Summary
Цель настоящего Протокола заключается в специально тег и выборочно изолировать вирусной ДНК от инфицированных клеток для характеризации вирусного генома связанных белков.
Abstract
Целью настоящего Протокола является изолировать вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) ДНК от инфицированных клеток для идентификации связанных вирусных и клеточных белков, Массовое спектрометрирование. Хотя белки, которые взаимодействуют с вирусных геномов играют важную роль в определении результатов инфекции, всесторонний анализ вирусного генома связанных белков нецелесообразно ранее. Здесь мы показываем, метод, который позволяет прямое очистки геномов HSV-1 от инфицированных клеток. Репликации вирусных ДНК выборочно помечены модифицированных нуклеотидов, которые содержат алкины функциональной группы. Приклеенные этикетку ДНК затем специально и необратимо маркирован через ковалентных вложение биотина азид через меди (I)-катализатором реакции циклоприсоединения или нажмите азид алкины. Биотин тегами ДНК очищается на стрептавидина покрытием бусины и связанные протеины этого eluted и определены по масс-спектрометрии. Этот метод позволяет избирательного отношения и изоляции HSV-1 репликации вилки или весь геном из сложных биологических сред. Кроме того адаптации этого подхода позволит для расследования различных аспектов герпетический инфекции, а также изучение геномов других ДНК вирусов.
Introduction
Вирусы имеют ограниченные возможности для выполнения основных функций и поэтому зависят от факторов хост для облегчения критических аспектов инфекции, включая экспрессии вирусных генов, репликации, ремонт, рекомбинации и транспорта. Деятельность этих факторов хост часто дополнены вирусно закодированные белков. Кроме того вирусы должны избежать обнаружения и вмешательства, клеточных реакций к вирусной инфекции. Таким образом вирус хост взаимодействия диктовать результаты инфекции. Первостепенное значение является понимание того, как вирусы изменяют клеточной среды адаптировать клеточными для облегчения вирусных процессов. Особый интерес является определение, какие факторы и процессы действуют на вирусных геномов инфекционных цикла.
Вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) — двойной многожильный ДНК вируса, который заражает значительную долю населения. В течение первого часа инфекции вирусного генома проникает в ядро, где упорядоченный Каскад экспрессии вирусных генов наступает в координации с вирусной репликации ДНК (vDNA)1. В ядре геномы подлежат эпигеномные регулирование, пройти ремонт и рекомбинации и упакованы в capsids, таким образом, что первый вирионы потомства производятся в течение менее шести часов. Всеобъемлющую оценку вирусного генома связанных белков на протяжении инфекции заложит основу для изучения молекулярных детали процессов, которые действуют на вирусных геномов и даст понимание вирусных и клеточные факторы участвуют в различных стадиях инфекции.
Предыдущие методы расследования принимающей факторов в вирусной инфекции включают очищение сродства вирусных белков для анализа связанных клеточных белков2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. Эти анализы сыграли для выявления клеточных факторов в принимающих противовирусное ответы, а также модификация вирусный хроматина, экспрессии генов, и ремонт ДНК. Однако трудно определить ли взаимодействия зависят от ассоциации с vDNA, и протеомики только обеспечить понимание взаимодействия, которые происходят в зависимости от конкретного вирусного фактор. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был использован для определения, где конкретные вирусных и клеточных белков связывать вирусных геномов10,11,12,13,14 , 15 и флуоресцентной гибридизации in situ (рыбы) в сочетании с immunocytochemistry позволило визуализации клеточных факторов, которые colocalize с vDNA16,,1718, 19 , 20. Эти анализы позволяют для пространственного и временнóго анализа. Однако ограничения включают потребность в весьма специфических антител, ограниченной чувствительности и потребность в предыдущих понимание взаимодействия узла вирус. Поэтому мы разработали метод, основанный на iPOND (изоляция белков на зарождающейся ДНК)21 и22 aniPOND (ускоренное родной iPOND) избирательно этикетки и очистить vDNA от инфицированных клеток для объективной идентификации вирусного генома связанные белки по масс-спектрометрии. iPOND играет важную роль для исследования динамики вилка сотовой репликации.
Для выборочной очистки вирусных геномов от инфицированных клеток тиражирование vDNA помечены ethynyl изменение нуклеозидов, 5-ethynyl-2´ дезоксиуридина (EdU) или 5-ethynyl-2´ Дезоксицитидин (EdC) (рис. 1), следуют ковалентных Спряжение биотина азид через нажмите химии для облегчения очистки одного шага вирусных геномов и связанных белков на четках стрептавидина покрытием (рис. 2B). Важно отметить, что инфекции осуществляется в стационарных клетках, которые не участвуют в клеточном репликации ДНК для включения конкретных маркировки vDNA. Кроме того инфекции HSV-1 вызывает арест клеточного цикла и подавляет клеточной ДНК репликации23,-24. Вирус может быть prelabeled до инфекции для анализа белков, связанные с входящей вирусных геномов (рис. 1A) или помечены в ходе репликации ДНК для анализа белков, связанные с недавно синтезированных vDNA (рис. 1B) 25. Кроме того, пульс Чейз анализ может использоваться для изучения природы белков, связанные с вирусной репликации вилки (рис. 1 c)26. Кроме того изменение ethynyl vDNA можно ковалентно конъюгированных к Флюорофор для пространственного исследования динамики белков (рисунок 2A и рис. 3). Изображений позволяет для прямого визуализации vDNA и представляет собой бесплатный подход для проверки vDNA белковых взаимодействий и может быть адаптирована для отслеживания вирусных геномов течение инфекции. Мы ожидаем, что эти подходы далее может быть изменена для изучения любого аспекта герпетический инфекции, включая задержку и оживление и изучить другие ДНК вирусов. Кроме того маркировки с уридина 5-ethynyl (ЕС) может позволить для анализа РНК вирусных геномов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. культуру клеток, вирусные инфекции и EdC маркировки ( рис. 1)
следующий протокол включает в себя работу с вирусами. Обратитесь к вашим учреждением ' s био безопасности протоколов относительно безопасного обращения вирусов и других биологических агентов. Этот протокол был одобрен институциональных Наблюдательный Совет Университета Питтсбурга.
- Trypsinize колбу культуры ткани вырожденная 150 см 2 МРК-5 клеток и передачи клетки к пластине культуры ткани 2 600 см, содержащие 100 мл DMEM плюс 10% FBS. Инкубируйте при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 для 3-4 дней, чтобы достичь confluency и стационарной фазы. Вырожденная 600 см блюдо 2 содержит ~ 7 x 10 7 клеток. Подготовка 1 пластина для каждого условия и 1 пластина для каждого соответствующего элемента управления негативные.
Примечание: Клетки должны достичь стационарной фазы для ингибирования клеточной репликации ДНК обеспечить, что только vDNA помечены и очищенный в последующих шагах.
Примечание: Каждый образец требует бесплатные без маркировки отрицательного контроля, подготовленных с использованием же инфекции условия и момент времени без добавления EdC.
Примечание: A сократили версии этого эксперимента должны осуществляться в тандеме, чтобы проверить для маркировки клеточной ДНК, изображений, используя сопоставимые клеточный рост, инфекции, EdC маркировки условия и времени точки (см. шаг 2). - 7 х 10 8 PFU HSV-1 в 7 мл разбавляют холодной Tris-Buffered солевой (TBS). Удалите средство роста и хранить при температуре 37 ° C. Заразить, добавьте 7 мл разбавленной вирус MRC-5 клеток и рок за 1 ч при комнатной температуре. После адсорбции удалите посевным материалом, смойте комнатной температуре 50 мл TBS и заменить оригинальный среднего роста. Инкубируйте при 37 ° C в присутствии 5% CO 2. Этот шаг должен осуществляться для каждой экспериментальной состояния и отрицательного контроля.
Примечание: Увеличение EdC маркировки можно добиться, используя HSV-1 мутантов дефектных для экспрессии вирусных dUTPase (UL50 ген) и/или урацила glycosylase (UL2 гена). HSV-1 dUTPase имеет низкий субстратная специфичность и может уменьшить активации нескольких Нуклеозидные аналоги 25 ,- 27. - Label вирусных геномов с EdC. Следуйте инструкциям на этикетке входящих геномов (1.3.1.), репликация геномов (1.3.2.), или вирусной репликации вилки (1.3.3.).
Примечание: Только шаг 1.3.3, 1.3.1 и 1.3.2 должна осуществляться в зависимости от ли входящие геномов, реплицируемых геномов или репликации вилки должны быть проанализированы в последующие шаги, соответственно.
Примечание: EdU или f Ара EdU можно заменить EdC. Токсичность аналогов нуклеозидов должны контролироваться и свести к минимуму. Prelabeled- использования запасов для выполнения инфекции в 1.2 шаг и перейдите к шагу 2 или 3 в течение 4 ч после инфекции (hpi) расследовать нереплицированные vDNA ( рис. 1A).
Примечание: Подготовка prelabeled вирус запасов, используя ранее описанные протокол 25. Запасы вирус должен быть передан через столбец G-25 для удаления любых остаточных EdC. - Этикетка репликации vDNA путем добавления 5-25 мкм EdC носитель культуры клеток зараженных клеток для 2-4 ч ( рис. 1B). Перед добавлением, разбавить EdC в 1 мл среднего роста.
- Для обозначения вилок вирусной репликации, после начала репликации vDNA (≥ 4 hpi), пульс метка репликации vDNA с 5-25 мкм EdC для 5-20 мин. Погони, 3 x промыть Чейз среде, содержащей 25-100 мкм 2´deoxycytidine (deoxyC) и затем инкубировать присутствии Чейз среднего для дополнительных 20-40 мин ( рис. 1 c).
Примечание: Пульс и Чейз среднего должно быть достижение равновесного уровня до 37 ° C и 5% CO 2 перед использованием.
Примечание: Для импульса Чейз экспериментов, важно рассмотреть количество времени, необходимое для нуклеозидов войти в камеру и быть фосфорилированных прежде, чем они могут быть включены в репликации ДНК. Это должно быть определено эпирически.
Примечание: Чтобы определить резолюции пульс Чейз экспериментов, Рассчитайте уровень вирусной репликации в экспериментальных условиях используется. Это может быть определено путем количественного PCR вирусных геномов в течение одного шага роста времени курс 26.
Примечание: Для изображений вирусных геномов перейдите к шагу 2 и для очистки вирусных геномов, перейдите к шагу 3.
- использования запасов для выполнения инфекции в 1.2 шаг и перейдите к шагу 2 или 3 в течение 4 ч после инфекции (hpi) расследовать нереплицированные vDNA ( рис. 1A).
2. Визуализация EdC помечены ДНК ( рисунок 2A)
Примечание: это полезно для выполнения визуализации в тандеме с методом очистки вирусного генома для проверки, что клеточной ДНК не обозначена в экспериментах. Изображения также может использоваться для визуализации характер помечены vDNA и для проверки данных протеомики. На рисунке 3 показаны примеры сотовой и вирусной ДНК, окрашивание узоры.
- Проводят инфекций и EdC маркировки, как указано в шаге 1, за исключением использования сократили условия на coverslips в 12-ну тканевые культуры блюдо, содержащие 1 мл среднего роста.
- Исправление клетки с 3,7% 1 мл параформальдегида в однократном ПБС 15 мин на RT. После фиксации, промойте клетки 2 x с 1 мл 3% BSA в PBS.
Предупреждение: Параформальдегида может привести к серьезным травмам или к постоянным. Выполните меры предосторожности.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и coverslips можно хранить при 4 ° C во время второй стирки на срок до 3 дней. - Разрушения клеток с 1 мл permeabilization буфера [см. Таблицу материалы] 20 мин при комнатной температуре во время раскачивания.
- Промыть с 1 мл раствора БСА 3%, а затем блок с 1 мл 3% BSA в PBS на 30 минут при комнатной температуре во время раскачивания.
- Добавить 1 мл коктейль реакции нажмите [см. Таблицу материалы] coverslips ковалентно конъюгат Alexa Fluor 488 азид для EdC пометил ДНК. Инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин при качания. Аспирационная и промыть два раза с 1 мл раствора PBS.
- Пятно клеточной ДНК с 1 мл раствора стоматологов разрежения Hoechst в PBS на 30 минут при комнатной температуре во время раскачивания. Аспирационная и промыть два раза с 1 мл раствора PBS.
- Пятно с первичных и вторичных антител согласно стандарту непрямой иммунофлюоресценции протоколы 25.
Примечание: Помечены vDNA colocalizes с ICP8, ICP4 или UL42 и помечены клеточной ДНК colocalizes с Hoechst пятно. - Горы coverslips на слайды и изображения клетки под микроскопом флуоресцирования.
Примечание: При температуре 4 ° C в течение нескольких недель можно хранить слайды.
3. Очистка vDNA и связанных белков
Примечание: некоторые аспекты этого протокола были адаптированы из Лэн et al. 22
Примечание: все буферы и реагенты должны быть охлажденным на льду перед использованием и все шаги должны осуществляться на льду если не указано иное.
- Урожай ядер.
Примечание: Перед изоляции ядер, формальдегид может использоваться чтобы crosslink белки ДНК. Более жесткие условия стирки может затем использоваться во время очистки ДНК на стрептавидина покрытием бусины. Для crosslinking и стирка условий см Сырбу и др. 21.- заменить среднего роста с 20 мл буферной ядер (нос) и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C с иногда тряся. Ядер станет видимым в микроскопе.
- Скрип ядра от пластину с помощью скребка клетки и передать 50 мл Конические трубки. Центрифуги для 10 мин на 2500 x g при 4 ° C до Пелле ядер, удалить супернатант.
Примечание: Трипановый синий пятнать может использоваться для проверки изоляции ядра от клеток. - Аккуратно выбить ядерной гранулы в 10 мл PBS, передача 15 мл Конические трубки и Пелле центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить PBS.
Примечание: Ядра могут быть заморожены и протокол может быть приостановлена на данный момент. Чтобы сделать это, нежно ресуспензируйте ядерной Пелле в 500 мкл замораживания буфера и инкубировать трубки в ванне этанола/сухого льда. Хранить замороженные ядер при температуре-80 ° C. Перед использованием оттепель ядер при комнатной температуре, быстро передать льда, добавляют 10 мл PBS, рок мягко смешать, Пелле центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C и полностью удалить PBS. Замораживание ядра может привести к сокращению урожайности.
- Ковалентно конъюгата биотин азид для EdC помечены vDNA.
- Ресуспензируйте ядерной гранулы в 10 мл нажмите реакции mix [см. Таблицу материалы] нежно закупорить вверх и вниз 5 раз с 10 мл накапайте.
Примечание: Важно, что реагенты, включенные в смеси реакции нажмите добавляются в указанном порядке. - Вращаться в течение 1 ч при 4 ° C. При вращении подготовить и холод буферы B1, B2 и B3 [см. Таблицу материалов].
- Пелле ядер центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить нажмите реакция смеси и помыть лепешка осторожно resuspending в 10 мл PBS и центрифугирование 10 мин на 2500 x g на 4 ° C.
- Нежно ресуспензируйте ядерной Пелле в 1 мл PBS и передачи с помощью кончика пипетки большой диаметр трубки отцентрифугировать 1,5 мл. Пелле ядер центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить PBS и флэш-замораживание в жидком азоте.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и замороженных ядер может храниться на-80 ° C. Замораживание оттепель помогает с последующим лизиса, поэтому рекомендуется, что ядра быть заморожен даже тогда, когда мы перейдем к шагу 3.3 в тот же день.
- Ресуспензируйте ядерной гранулы в 10 мл нажмите реакции mix [см. Таблицу материалы] нежно закупорить вверх и вниз 5 раз с 10 мл накапайте.
- Лизируют ядер и фрагмент ДНК.
- Оттепель ядер на льду и Ресуспензируйте в 500 мкл буфера B1, закупорить вверх и вниз. Инкубируйте на льду для 45 мин
- Sonicate образцы 6 раз за 30 s каждый на 40% амплитуды с помощью зонда microtip 3 мм. Поместите образцы на льду для 30 s между импульсами. После sonication, образцы должны появиться четкие, не ясно.
Примечание: Sonication условия должны быть оптимизированы для отдельных sonicators. Подробные инструкции о том, как оптимизировать sonication условия относятся к Леунг и др. 22. - Пелле мусора клетки центрифугированием в 14.000 x g 10 мин при 4 ° C. Следует значительно уменьшить размер гранул. Через 100 мкм ячейки фильтра фильтр супернатант и сохранить поток через.
- Добавить 500 мкл буфера B2 для отфильтрованных супернатант. 900 мкл в этом примере будет использоваться на шаге 3.4.2.
- Взять Алиготе каждого условия для изоляции ДНК (50 мкл или объем 1/20) и добавьте 50 мкл 2 x SDS-bicarb решение [см. Таблицу материалов]. Перейти к Протокол изоляции ДНК (шаг 3,6).
- Взять Алиготе каждого условия для ввода белка (50 мкл или объем 1/20) и добавьте 50 мкл 2 x буфер Лэмли образца, замораживание в жидком азоте и хранить на -80 ° C. использование в шаге 3.5.6.
- Биотинилированным ДНК bind для стрептавидина покрытием бусины.
- Подготовить стрептавидина T1 магнитные бусы путем передачи 300 мкл суспензии из бисера 1,5 мл отцентрифугировать. Подготовка одной трубы бусы на сэмпл. Мыть бисер 3 x с 1 мл буфера B2, vortexing Ресуспензируйте, применяя магнитом отделить бисер и аспирационных мыть буфера.
Примечание: Оптимизированный обязательного условия приводят к максимальной урожайности и минимальным фон привязки. Экспериментально было установлено, что стрептавидина T1 магнитной бусины имеют значительно больше возможности привязки агарозы бусин, а также другие стрептавидина бусы и меньше фон привязки чем стрептавидина C1 бисер ( Рисунок 4A ). - Добавить 900 мкл пример из шага 3.3.4. промывают бисером и поворот на ночь на 4 ° C.
Примечание: Сделать не вихревой бусы после того, как образец добавляется к им.
Примечание: Если значительное количество ДНК или белка изолированы в неподписанном отрицательный контроль, этот шаг может быть сокращено с ночи до 4 ч. для уменьшения фона привязка.
- Подготовить стрептавидина T1 магнитные бусы путем передачи 300 мкл суспензии из бисера 1,5 мл отцентрифугировать. Подготовка одной трубы бусы на сэмпл. Мыть бисер 3 x с 1 мл буфера B2, vortexing Ресуспензируйте, применяя магнитом отделить бисер и аспирационных мыть буфера.
- Мыть бусины и элюировать связанных белков и vDNA.
Примечание: Рекомендуется использовать фильтр советы для оставшихся шагов.- Место образцы в стойку трубки магнитного отцентрифугировать, удалить супернатант, нежно ресуспензируйте в 1 мл буфера B2, поворот на 4 ° C за 5 мин.
- Три раза повторить шаг 3.5.1.
- Поместите образцы в стойку трубки магнитного отцентрифугировать, удалить супернатант, нежно ресуспензируйте в 1 мл буфера B3 и повернуть на 4 ° C за 5 мин
- Передачи 100 мкл шарик смесь (1/10 й объем) к новой трубки для привязанных изоляции ДНК. Применить эту трубку к магниту, удалить супернатант, Ресуспензируйте бусины в 100 мкл 1 x SDS-bicarb решение и приступить к Протокол изоляции ДНК (шаг 3,6).
- Применить трубка, содержащая оставшиеся 900 мкл шарик смесь из шага 3.5.3. к магниту, удалить супернатант и Ресуспензируйте бусины в 50 мкл 2 x буфер Лэмли образца для элюировать белков и ДНК белковых комплексов.
- Образцы кипения на 95 ° C в течение 15 мин, вихря, быстро вращаться в отцентрифугировать и применять магнит. Передача элюата новой трубки, вспышки заморозить и хранить на -80 ° C.
Примечание: Использование колпачок блокировки для обеспечения, что трубы не поп открыть при кипячении.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и образцы можно хранить при температуре-80 ° C в течение нескольких недель. - Анализ образцы протеина Кумасси синим окрашивание, Западный blotting или масс-спектрометрии, стандартные процедуры 25. Представитель результаты показаны на рисунке 4 и Рисунок 5.
Примечание: Для определения, является ли достаточным для масс-спектрометрии белков урожайность, 7,5 мкл каждого образца используется для анализа Кумасси синим окрашивание и 7,5 мкл для западный blotting представитель вирусного генома связанные белком (ICP4, ICP8 или UL42). Такой же объем лизатов из шага 3.3.6. запускаются вместе с для контроля уровня входного белка. Оставшиеся выборки (35 мкл) затем анализируется по массе спектрометрии, как описано ранее 25.
- Изоляции ДНК
- Проинкубируйте образцы из шагов 3.3.5. и 3.5.4. при 65 ° C для 4-16 h. удалить выборки из магнитных шариков, в случае необходимости.
- Извлекать образцы с 150 мкл рабочего раствора фенола: хлороформ: изоамилового спирта (PCI) и передачи водной фазе к новой пробке.
- Извлечение оставшихся PCI с 100 мкл трис-ЭДТА (TE) и добавить водяной участок к новой пробке.
- Экстракт образцы с 200 мкл хлороформ: изоамиловый спирт (24:1).
- Очистки водной фазе, используя комплект для очистки ПЦР по заявлению производителя ' протокол s.
Примечание: Индикатор пэ-аша в буфер PB будет становятся пурпурными при добавлении к образцу. Добавить 10 & #181; L 3M NaOAc рН 5,0 для снижения pH образца. - Концентрация определить ДНК с помощью флуориметр.
Примечание: Этот протокол обычно дает 100-400 нг шарик прыгните ДНК. ДНК не должно быть обнаружено в элюата отрицательного контроля, в котором EdC не была добавлена в шаге 1.3. - ДНК может храниться в привязке низкой ДНК трубки на 4 или - 20 ° C и может использоваться для ПЦР в реальном времени или высокой пропускной способностью последовательности анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование нажмите химии для очистки дна от клеток проводилась впервые метод iPOND21. IPOND предназначен для очистки сотовой репликации вилки для идентификации связанных белков. Мы адаптировали этот метод специально изучать взаимодействия протеина vDNA во время инфекции. Манипуляция подхода к этикетке вирусных геномов с EdC (рис. 1), в сочетании с синхронизированной инфекций, позволило для селективного изоляции и расследования отдельных популяций vDNA. ДНК ВПГ-1 обозначено с EdC (рис. 1) для облегчения ковалентных привязанность к Флюорофор для изображений или биотина для очистки (рис. 2). Вирус может быть prelabeled до инфекции для анализа белков, связанные с входящих геномов (рис. 1A) или помечены в ходе репликации ДНК для анализа белков, связанные с недавно синтезированных vDNA (рис. 1B)25. Кроме того пульс Чейз анализ может использоваться для изучения природы белков, связанные с вирусной репликации вилки (рис. 1 c)26. ДНК могут быть визуализированы в ячейках для обеспечения пространственной информации о характере помечены ДНК и поддержку для выявленных vDNA белковых взаимодействий (рис. 3). Вместе взятые, протоколы, описанные здесь позволяют для протеомных расследование нескольких аспектов продуктивной инфекции обеспечить проницательность в динамических изменений, которые происходят на HSV-1 геномов. Эти подходы могут быть далее адаптированы к расследованию задержки и оживление, изучить фенотипов, связанные с вирусной мутантов и изучить другие ДНК и РНК вирусов.
Аспекты данного метода очистки белков были адаптированы с Леунг и др. 22. значительное улучшение для очистки EdC помечены ДНК вот использования стрептавидина T1 шарики вместо стрептавидина покрытием агарозы бусины. Для оптимизации Очищение дна, несколько видов стрептавидина покрытием бусины были протестированы для неспецифического связывания при инфекции проводилось в отсутствие EdC и для восстановления максимального белка в присутствии EdC (рис. 4A). Для этих экспериментов Западный blotting была проведена для связывания белка vDNA ICP4. Очищения осуществляется на стрептавидина T1, бусины привели в наименьшее количество фон привязки в отсутствие EdC и восстановления максимальный белка в присутствии EdC.
Белки, связанные с vDNA может быть идентифицирован протеомических методами, включая Западный blotting и масс-спектрометрии. Западный blotting может использоваться для изучения динамики известных взаимодействий и масс-спектрометрии может использоваться как беспристрастный подход для выявления роман vDNA связанных белков. Пример белка доходность, как показано на рисунке 4Вфункцию увеличения EdC маркировки. Мазок, вместо того чтобы четкого чередования шаблон, обычно наблюдается при Кумасси синим пятнать. Это, вероятно, потому что есть ДНК в образец протеина или потому, что есть изобилие белка. Важно также отметить, что медь катализатора используется в нажмите реакции может привести к частичной деградации белков и нуклеиновых кислот28,29. От Западный blotting, аналогичные уровни ICP4 обычно обнаруживаются в элюаты (шаг 3.5.5.) после очистки vDNA, который был назван за 60 мин с EdC, как, что в то же самое количество ввода образцов, приготовленных из ядерных lystates (шаг 3.3.6.). Эта информация может использоваться в качестве руководства для определения, является ли восстановления достаточно, чтобы отправить оставшиеся выборки для масс-спектрометрических анализа.
Nano жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия тандем (LC-MS/MS) может осуществляться как описано ранее25 для идентификации белков, связанные с очищенной vDNA. LC-MS/MS данные анализируются, сравнивая значения спектральной игр (SpC) между EdC меченых экспериментальный образец и соответствующего немеченого отрицательного контроля. Считается, что белки обогащенный в экспериментальный образец, основанный на следующих критериях: 1) белок имеет по крайней мере 5 спектральных графов (SpC) в экспериментальный образец, 2) белок не обнаруживается в элементе управления или обогащается над элементом управления, по крайней мере четыре раза на основе деления значения Сан-Паульского консенсуса и 3) белок обогащается над элементом управления в двух или более биологических реплицирует. Нормализованное спектральных изобилие фактор (NSAF: 
) может использоваться для учета различий в молекулярной массой (МВт) и общего белка урожая. Это уравнение определяет относительное обилие индивидуальных белков внутри образца и позволяет для прямого сравнения двух различных экспериментальных условий, в которых оказываются очищенными различное количество vDNA (например, сравнивая входные вирусных геномов) Рисунок 1A) Чтобы реплицировать геномов (рис. 1B)).
Существует несколько способов представления данных обогащение белком. Некоторые примеры включают круговые диаграммы, диаграммы Венна и сети взаимодействия протеина. Круговые диаграммы может использоваться для иллюстрации доля определенных белков, которые известны в конкретного биологического процесса (Рисунок 5A). Однако могут возникнуть проблемы, когда один белок имеет более чем одной биологической функции, которая часто случается. Это также трудно сравнивать данные через различные диаграммы. Венна полезны для демонстрации связи между белками, определены в различных экспериментальных условиях, но не обеспечивают никакой функциональной информации о определенных белков (Рисунок 5B). Протеин взаимодействия сетей изобразить визуального иллюстрации потенциальных взаимодействий между определенных белков и предоставляют сведения о типах биологических процессов, которые вовлечены (рис. 5 c). Некоторые Интернет-ресурсы доступны для сопоставления прогнозируемых белок белковых взаимодействий, включая строку (инструмент поиска для поиска взаимодействия генов/белков)30. Онлайн инструменты обычно оборудованы для обработки данных протеомики из различных видов и предоставлять ценную информацию о принимающих белков, участвующих в механике вирусного генома. Однако вирусные белки обычно не включены в базах данных, которые могут усложнить анализ. Таким образом важно рассмотреть основные выводы, которые хотелось бы передать при определении способа представления данных протеомики.
Рисунок 1:Онг > подходы к метке ДНК ВПГ-1. (A) для анализа состояния входящих вируса, отдыхая MRC-5 клеток в G0 заражены prelabeled HSV-1 и геномов assayed на менее чем 4 hpi учиться нереплицированные вирусной ДНК. (B) для анализа состояния репликации вируса, MRC-5 клеток, инфицированных немеченого HSV-1 и EdC (оранжевые звезды) добавляется к среднего роста зараженных клеток и инкубированы для 2-4 ч после начала репликации вирусных ДНК (≥4 hpi). (C) для анализа вирусной репликации вилки, инфицированные клетки являются пульс, помечены EdC для 5-20 мин репликации вилки может затем чеканка с deoxyC. EdC, помечены ДНК-оранжевый. Этот рисунок был изменен с Dembowski и Делука25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Процедуры, описанные в этом документе, для анализа EdC помечены ДНК. (A) краткое изложение метода для визуализации EdC помечены ДНК. Меткой ДНК представлена в зеленый. (.B) краткое изложение метода для очистки и ниже по течению анализ EdC помечены vDNA. Этот рисунок был изменен с Dembowski и Делука25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Визуализация EdC помечены ДНК. Клетки были инфицированы, помечены и образы, как описано на рисунке 1 и Рисунок 2. Показываются представителя изображения помечены сотовой и вирусной ДНК. Клеточной ДНК colocalizes с Hoechst пятно и vDNA с ICP4. Линейки: 5 µm.This рисунок был изменен с Dembowski и Делука25 и Dembowski и др. 26. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Результаты очистки представитель белковых. (A) Сравнение доходности белка при очистки шаги были проведены с использованием нескольких различных типов стрептавидина покрытая бисером. Инфекция была проведена в присутствии EdC (+) для сравнения белка урожая или в отсутствие EdC (-) для сравнения фон привязки. Инфекции и EdC маркировки, были проведены как описано в Рисунок 1B и ДНК белковых комплексов были очищены согласно шагам в Рисунок 2B с использованием сопоставимых количество различных типов стрептавидина покрытая бисером. Верхняя панель: Сравнение доходности после очистки на стрептавидина покрытием агарозы бусы или стрептавидина M-280 белка. Нижняя панель: Сравнение доходности белка после очистки на стрептавидина M-270, M-280, стрептавидина C1 или стрептавидина T1. Западный blotting была проведена с антитело против вирусного белка ICP4. Очищенный ICP4 показано на первой полосе для сравнения. Более длинная экспозиция нижней панели требуется соблюдать аналогичные интенсивности ICP4 в майнах «280» в верхней панели. Отображаются результаты очистки представитель белка (B) как функцию времени EdC маркировки. Инфекции и EdC маркировки, были проведены как описано в Рисунок 1B и ДНК белковых комплексов были очищены согласно шагам в Рисунок 2B с использованием бисера стрептавидина T1. EdC маркировки была проведена для 0, 20, 40 или 60 мин и Кумасси синим окрашивание (вверху) и западных blotting результаты (внизу). Западный blotting была проведена с антител специфических для ICP4, UL42 или GAPDH. Элюата образец был взят из шага 3.5.5. и lysate от шага 3.3.6. Стрелка указывает стрептавидина, а L белков лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Примеры различных способов представления данных протеомики. (A) круговые диаграммы суммировать белки, которые были определены по масс-спектрометрии белков элюаты, связанные с вирусных геномов, очищенная на 6 hpi. Значения указывают количество белков, которые определены для каждой функциональной категории. T указывает общее количество белков, которые определены. Цвета указывают на следующие категории: фиолетовый - обработки РНК, красный - транскрипция, зеленый - chromatin remodeling, оранжевый - репликации ДНК, желтый - ядерных транспорта, чирок - цитоскелета, темно-синий - HSV структурных белков и Грей - другие/неизвестно. (B) диаграммы Венна изображают перекрытие белков, определены ассоциироваться с вирусных геномов в 6, 8 или 12 Инн. (C) A STRING карта изображает белков обогащенного на Форкс вирусной репликации после 5 минут EdC пульс. Человеческие белки, обогащенная 5 раз по сравнению с неподписанных отрицательного контроля указаны в карта функционального взаимодействия, который был создан с помощью строки30 с параметрами данных для отображения только высокая достоверность взаимодействий. Джин имена были использованы для сопоставления взаимодействий. Круги показывают белки эту функцию в том же биологический процесс. Эта цифра была изменена с Dembowski и Делука25 и Dembowski и др. 26. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол включает в себя несколько шагов, которые, если не соблюдены тщательно, может привести к значительно более белка урожая или загрязнения с клеточной ДНК. Важно, что стационарные клетки используются для всех экспериментов для обеспечения не помечены и очищенного клеточной ДНК. Это может быть подтверждено отсутствие клеточной ДНК полимеразы в образец протеина потому что HSV-1 не используют для синтеза генома клеточной ДНК-полимеразы. Во время EdC маркировки и ядер, уборка шаги образцы следует поэтапно обеспечить что каждый обрабатывается одинаково. Во время очистки мер следует позаботиться не манипулировать ядер, закупорить слишком много. Это может привести к преждевременной лизис ядер, а также образец потери вследствие торчащие по бокам накапайте советы. Кроме того sonication шаг должны быть оптимизированы для отдельных sonicators и количество стрептавидина покрытием бусы, используемого для привязки биотина следует титруемая для оптимального белка урожая.
Некоторые изменения могут быть сделаны к настоящему Протоколу и включают в себя использование различных вирусов или типы клеток или добавление шага crosslink белка ДНК. При выборе типа ячеек для использования для протеомных расследования, важно проверить доступность базы данных последовательности белка для этого вида. Нехватка ресурсов протеомики существенно ограничит течению анализ данных белков. Еще одним ограничением является необходимость большого числа клеток, поэтому он может быть трудно подготовить достаточно начального клеток, таких как нейроны, для этого эксперимента. Этот метод должен быть совместим с другими ДНК или РНК вирусов, как вирусная инфекция не зависит от сотовой репликации ДНК. Кроме того было бы интересно изучить изменения в ДНК белковых взаимодействий, которые происходят в мутантов HSV-1. Еще одно изменение в этот протокол может быть дополнением формальдегида сшивки шаг до изоляции ядер, которые позволили бы более строгие условия стирки во время очистки21. Добавление формальдегида не повлияет на способность урожай ядер, но может привести к снижению белка урожая из-за трудно обратить вспять сшивки во время белковых элюции.
Результаты от этого протокола представляют собой среднее состояние вирусной ДНК рассматривается. Таким образом трудно отличить, если комплексы находятся вместе на такие же или отдельных молекул ДНК. vDNA маркировка методы, описанные здесь, в сочетании с высоким разрешением изображений может использоваться для проверки данных протеомики и может помочь отличить различных популяций помечены ДНК в клетке. Кроме того чип seq может использоваться как следить метод для идентификации конкретных местах белков на вирусного генома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы признаем Ханна Fox за помощь в подготовке этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
