar el sobrenadante cuidadosamente por verterlo y almacenar el pellet que contiene los cuerpos de inclusión a-20 ° C hasta el procesamiento más.
  3. Purificación de proteínas
    1. descongelar los cuerpos de inclusión a temperatura ambiente.
    2. Disolver los cuerpos de inclusión descongelados en 14 mL de 8 M guanidina-HCl (clorhidrato de la guanidina 38 g en 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 y llenar la suspensión con H 2 O a 50 mL; no ajustar el pH en la solución final) para solubilizar proteínas de.
    3. No se olvide de homogeneizar bien transfiriendo hacia arriba y hacia abajo.
    4. Incubar el lisado en un eje de balancín a temperatura ambiente durante 50 min.
    5. Preparar 18 g de resina de Ni-NTA (18 g para pellet bacteriano 3 a 4 g) de granos, enjuagar con 100 mL de agua utilizando vacío y un filtro superior botella de 100 mL 0,22 μm.
      1. 18 g de granos de la resina de Ni-NTA en tubo de 50 mL y añadir un volumen suficiente de desnaturalización buffer (100 mM fosfato de sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, el clorhidrato de guanidina de 6 M, pH 8) para el volumen final hasta 50 mL.
      2. Equilibrar las cuentas en el búfer de desnaturalización durante 50 minutos en un eje de balancín a temperatura ambiente.
    6. El cuerpo de inclusión lisado a 16.000 x g durante 5 min eliminar los desechos insolubles de centrífuga.
    7. Añadir el sobrenadante a las cuentas equilibradas y deseche los pellets.
    8. Poner la mezcla en un eje de balancín de 40 min a temperatura ambiente para permitir la Unión a proteínas a resina de Ni-NTA.
      Nota: Cuentas quelato de níquel se utilizan para purificar el PrP por su afinidad de níquel. La región del N-terminal rica en histidina de PrP representa la afinidad de níquel (II), que permite que la proteína a se unen a los iones sin cualquier su-etiqueta de níquel.
    9. FPLC de lavado con agua para limpiar ambas líneas (A y B).
    10. Ejecutar desnaturalización buffer (100 mM fosfato de sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, el clorhidrato de guanidina de 6 M, pH 8) a través de dos líneas (A y B) para cebar el sistema (no se adjunta la columna).
    11. Cargar la resina en la columna. Asegúrese de minimizar las burbujas de aire.
    12. Coloque la columna en el FPLC y ejecute un degradado lineal desde 100% buffer A la desnaturalización y 0% de repliegue tampón B (fosfato de sodio 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) en primera desnaturalización buffer de 0% y 100% refolding búfer al final. Este cambio gradual se ejecuta con un caudal de 0,75 mL/min durante 240 min y es necesario para el correcto plegamiento de PrP.
      Nota: Durante el proceso de purificación cromatográfica, el PrP desnaturalizado es primero lentamente replegado en la resina mediante la aplicación de un degradado lineal de repliegue tampón para reemplazar el búfer de desnaturalización. Este paso también elimina la caotrópico guanidina-HCl.
    13. Asegúrese de que buffer repliegue 100% continúa fluyendo a través de la columna por un adicional 30 min a 0,75 mL/min.
    14. Enjuague línea con agua seguido de tampón de elución (fosfato del sodio de 100 mM, 10 mM Tris, imidazol de 500 mM, pH 5.8) pasando por alto la columna. Esto limpiará hacia fuera el búfer de desnaturalización que ha sido sustituido ahora por el tampón de elución en el sistema AKTA.
    15. Elute proteína a 2 mL/min mediante la ejecución de un degradado lineal para 40 minutos 100% refolding de tampón B y tampón de elución de 0% al principio a 0% refolding tampón y tampón de elución de 100%.
      Nota: La alta concentración de imidazol en tampón de elución competirán PrP ' Unión de s al níquel (II). El pico de primaria debe comenzar a fin de eluir aproximadamente 1/3 a través de la gradiente.
      1. Ver cromatograma para OD 280 nm aumentar.
    16. Recoger sólo los tubos que contienen la proteína en el centro de la cima grande.
      Nota: Se recogen las fracciones eluídas de 2 mL en tubos de 15 mL.
    17. Diluir la proteína contenida en los tubos inmediatamente con 1/3 volumen (1 mL) de tampón de diálisis (fosfato de sodio 10 mM, pH 5.8).
    18. Inmediatamente Coloque los tubos en hielo.
    19. La proteína eluída contenida en los tubos de la piscina.
    20. Pobre la proteína en Cassettes de diálisis (peso molecular de corte 10 kDa).
    21. Poner los cassettes en buffer de diálisis previamente enfriada (3,6 L) por 2 h a 4 ° C, luego transfiera los casetes en un buffer de diálisis fresca (3,6 L) para pasar la noche. Hacer seguro que es el buffer de diálisis bajo agitación constante.
    22. Filtro de proteína después de diálisis a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa de.
    23. Medir la concentración de proteína usando un kit de análisis de proteína BCA.
    24. Concentrado o diluir si es necesario ajustar la concentración de proteína a 0,3 mg/mL.
      Nota: Confirmar pureza por SDS-PAGE y el azul de Coomassie tinción.
    25. Hacer alícuotas de 1 mL de proteína en tubos de microcentrífuga y almacenar inmediatamente a-80 ° C hasta su uso posterior como se describe en el protocolo de RT-QuIC.

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Representative Results

Los extractos fecales CWD preparados al 10% (p/v) fueron capaces de reacción RT-QuIC de la semilla, sin embargo, la sensibilidad de detección fue de baja 27. Utiliza un búfer específico de homogeneización fecal fue un paso crítico para evitar la fluorescencia del fondo alto en reacciones de RT-QuIC concomitantes al uso de sustrato de ratón formará más que formará de ciervos que permitió obtener más resultados de 27. La adición de NaPTA precipitación redujo la conversión espontánea de formará en RT-QuIC (figura 1) sin inhibir la amplificación de la actividad de siembra de las reacciones (figura 2). Aunque se observó amplificación mejor sobre el tratamiento de NaPTA, resultante de las señales de fluorescencia de muestras fecales positivas CWD eran todavía bajo (figura 1). Además, la amplificación del prión de algunas muestras alcanzaron una meseta constante en los niveles bajos de la fluorescencia. Esto indica que la saturación de las reacciones, que puede ser debido a la degradación/desnaturalización de formará o la formación de agregados fuera de camino que consume la piscina formará del 30. Para mejorar la amplificación de los priones y mejorar la sensibilidad de detección, un paso de recambio de sustrato fue incorporado en el protocolo. La introducción de recambio de sustrato en el protocolo de RT-QuIC (figura 2) aumento de la sensibilidad (77%; 14 de 18 muestras en RT-QuIC fueron positivas) y especificidad (100%, ninguno de los controles negativo en RT-QuIC positivo dado vuelta) de la detección (véase Tabla 1 de Cheng et al. 27). por último, todos estos pasos (figura 3) condujeron a la optimización de un protocolo confiable y sensible para RT-QuIC detección de priones CWD, utilizando muestras que contienen bajos niveles de infectividad.

Recambio de sustrato fue introducido después de las 25 h de reacción RT-QuIC, por reposición de reacción tampón que contiene sustrato fresco y fresco de la fluorescencia del tinte Th-T. Introduciendo el paso de recambio de sustrato en el protocolo, el tiempo de reacción RT-QuIC era extendido de 50 h 75 h. Como se muestra en la figura 2 con la incorporación de sustitución del sustrato, se observó una mejoría significativa de la amplificación del prión.

Figure 1
Figura 1: conversión espontánea reducida de sustrato de ratón formará en RT-QuIC sembradas con purificada CWD-negativa fecal homogenado. Fecales homogenados del elk no infectado (C181-006) o venado bura se homogeneizaron en heces extracto buffer para obtener una concentración final de 10% (p/v). Para la purificación, estos fecales homogenados fueron procesados y 10 - veces concentrados por precipitación de NaPTA. El fecales homogenados (un), formas de NaPTA purificada y concentradas (b) diluidas como se indica se utilizaron para reacciones de RT-QuIC cuatriplicadas con ratón formará como sustrato de la semilla. Los ejes muestran unidades de fluorescencia relativas de to-T que las Axes representan el tiempo de reacción. Una reducción de la conversión espontánea fue considerada en muestras fecales de NaPTA purificada (b). Datos utilizados de Cheng et al. 27. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Mejorada la detección de priones CWD en heces mediante la sustitución de sustrato. Fecales homogenados del elk individuales (C051-05, C052-05) por vía oral infectadas con priones CWD purificados y concentrados por precipitación de NaPTA. NaPTA tratadas las muestras se diluyeron entre 2 x 10-1 a 2 x 10-3 utilizado para reacciones de RT-QuIC cuatriplicadas semilla con sustrato de ratón formará. Se realizó el ensayo RT-QuIC sin recambio de sustrato (a) en un período regular de 50 h o con la incorporación de sustitución de sustrato para un período de incubación prolongado de 75 h (b). Para este último, recambio de sustrato fue introducido después de las 25 h de reacción RT-QuIC. Noventa por ciento del volumen de reacción fue quitado y substituido por la mezcla de reacción RT-QuIC recién preparada que contienen sustrato formará y Th-T. Introduciendo el paso de recambio de sustrato en el protocolo, el tiempo de reacción RT-QuIC era extendido de 50 h a h. 75 datos de Cheng et al. 27. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama de flujo describiendo PrPSc fecal extracción de cérvidos CWD-infectados y sembrador de la amplificación de la actividad y del prión utilizando RT-QuIC análisis. Muestras de heces de animales infectados con CWD son homogeneizadas en un tampón de extracción fecal, sometidas al método de precipitación de NaPTA y probadas por análisis de RT-QuIC. El último se realizó mediante la introducción de un paso de recambio de sustrato. La incorporación de medidas de reemplazo NaPTA y sustrato resultó en una reducción de la conversión espontánea y fuerte mejora en el sembrador de amplificación de actividad y del prión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

RT-QuIC fue empleada previamente para detectar priones CWD en orina y fecales extractos de venado cola blanca y venado bura oral infectada 38. El sistema que se muestra en este manuscrito es un método adaptado del ensayo RT-QuIC. Pasos adicionales se incorporaron en el ensayo de RT-QuIC "clásico" para mejorar la detección y la sensibilidad del ensayo de priones CWD en materia fecal de animales infectados.

La baja sensibilidad de la detección en extractos de las heces nos llevó a la mejora del Protocolo de RT-QuIC. Para lograr sensibilidad en vitro detección de priones en las heces, pasos críticos fueron agregados para preparación de muestras con el fin de eliminar los componentes que interfieren con la conversión del prión o propagación y mejoran la sensibilidad de detección. Incorporación de sustitución del sustrato en el protocolo de RT-QuIC y NaPTA/sarkosyl tratamiento fue crítica para detectar actividad siembra en elk infectados CWD preclínicos y clínicos y para mejorar los límites de detección de la conversión de priones en los extractos de las heces .

Precipitación de NaPTA es una técnica común suele acompañada de extracción sarkosyl para aislar y concentrar el PrPSc a un nivel detectable. NaPTA es conocido preferiblemente precipitar PrPSc sobre PrPC 43 sarkosyl es un detergente conocido para facilitar la conversión del prión con bajas concentraciones en una célula sistema gratis 44. En línea con esto, usando una combinación de NaPTA y sarkosyl puede generar un rendimiento superior de agregados fibrilares en vitro como mostramos antes de 45,46,47. Esta metodología ha sido incorporada previamente en el ensayo de RT-QuIC para detectar priones CWD periféricos con éxito en muestras como la saliva purificada 39 y sangre entera 40. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia que incorporación de NaPTA/sarkosyl purificación en el protocolo de preparación de la muestra fecal permite la detección de priones CWD por RT-QuIC. Además, con esta metodología hemos sido capaces de reducir la conversión espontánea de sustrato formará en homogenados fecal CWD-negativo en el ensayo de RT-QuIC.

Se ha propuesto un mecanismo potencial para explicar el efecto de substrato recambio 30. En las primeras rondas de reacción (antes de la adición del substrato fresco), sólo una pequeña cantidad de semillas se agrega a las reacciones de RT-QuIC. Mientras que solamente una porción de formará se incorpora en las reacciones de cabeza de serie, el resto del sustrato puede ser usado por interactuando con las paredes de los pozos de la placa de reacción para formar agregados de amiloide no o modificarse a la forma que es menos propensa a ser convertido por ver RT-QuIC DED productos en lugar de las semillas originales. Como resultado, la tasa de incorporación de formará a las semillas es lenta y la formación de fibrilas no es detectable en la fase de retraso. Como los productos RT-QuIC sembrados en la fase de retraso finalmente son alargados para llegar a una "etapa de montaje rápido", los priones pueden ser rápidamente amplificado por segmentación a través de la agitación o lateral además de agregados más pequeños. En esta etapa, el sustrato fresco añadido a la reacción se incorpora fácilmente en los productos sembrados en lugar de formando agregados inespecíficas. La incorporación del paso de recambio de sustrato en nuestro protocolo fue una modificación que aumento de la sensibilidad; fue útil para detectar las semillas del prión en las muestras con una cantidad muy baja de PrPSc de animales preclínicos o compuestos inhibitorios que contiene.

Usando análisis de RT-QuIC en lugar de EPCP, que es la primera en vitro la proteína mal plegamiento test de amplificación descritas 21, tiene varias ventajas. El EPCP los tubos son incubados y sonicó en un baño de agua contenido en el sonicador; los tubos colocados en la periferia del sonicador muestran menos eficacia de la amplificación en comparación con los tubos colocados en el centro 48. El sistema RT-QuIC temblando parece ser más fácil de controlar. El uso de un formato bien 96 es una ventaja real de RT-QuIC, sin embargo, el EPCP mb desarrollado por Moudjo et al. 49 , 50, mostró beneficios similares pero todavía es menos utilizado en el EPCP.

Como substrato, RT-QuIC utiliza formará recombinante para la conversión; en contraste, el EPCP en la mayoría de los casos utiliza homogeneizado de cerebro normal. Además, en RT-QuIC ninguna homología de secuencia es necesaria entre semilla y substrato 51–53.

La presencia de cofactores es necesaria para la replicación del prión en el EPCP y el producto resultante es contagioso. Sin embargo, en análisis RT-QuIC, amplificado PrP no es infeccioso. En ensayos de amplificación en vitro la ocurrencia de reacciones falsas positivas probablemente debido a la conversión espontánea de PrPC es un problema recurrente. Por lo tanto, el ensayo y las condiciones utilizadas en este estudio fueron adaptadas para reducir al mínimo tales disturbios para maximizar la diferencia entre conversión de formará semillas y espontánea.

En conclusión, el tratamiento NaPTA/sarkosyl permite eliminación de inhibidores de ensayo en las heces y reduce la conversión espontánea. Curiosamente, el tratamiento no dificultan actividad siembra de precipitatedPrPSc. Además, la sensibilidad de detección mejoró significativamente al recambio de sustrato concomitante fue adoptado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos agradecidos con el Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para la formación y el plásmido de expresión bacteriana de PrP de cérvidos. SG es apoyado por el programa de la Cátedra de investigación de Canadá. Reconocemos que la financiación para esta investigación a SG de genoma Canadá, Alberta del prión Instituto de investigación y agricultura de Alberta y forestal a través de genoma Alberta y la Universidad de Calgary en apoyo de esta labor. Reconocemos una beca de investigación de la Margaret Gunn Foundation para la investigación Animal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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Inmunología número 127 priones enfermedad debilitante crónica RT-QuIC ensayo de conversión en vitro diagnóstico detección heces
En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal
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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. … More

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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