Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Realtid skakande-inducerad konvertering analys för detektion av CWD prioner i fekalt Material

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva en enkel, snabb och effektiv prion amplifiering, konverteringsmetoden realtid skakande-inducerad (RT-SN).

Abstract

RT-QuIC tekniken är en känslig i vitro cellfria prion förstärkning analys baserat främst på seedade Skellefteåsjukan och aggregering av rekombinant prion protein (PrP) substrat med prion frön som en mall för konvertering. RT-QuIC är ny hög genomströmning teknik som är jämförbar med realtid polymeraskedjereaktion (PCR). Påvisande av amyloid fibrill tillväxt bygger på färgämnet Tioflavin T, som fluorescerar vid särskild interaktion med ᵦ ark rika proteiner. Således, amyloid bildas kan upptäckas i realtid. Vi försökte utveckla en tillförlitlig noninvasiv screeningtest för att påvisa kroniskt avmagrade sjukdom (CWD) prioner i fekal extrakt. Här har vi specifikt anpassat RT-QuIC tekniken för att avslöja PrPSc sådd aktivitet i avföring från CWD infekterade hjortdjur. Inledningsvis var aktiviteten sådd av fekal extrakten vi beredda relativt låg i RT-sn, möjligen på grund av potentiella assay inhibitorer av fekalt material. För att förbättra sådd aktivitet av avföring extrakt och ta bort potentiella assay inhibitorer, homogeniserad vi fekal proverna i en buffert som innehåller rengöringsmedel och proteashämmare. Vi lämnade också olika metoder att koncentrera PrPSc på grundval av protein nederbörd med natrium phosphotungstic syra och centrifugalkraften proverna. Slutligen, extrakt av avföring testades av optimerad RT-QuIC som inkluderade substrat ersättare i protokollet till förbättra känsligheten för upptäckt. Således etablerat vi ett protokoll för känslig detektion av CWD prion sådd aktivitet i avföring från prekliniska och kliniska hjortdjur av RT-sn, vilket kan vara ett praktiskt verktyg för icke-invasiv CWD diagnos.

Introduction

Prionsjukdomar eller transmissibel spongiform encefalopati (TSE) är neurodegenerativa sjukdomar inklusive Creutzfeldt - Jakobs sjukdom (CJS) hos människor, bovin spongiform encefalopati (BSE) hos nötkreatur, skrapie hos får och getter, och chronic wasting disease sjukdom (CWD) hos hjortdjur 1,2. TSE är kännetecknas av särskiljande spongiform utseende och förlust av nervceller i hjärnan. Enligt ”endast protein” hypotesen består prioner huvudsakligen av PrPSc ('Sc' för skrapie) 3, ett felveckning isoformen av värd-kodade cellulära prionproteinet, PrPC. PrPSc resultat från omvandling av PrPC till en konformation berikad i ᵦ-ark 4,5,6 som kan fungera som ett frö att binda och konvertera andra PrPC molekyler. De nyligen genererade PrPSc -molekylerna införlivas i en växande polymer 7,8 som bryter sig in mindre oligomerer, vilket resulterar i högre nummer av infektiös atomkärnor. PrPSc är benägna att aggregering och är delvis resistenta mot proteaser 9,10.

CWD påverkar vild och odlad älg (Cervus canadensis), mule deer (Odocoileus hemionus), vitsvanshjort (WTD; Odocoileus virginianus), älgen (Alces alces) och renar (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Är det den mest smittsamma prion sjukdomen med horisontell överföring gynnas av hjortdjur interaktioner och miljömässiga persistens av smittsamhet 14,15. Till skillnad från andra prionsjukdomar där PrPSc ackumulering och smittsamhet är begränsade till hjärnan, i CWD finns dessa också i perifera vävnader och kroppsvätskor t.ex. saliv, urin och avföring 16,17, 18.

Immunhistokemi anses vara den gyllene standarden för CWD diagnos att upptäcka PrPSc distribution och spongiform lesioner 19,20. ELISA och i mer sällsynta fall, western blot används också för CWD diagnostik. Således, nuvarande prion sjukdomsdiagnos baseras huvudsakligen på att upptäcka prioner i postmortala vävnader. Ante-mortem-diagnos för CWD är tillgänglig genom att ta tonsiller eller recto-anal slemhinna-associerade lymfoida vävnad (RAMALT) biopsier; men proceduren är invasiv och kräver avskiljning av djuren. Således, användning av lättillgänglig prover, såsom urin och avföring, vore ett praktiskt sätt för CWD prion upptäckt. Dock dessa exkrementer harbor relativt låga koncentrationer av prioner under detektionsgränsen av nuvarande diagnostiska metoder. Följaktligen krävs det en mer känslig och hög genomströmning diagnostiskt verktyg. In vitro konvertering system, såsom protein Skellefteåsjukan cykliska förstärkning assay (PMCA) 21, amyloid sådd assay och realtid skakande-inducerad konvertering (RT-QuIC) assay 22,23, 24 är mycket kraftfulla verktyg att utnyttja PrPSc egenföretagare föröknings förmåga att härma i vitro prion konverteringsprocessen och därmed förstärka närvaron av minuten mängder PrPSc till detekterbara halter 25 ,26. RT-QuIC metoden, men tar fördel av det faktum att produktens omvandlingen berikad i β-ark sekundärt strukturera specifikt kan binda Tioflavin T (Th-T). Därför växer rekombinant PrP (rPrP) vid seedade konvertering till amyloida fibriller som binder Th-T och därmed kan upptäckas i realtid genom att mäta fluorescensen av Th-T uttryckt som relativa fluorescens enheter (RFU) över tid. När övervakas, kan RFUEN användas för att utvärdera relativ sådd aktiviteter och kvantitativa parametrar såsom fasen eftersläpning. Den eftersläpning fasen representerar den tid (h) som krävs för att nå tröskeln, under vilka rPrP konvertering i det tidiga skedet av reaktionen understiger detektionsgränsen för Th-T fluorescens. I slutet av fasen uppenbar eftersläpning, samtidig till bildandet av en tillräcklig amyloid kärna (kärnbildning/töjning), uppstår när Th-T fluorescensen överskrider tröskelvärdet och blir positiva. Tillväxten av amyloida fibriller kan upptäckas i realtid och inledande PrPSc eller sådd aktivitet som ingår i urvalet förstärks genom segmentering som genererar mer frön. Dessa frön inducerar i sin tur en snabb exponentiell fas av amyloid fiber tillväxt.

Eftersom denna analys är köpa duktig upptäcka så lågt som 1 fg PrPSc 24, hög känslighet kvalificerar denna teknik för att uppnå slakt eller icke-invasiv diagnostik genom att upptäcka PrPSc i olika perifera vävnader, exkrementer eller andra typer av preparatet härbärgerat låga nivåer av smittsamhet. RT-QuIC ger definitivt fördelar över andra analyser för dess reproducerbarhet, funktionalitet, snabbhet (mindre än 50 h) och låga kostnader jämfört med bioassays. Man undviker de tekniska komplexitet som ultraljudsbehandling används i PMCA; också, det utförs i en tape-förseglade mikroplattan vilket minimerar risken för aerosol förorening av varje brunn. Flera format möjliggör analys av upp till 96 prover i samma experiment. För att motverka det återkommande problemet med falska positiva och spontan konvertering av rPrP i in vitro- konvertering analyserna är genomförandet av ett tröskelvärde (cut-off) i RT-QuIC mycket användbar. Faktiskt, baserat på resultaten av den negativa kontrollen (genomsnittliga RFU negativa prover + 5 SD 27), en originalplan ställs in som diskriminering mellan positiva och negativa prover kan göras. Användningen av fyra replikat för varje prov kan därmed bidra till att definiera ett prov som positiv när minst 50% av replikerar visar en positiv signal, över dvs cut-off 28. Homologi mellan utsäde och substrat krävs inte i RT-sn, som t.ex. i en tidigare studie, hamster rPrP konstaterades att vara mer känsliga substrat jämfört med homologa substratet i mänskliga PrPvCJD seedade och fåren skrapie seedade reaktioner 29. hamster-får chimära rPrP föreslogs också för att vara ett mer lämpade substrat än mänsklig rPrP att upptäcka mänsklig variant CJD prioner 30. Således, användning av rPrP substrat från olika arter är mycket vanliga i denna analys. Denna analys har framgångsrikt tillämpats flera prionsjukdomar, såsom sporadisk CJD 31,32,33, genEtic prion sjukdomar 34, BSE 35,36,37, skrapie 23,36och CWD 38,39,40,41, 42. Studier med bearbetade cerebrospinalvätska, helblod, saliv och urin som frön i RT-QuIC var alla framgångsrika att upptäcka PrPSc 38,39,40,41, 42. att främja förmågan att detektera i prover såsom blod plasma som kan innehålla hämmare av amyloid bildas, Orrú et al. (2011) utvecklat en strategi för att ta bort potentiella inhibitorer av amyloid bildas genom kamning PrPSc immunoprecipitation (IP) steg och RT-QuIC, heter ”enhanced QuIC” assay (eQuIC). Dessutom anställdes ett substrat ersättning steg efter ~ 24 h av reaktionstid för att förbättra känsligheten. Slutligen, som låg som 1 ag av PrPSc var upptäckas av eQuIC 30.

För att rena avföring extrakt och ta bort eventuella assay-hämmare i avföring, var fecal prov som samlats i prekliniska och kliniska stadier från älg vid experimentell oral infektion homogeniserad i buffert som innehåller rengöringsmedel och proteashämmare. Extrakt av avföring lämnades vidare till olika metoder för att koncentrera PrPSc i de prover som utnyttjar protein nederbörd via natrium phosphotungstic syra (NaPTA) nederbörd. Metoden NaPTA nederbörd, först beskrevs av Safar o.a. 43, används för att koncentrera PrPSc i proverna. Inkubering av NaPTA med provet resulterar i förmånliga utfällning av PrPSc i stället för PrPC. Den molekylära mekanismen är dock fortfarande oklart. Detta steg också hjälpt innehållande och förhindra spontan konvertering av rPrP, som kan observeras i vissa fall. Slutligen, extrakt av avföring testades av optimerad RT-QuIC använder mus rPrP (aa 23-231) som substrat och inklusive substrat ersättare i protokollet att förbättra känsligheten för upptäckt.

Resultatet här Visa att denna förbättrade metod kan upptäcka mycket låga koncentrationer av CWD prioner och ökar känsligheten för upptäckt och specificitet i fecal prov jämfört med ett protokoll utan NaPTA nederbörd och substrat byte. Denna metod potentiellt kan tillämpas på andra vävnader och kroppsvätskor och kan vara till stor nytta för CWD övervakning i vilda och fångenskap hjortdjur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. RT-QuIC använder fekalt Material

  1. beredning av hjortdjur avföring extrakt
    1. göra fekal Homogenatet genom att lägga 1 g av fekalt material till 10 mL av avföring extrahera buffert (20 mM natriumfosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 1 mM PMSF och 1 x komplett proteashämmare, EDTA-fria) att ge en slutlig koncentration på 10% (w/v). Den homogenisering buffert kan förberedas före användning och lagras vid -20 ° C.
    2. Homogenize fekal pellets (1 g) och buffert (10 mL) i rör (t.ex. gentleMACS M rör) med en dissociator med ett förinställt program från tillverkaren för proteiner för 1 min i rumstemperatur. Upprepa detta två till tre gånger tills de fecal proverna är helt homogeniseras i bufferten.
    3. Täta rören med parafilm och placera dem på en gungande plattform eller rotary shaker för en 1 h inkubation vid rumstemperatur.
    4. Centrifugera rören vid 18.000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
    5. Samla supernatanterna som innehåller proteinet extrakt och alikvotens dem i 1,5 mL rör. Alikvoter kan lagras vid-80 ° C för ytterligare tillämpningar.
  2. Koncentration av PrP Sc i avföring extrakt
    Obs: för att koncentrera CWD prioner i avföring extrakt prover, därigenom förbättra känsligheten för upptäckt av RT-sn, ett protein nederbörd steg läggs till protokollet.
    1. NaPTA nederbörd metoden
    2. lägger till 250 µL 10% (w/v) av N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) till 1 mL fekal protein extrakt för att ge en slutlig koncentration av sarkosyl 2% (v/v).
    3. Täta rören som innehåller proverna med parafilm och inkubera vid 37 ° C i 30 min under ständig skakning vid 1400 rpm i en thermomixer.
    4. Justeras mixen av fekal protein extrakt och sarkosyl med en stamlösning som innehållande 10% (w/v) natrium phosphotungstic syra och 170 mM av magnesiumklorid, pH 7,4 att erhålla en slutlig koncentration av 0,3% (w/v) natrium phosphotungstic syra i urvalen.
    5. Inkubera vid 37 ° C i 2 h proverna under ständig skakning vid 400 rpm.
    6. Centrifugera proverna vid 14 ° C 30 min på 15.800 x g. bort supernatanterna noggrant.
    7. Tvätta pellets genom omblandning dem i tvättbuffert (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% natrium deoxicholat (w/v) och 0,1% sarkosyl (w/v)).
    8. Centrifugera proverna vid 14 ° C 15 min på 15.800 x g. bort supernatanterna noggrant.
    9. Återsuspendera pellets i 100 µL (1/10 av den ursprungliga volymen av proteinet fekal utdrag) RT-QuIC förtunningsbuffert.
      Obs: RT-QuIC förtunningsbuffert (20 mM natriumfosfat, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) och 1 X N2 tillägg) är beredd före användningen. En total volym på 10 mL filtreras genom ett 0,2 µm acrodisc spruta filter med hjälp av en spruta och sedan lagras vid-20 ° C fram till användning.
    10. Lagra de NaPTA behandlade proverna vid-20 ° C tills utnyttja dem i RT-QuIC assay.
  3. RT-QuIC assay
    1. förbereda färska 10 mM Th-T stamlösning (0,032 g Th-t i 10 mL dubbel destillerat H 2 O).
    2. Göra en utspädning av 1:10 av Th-T stamlösning i dubbel destillerat H 2 O för att göra en slutlig koncentration av Th-T 1 mm filtret det genom en 0,2 µm acrodisc spruta filtrera med hjälp av en spruta.
    3. Tina mus rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL per RT-QuIC reaktion) lagras vid -80 ° C på ice.
    4. Belastning 500 µL av rPrP substrat i taget in 100 kDa storlek utslagning filter mikrorör och centrifugera vid 14 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur (en tube/filter kan användas upp till två gånger).
    5. Överför den eluerade substraten till en steril 1,5 mL tub och hålla det vid 4 ° C fram till användning.
    6. Tina RT-QuIC förtunningsbuffert lagras vid -20 ° C.
    7. Göra spädningar av utsäde (fekal protein utdrag) i RT-QuIC förtunningsbuffert:
      Outspädd prov: använda fekal protein extraktet outspädd
      utspädd 2 x 10 -1
      utspädd 2 x 10 -2
      utspädd 2 x 10 -3
    8. förbereda stamlösningar för RT-QuIC reaktionsblandningen:
      fosfatbuffrad saltlösning ( PBS): 5 X
      NaCl: 2 M stamlösning av NaCl som förberett i dubbel destillerat H 2 O.
      EDTA: 100 mM stamlösning av EDTA som förberett i dubbel destillerat H 2 O.
    9. Före utnyttjande av alla lösningar (steg 1.3.8), filtrera varje lösning separat genom ett 0,2 µm acrodisc spruta filter med hjälp av en spruta och hålla dem sterila rumstemperatur.
    10. Förbereder en total volym på RT-QuIC reaktionsblandningen enligt antalet prover (98 µL volym av reaktion per prov och fyra replikat per prov) användas plus 10% av denna volym för att se till att ha tillräckligt blandning för alla reaktioner.
      1. Använd en 15 mL tub att förbereda RT-QuIC reaktionsblandningen (20 mM natriumfosfat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP substrat och dubbel destillerat vatten att justera rPrP slutliga koncentration i reaktionen) använder lager sol lutionerna.
      2. Blanda alla lösningar väl genom pipettering upp och ner med hjälp av en pipett med filter spets. Så mycket som möjligt undvika användning av vortex.
      3. Häll blandningen i en 50 mL disponibla pipettering reservoar.
      4. Använda en flerkanalspipett Ladda 98 µL av RT-QuIC reaktionsblandningen till varje brunn av en 96 brunnar optiska bottenplatta.
    11. Lägga till varje RT-QuIC reaktion 2 µL av outspädd eller 10-faldig seriellt utspädda fekal protein extrakt. Varje prov i fyra replikat.
      Obs: I varje experiment seriespädningar av fecal prov (alltifrån outspädd till 2 x 10 -3) från CWD-negativa och verifierade CWD-positiva djur används som negativa och positiva kontroller, respektive.
    12. Tätning plattan med en förseglingstejpen innan ruvning i en spektrofotometer vid 42 ° C i 25 h upprepade cykler av 1 min dubbel orbital skakar (700 rpm) och 1 min vila hela ruvningen.
    13. Definiera fluorescens mätningsinställningar:
      Excitation: 450 nm
      utsläpp: 480 nm
      botten läsa, antalet blinkningar: 20
      manuell gain: 1000 (beror på maskinen)
      Integration tid: 20 µs
    14. avlägsna plattan från plattan läsaren i slutet av de 25 h.
    15. Snurra ner plattan på 3 000 x g i 3 min att undvika potentiella föroreningar mellan brunnarna.
    16. Ta bort förseglingen från plattan.
    17. Förbereder en ny plattan med 96 brunnar genom att lägga till 90 µL av RT-QuIC reaktionsblandningen som innehåller färskt substrat och färska fluorescens färga Th-T som beskrivs i avsnitt 1.3.1 att 1.3.6.
    18. Överföra 10 µL från varje brunn av första plattan till den nyligen beredda 96 väl tallrik.
    19. Tätning nya plattan och fortsätta RT-QuIC analysen för ytterligare 50 h följande stegen som beskrivs i steg 1.3.13. Detta ytterligare steg 50 h kommer göra sammanlagda reaktionstiden för 75 h.
      Obs: Alla förfaranden av RT-QuIC analys görs under biosäkerhet skåp.
    20. Samla in data.
      1. Läs och dokument Th-T fluorescens signalen från varje brunn var 15 min.
      2. Samla in data av totala cykler med dataanalys programvara och överföring i ett kalkylblad med genomsnittet av quadruplicate reaktioner.
      3. Rita genomsnitten av data. X-axeln motsvarar reaktionstiden för RT-SN (h) och y-axeln motsvarar relativa fluorescens enheter (RFU). Varje kurva motsvarar en utspädning av en känd provet.
      4. i varje experiment, avgränsa en tröskel genom att beräkna de högsta medelvärdena för den negativa kontrollen plus 5 standardavvikelser som beskrivs i aktuella publicerad litteratur 41.
        OBS: Alla replikat som korsade det definierade tröskelvärdet anses positivt. Om minst två av fyra replikat över tröskeln, provet då betraktas positivt.

2. Rening av rekombinant prionproteinet (rPrP)

  1. tillväxt av bakteriell materiel och uttryck för rPrP
    Obs: den Escherichia coli (E. coli) stam Rosetta (DE3) omvandlas med vektor pET-24 kodning av mus PrP (rester 23-231) användes för beredning av rPrP.
    1. Tina glycerol lager av Rosetta (DE3) omvandlas med pEt-24 mPrP(23-231) på ice.
    2. Strimma LB (Luria Bertani) plattor med en slutlig koncentration på 50 µg/mL kanamycin och inkubera över natten i en 37 ° C inkubator. Kontrollera att plattorna är upp och ner att undvika fuktighet kondens i solid media som innehåller bakterier. Förbered två plattor för att se till att ha tillväxt i minst en av de två plattorna.
    3. Förbereda 1 L i LB och autoklav att göra det sterila.
    4. Tillägg 1 L sterila LB medier med 1 mL kanamycin (50 mg/mL) och 1 mL av kloramfenikol (34 mg/mL).
    5. Plocka en koloni av varje platta med en disponibel inympning slinga för att Inokulera 3 mL LB medium innehållande kanamycin och kloramfenikol.
    6. Plats de mini-kulturerna i en inkubator vid 37 ° C under ständig skakning på 225 rpm för 5-6 h.
    7. Lägga till mini-kulturerna i resten av den ursprungliga 1 l av LB media tillsammans med Express autoinduktion System 1 för induktion av proteinuttryck.
    8. Plats kulturen i 2 L kolv, eller större, i en inkubator vid 37 ° C under ständig skakning på 200 rpm för 20-24 h.
    9. Dela 1 L kulturen i 4 x 250 mL centrifugrör.
    10. Snurra ner rören som innehåller kultur vid 3750 x g i 20 min i rumstemperatur.
    11. Avlägsna supernatanten och samla bakteriell pellets i 50 mL centrifugrör och sedan frysa dem vid-80 ° C tills vidare bearbetning. De resulterande pelletarna har vägde 3 till 4 g för en bra protein avkastning.
  2. Beredning av inkludering kroppen
    1. Tina den frysta pelleten (3 till 4 g) vid 37 ° C i några minuter.
    2. Frysa pelleten en gång i 10 min vid-80 ° C och Tina igen. Upprepa detta steg av frysning och upptining två gånger.
    3. Återsuspendera bakteriell pelleten i 1 X lysis reagens (t.ex. BugBuster Master Mix) av pipettering grundligt. Använd 5 mL av reagens för 1 g bakteriell pellet. Se till att helt homogenisera blandningen.
    4. Inkubera Homogenatet på en rocker i 20 min i rumstemperatur.
    5. Centrifugera Homogenatet vid 16 000 x g i 20 min i rumstemperatur.
    6. Kassera supernatanterna genom att försiktigt hälla det utlöses.
    7. Homogenisera pellets i samma volym av 1 X lysis reagens som används i föregående steg.
    8. Inkubera Homogenatet för 15 min på en rocker rumstemperatur.
    9. Lägga till en tillräcklig volym 1:10 (0,1 x) att få en total Homogenatet volym 40 ml reagens på Lys. Blanda genom inversion att se till att homogenisera väl.
    10. Centrifugera Homogenatet vid 7900 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
    11. Tag bort supernatanten genom att försiktigt hälla den.
    12. Återsuspendera pelleten i 40 mL 0,1 x lysis reagens.
    13. Centrifugera Homogenatet vid 16 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
    14. Avlägsna supernatanten noga genom att hälla det och lagra den pellets som innehåller inkludering organ vid-20 ° C tills vidare bearbetning.
  3. Protein rening
    1. Tina inkludering organ rumstemperatur.
    2. Upplösa de tinade inkludering organ i 14 mL 8 M guanidin-HCl (38 g guanidin hydroklorid i 0,1 M NaPO 4 pH 8,0 och fylla fjädringen med H 2 O till 50 mL; justera inte pH vid slutlig lösning) till solubilize proteiner.
    3. Se till att homogenisera väl genom pipettering upp och ner.
    4. Inkubera den lysate på en rocker i rumstemperatur under 50 min.
    5. Förbereda 18 g Ni-NTA harts pärlor (18 g för 3 till 4 g bakteriell pellet); skölj dem med 100 mL vatten med hjälp av vakuum och ett 100 mL 0,22 µm flaska övre filter.
      1. Placera den 18 g Ni-NTA harts pärlor i 50 mL tub och tillsätt tillräcklig volym denaturera buffert (100 mM natriumfosfat, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidin hydroklorid, pH 8) för att göra den slutliga volymen upp till 50 mL.
      2. Jämvikta pärlorna i denatureringen bufferten för 50 min på en rocker rumstemperatur.
    6. Centrifugera inkludering kroppen lysate vid 16 000 x g i 5 min att avlägsna olösliga skräp.
    7. Lägg till supernatanten skakad pärlorna och kassera pellets.
    8. Pålagt en rocker för 40 min i rumstemperatur att tillåta proteinbindning till Ni-NTA harts mixen.
      Obs: Nickel kelat pärlor används att rena PrP av dess nickel affinitet. Histidin-rika N-terminala regionen PrP återger affinitet till nickel(II), vilket gör proteinet att binda till nickel joner utan någon his-tag.
    9. Tvätta FPLC med vatten att rensa ut båda linjerna (A och B).
    10. Kör denatureringen buffert (100 mM natriumfosfat, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidin hydroklorid, pH 8) genom båda linjer (A och B) att prime systemet (kolumnen är ännu inte bifogas.)
    11. Ladda kådan på kolumnen. Se till att minimera luftbubblor.
    12. Tillmäter FPLC kolumnen och kör en linjär övertoning från 100% denatureringen buffert A och 0% av vika buffert B (100 mM natriumfosfat, 10 mM Tris, pH 8,0) först till 0% denatureringen buffert och 100% vika buffert i slutet. Denna gradvisa förändring drivs med en flödeshastighet av 0,75 mL/min för 240 min och behövs för korrekt vikning av PrP.
      Obs: Under reningsprocessen kromatografisk denaturerat lösenordsreplikeringsprincipen är först långsamt refolded på kådan genom att tillämpa en linjär gradient av vika buffert att ersätta denatureringen bufferten. Detta steg tar också bort chaotropic guanidin-HCl.
    13. Se till 100% vika buffert fortsätter att flöda genom kolumnen för en ytterligare 30 min på 0,75 mL/min.
    14. Skölj linje A med vatten följt av eluering buffert (100 mM natriumfosfat, 10 mM Tris, 500 mM Imidazol, pH 5.8) förbi kolumnen. Detta kommer att rensa ut denatureringen bufferten som nu har ersatts av eluering bufferten i systemet AKTA.
    15. Elute protein 2 mL/min genom att köra en linjär övertoning för 40 min från 100% vika buffert B och 0% eluering buffert A först till 0% vika buffert och 100% eluering buffert.
      Obs: Den höga koncentrationen av Imidazol i eluering bufferten kommer att tävla PrP ' s bindning till nickel(II). Den primära protein toppen bör börja eluera ca 1/3 av vägen genom övertoningen.
      1. Titta på kromatogrammet för OD 280 nm att öka.
    16. Samla endast rören som innehåller proteinet i mitten av den stora toppen.
      Obs: De eluerade fraktionerna av 2 mL varje samlas i 15 mL tuber.
    17. Späda proteinet som finns i rören omedelbart med ca 1/3 volym (1 mL) av dialys buffert (10 mM natriumfosfat, pH 5.8).
    18. Placera omedelbart rören på ice.
    19. Pool eluerade proteinet som finns i rören.
    20. Dålig proteinet i dialys kassetter (molekylvikt cut-off 10 kDa).
    21. Sätta kassetter i förväg kylda dialys buffert (3,6 L) för 2 h vid 4 ° C och sedan överföra kassetter i en färsk dialys buffert (3,6 L) för övernattning. Göra till att dialys bufferten är under ständig omskakning.
    22. Filtrera protein efter dialys genom ett 0,2 µm acrodisc spruta filter med hjälp av en spruta.
    23. Mätning av protein koncentrationen använder en BCA protein analyssats.
    24. Koncentrat eller späd vid behov att justera proteinkoncentration till 0,3 mg/mL.
      Obs: Bekräfta renhet av SDS-PAGE och Coomassie blå färgning.
    25. Gör 1 mL portioner av protein i mikrocentrifugrör och omedelbart förvaras vid-80 ° C tills vidare användning som beskrivs i protokollet RT-SN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Extrakt av CWD-fekal beredd på 10% (w/v) kunde utsäde RT-QuIC reaktion, men känsligheten för upptäckt var låg 27. Använda en viss buffert för fekal homogenisering var ett viktigt steg för att undvika hög bakgrund fluorescens i RT-QuIC reaktioner samtidig användning av mus rPrP substrat snarare än rådjur rPrP som tillät för att få mer specifika resultat 27. Tillägg av NaPTA nederbörd minskad spontan konvertering av rPrP i RT-SN (figur 1) utan att hämma amplifiering av aktiviteten sådd av reaktionerna (figur 2). Även bättre förstärkning observerades vid NaPTA behandling, var resulterande fluorescensen signaler av CWD-positiv fekal prover fortfarande låg (figur 1). Dessutom nått prion förstärkning av några prover en konstant platå på låg fluorescens nivåer. Detta indikerar reaktioner, vilket kan bero på den nedbrytning/denaturering av rPrP eller bildandet av off-pathway aggregat som konsumerar de rPrP pool 30mättnad. För att ytterligare förbättra förstärkning av prioner och öka känsligheten för upptäckt, införlivades ett substrat ersättning steg i protokollet. Införandet av substrat ersättare till RT-QuIC protokollet (figur 2) ökade känsligheten (77%; 14 av 18 prover i RT-QuIC var positiva) och specificitet (100%, ingen av de negativa kontrollerna i RT-QuIC vände positiva) upptäckt (se Tabell 1 från Cheng et al. 27). Slutligen alla dessa steg (figur 3) ledde till optimering av en pålitlig och känsliga protokoll för RT-QuIC upptäckt av CWD prioner, använda preparatet som innehåller låga halter av smittsamhet.

Substratet ersättare infördes efter de första 25 h i RT-QuIC reaktion, av replenishing reaktion buffert som innehåller färskt substrat och färska fluorescens färga Th-T. Genom att införa det substrat byte steget i protokollet, utökades RT-QuIC reaktionstiden från 50 h till 75 h. Som visas i figur 2 med inkorporeringen av substrat ersättare, observerades en signifikant förbättring av prion förstärkning.

Figure 1
Figur 1: minskad spontan konvertering av mus rPrP substrat i RT-QuIC ympats med renat CWD-negativ fecal Homogenatet. Fekal homogenates av icke-infekterade älg (C181-006) eller mule deer var homogeniserad i avföring extrakt buffert att erhålla en slutlig koncentration på 10% (w/v). För rening, var dessa fekal homogenates bearbetas och 10 - gånger koncentrerade vid NaPTA nederbörd. De orenat fekal homogenates (en), NaPTA-renas och koncentrerade former (b) efter utspädning enligt användes till utsäde quadruplicate RT-QuIC reaktioner med musen rPrP som substrat. Y visar relativa Th-T fluorescens enheter, x-axes skildra reaktionstiden. En minskning av spontan konverteringar sågs i NaPTA-renat fecal prov (b). Data som används från Cheng et al. 27. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Förbättrad detektion av CWD prioner i avföring använder substrat ersättare. Fekal homogenates av enskilda elk (C051-05, C052-05) oralt infekterade med CWD prioner var renat och koncentrerad genom NaPTA nederbörd. NaPTA-behandlade prover späddes mellan 2 x 10-1 till 2 x 10-3 används till utsäde quadruplicate RT-QuIC reaktioner med musen rPrP substrat. RT-QuIC analysen utfördes utan substrat byte (en) i en vanlig period av 50 h eller med inkorporeringen av substrat ersättning för en utökad inkubationstid på 75 h (b). För de senare substrat ersättare infördes efter de första 25 h i RT-QuIC reaktion. Nittio procent av volymen reaktion var avlägsnas och ersättas med nylagade RT-QuIC reaktionsblandningen innehållande rPrP substrat och Th-T. Genom att införa det substrat byte steget i protokollet, utökades RT-QuIC reaktionstiden från 50 h till 75 h. Data används från Cheng et al. 27. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödesschema som beskriver PrPSc fekal utvinning från CWD-infekterade hjortdjur och seedning aktivitet och prion förstärkning med RT-QuIC assay. Fecal prov från CWD-infekterade djur homogeniseras i en fekal utvinning buffert, överlämnas till NaPTA nederbörd metod och testats av RT-QuIC assay. Den senare utfördes genom att införa ett substrat ersättning steg. Införlivandet av NaPTA och substrat ersättning steg resulterade i en minskning av spontan konvertering och stark förbättring i sådd aktivitet och prion förstärkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RT-QuIC var tidigare anställd att upptäcka CWD prioner i urin och fekal extrakt av oralt infekterade vitsvanshjort och mule deer 38. Det system som visas i detta manuskript är en anpassad metod för RT-QuIC analysen. Ytterligare steg inkorporerades i den ”klassiska” RT-QuIC assay att förbättra upptäckten och känsligheten i analysen för CWD prioner i fekalt material av smittade djur.

Den låga känsligheten för upptäckt i avföring extrakt ledde oss till förbättring av RT-QuIC protokollet. För att uppnå känsliga in vitro- detektion av prioner i avföring, tillfogades kritiska steg för provberedning för att ta bort komponenter som störa prion konvertering och/eller spridning och öka känsligheten för upptäckt. Införliva substrat byte i protokollet av RT-SN och NaPTA/sarkosyl behandling var kritiskt för att upptäcka sådd aktivitet i prekliniska och kliniska CWD-infekterade älg, och för att förbättra detektionsgränserna för prion konvertering i avföring extrakt .

NaPTA nederbörd är en vanlig teknik brukar åtföljas av sarkosyl utvinning att isolera och koncentrera PrPSc till en detekterbar nivå. NaPTA är kända för att företrädesvis fällningen PrPSc över PrPC 43 medan sarkosyl är ett rengöringsmedel som är kända för att underlätta prion konvertering vid låga koncentrationer i en cell gratis system 44. I linje med detta, kan använda en kombination av NaPTA och sarkosyl generera en högre avkastning av fibrillar aggregat i vitro som visas innan 45,46,47. Denna metod har införlivats tidigare i RT-QuIC assay att upptäcka perifera CWD prioner framgångsrikt i prov som renat saliv 39 och helblod 40. Vår studie ger första bevis att införliva NaPTA/sarkosyl rening i protokollet av fekal provberedning möjliggör CWD prion detektering av RT-SN. Dessutom med denna metod kunde vi minska spontan konvertering av rPrP substrat i CWD-negativ fecal homogenates i RT-QuIC assay.

En potentiell mekanism har föreslagits att förklara effekten av substrat ersättning 30. I de första omgångarna av reaktion (före tillsats av färskt substrat) läggs endast en liten mängd frön till RT-QuIC reaktioner. Medan endast en del av rPrP inkorporeras i de seedade reaktionerna, resten av substratet kan användas antingen genom att interagera med väggarna i reaktionsbrunnarna platta form icke-amyloid aggregat eller ändras till en form som är mindre benägna att omvandlas genom se DED RT-QuIC produkter i stället för de ursprungliga fröna. Som ett resultat, iblandningen av rPrP att fröna är långsam och fibrill bildandet är inte spåras i fasen eftersläpning. Som seedade RT-QuIC produkterna odlas i fasen eftersläpning är slutligen avlånga för att nå en ”snabb montering steg”, kan prioner vara förstärkt snabbt genom segmentering genom skakning eller laterala tillägg av mindre aggregat. I detta skede, är färskt substrat tillsätts reaktionen lätt införlivas de seedade produkter snarare än bildar ospecifikt aggregat. Inkorporeringen av substrat ersättning steg i vårt protokoll var en modifikation som ökad känslighet; Det var nyttigt att upptäcka prioner frön i prover med en mycket låg mängd PrPSc från prekliniska djur eller innehållande hämmande föreningar.

Med RT-QuIC analys i stället för PMCA, som är den första i vitro protein Skellefteåsjukan förstärkning assay beskrivs 21, har flera fördelar. I PMCA rören inkuberas och sonicated i ett vattenbad som finns inom den någon sonikator; rören placeras i utkanten av den någon sonikator visar mindre effekt av förstärkning jämfört med rören placeras i centrum 48. Den RT-QuIC system skakande verkar vara lättare att kontrollera. Användningen av en 96 väl format är en verklig fördel av RT-sn, dock den mb-PMCA som utvecklats av Moudjo et al. 49 , 50, visade liknande förmåner men fortfarande används mindre i PMCA.

Som substrat använder RT-QuIC rekombinant rPrP för omvändelse; däremot använder PMCA i de flesta fall hjärnans normala Homogenatet. Dessutom i RT-QuIC krävs ingen sekvenshomologi mellan utsäde och substrat 51–53.

Förekomsten av kofaktorer är nödvändigt för prion replikering i PMCA och den resulterande produkten är smittsam. Dock i RT-QuIC assay smittar den förstärkta PrP inte. I in vitro- amplifiering analyser är förekomsten av falska positiva reaktioner troligen på grund av spontan konvertering av PrPC ett återkommande problem. Därför, den analysen och villkor som används i denna studie var anpassade för att minimera sådana störningar för att maximera skillnaden mellan seedade rPrP-konvertering och spontan konvertering.

Avslutningsvis NaPTA/sarkosyl behandling möjliggör borttagning av assay-hämmare i avföring och minskar spontan konvertering. Intressant behandling inte hindra sådd aktiviteten av precipitatedPrPSc. Dessutom förbättrades avsevärt känsligheten för upptäckt när substratet ersättare antogs samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) för att tillhandahålla utbildning och hjortdjur PrP bakteriell uttryck Plasmiden. SG stöds av programmet Kanada forskning stol. Vi erkänner att finansiering för denna forskning till SG från genomet Kanada, Alberta Prion Research Institute och Alberta jordbruk och skogsbruk genom genomet Alberta och University of Calgary till stöd för detta arbete. Vi erkänner ett forskningsanslag från Margaret Gunn Foundation för djur forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

Immunologi problemet 127 prioner kroniskt avmagrade sjukdom RT-sn in vitro- konvertering assay diagnos upptäckt avföring
Realtid skakande-inducerad konvertering analys för detektion av CWD prioner i fekalt Material
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. … More

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter