Summary
Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.
Abstract
Bu iletişim kuralı kimliği için enfekte hücreleri DNA'dan (HSV-1) ilişkili herpes simplex virüsü tip 1 yalıtmak için viral ve hücresel proteinler tarafından kütle spektrometresi hedefidir. Her ne kadar viral genom ile etkileşim proteinler enfeksiyon sonucu belirlemede önemli rol oynarlar, viral genom ilişkili proteinler kapsamlı bir analiz daha önce mümkün değildi. Burada biz HSV-1 genleri enfekte hücreleri doğrudan arıtma sağlayan bir yöntem göstermek. Viral DNA çoğaltılıyor seçerek bir ALKİN fonksiyonel grup içeren değiştirilmiş nükleotit ile etiketlenir. Etiketli DNA sonra özellikle ve geri dönüşümsüz tagged biotin azid bir bakır (I) ile kovalent eki ile-katalize azid ALKİN reaksiyon cycloaddition ya da tıklayın. Biotin öğesini DNA streptavidin kaplı boncuk saflaştırılmış ve ilişkili protein eluted ve kütle spektrometresi tarafından tanımlanan. Bu yöntem seçici hedefleme ve yalıtım HSV-1 çoğaltma çatal veya karmaşık biyolojik ortamlardan bütün genleri etkinleştirir. Ayrıca, bu yaklaşım adaptasyon herpesviral enfeksiyon, çeşitli yönlerinin yanı sıra diğer DNA virüsleri genleri incelenmesi incelenmesi için izin verir.
Introduction
Virüs temel işlevlerini gerçekleştirecek ve bu nedenle enfeksiyon viral gen ekspresyonu, çoğaltma, tamir, Rekombinasyon ve ulaşım dahil olmak üzere önemli yönlerini kolaylaştırmak için ana bilgisayar etkenlere bağlı için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu ana faktörler faaliyetleri genellikle virally kodlanmış proteinler tarafından artar. Ayrıca, virüs algılama ve girişim tarafından hücresel yanıt için viral enfeksiyon kaçınmak gerekir. Bu nedenle, virüs ana etkileşimler enfeksiyon sonucu dikte. Büyük önem nasıl virüs viral işlemleri kolaylaştırmak için hücresel makine adapte hücresel ortamı alter anlaşılmasıdır. Özel ilgi hangi faktörler ve süreçleri viral genom bulaşıcı döngüsü boyunca hareket tespitidir.
Herpes simplex virüsü tip 1 (HSV-1) bir çift DNA virüs bulaşan insan nüfusunun önemli bir kısmı mahsur olduğunu. Enfeksiyonun ilk bir saat içinde nerede viral DNA (vDNA) çoğaltma1ile koordineli olarak viral gen ekspresyonu sıralı bir çağlayan ensues çekirdeği, viral genom girer. Çekirdek, genleri tabi epigenetik düzenleme, onarım ve rekombinasyon geçmesi ve öyle ki ilk döl virions 6 saat içinde üretilen capsids paketlenir. Viral genom ilişkili proteinler enfeksiyon seyri boyunca kapsamlı değerlendirme viral genom hareket ve hangi viral ve hücresel faktörler görmemizi sağlayacak süreçleri moleküler ayrıntılarını araştırmak için zemin enfeksiyon çeşitli aşamalarında yer alırlar.
Benzeşme arıtma ilişkili hücresel proteinler2,3,4,5 analizi için viral proteinlerin ana faktörler viral enfeksiyon katılan incelenmesi için önceki yöntemleri içerir , 6 , 7 , 8 , 9. bu deneyleri ana bilgisayar antiviral yanıt yanı sıra viral Kromatin değişiklik, gen ekspresyonu, enstrümantal hücresel faktörler katılan tanımlanması için edilmiş ve DNA tamir. Ancak, vDNA ilişkilendirmesiyle etkileşimleri bağlıdır ve proteomik yalnızca belirli bir viral faktör bir fonksiyonu olarak oluşan etkileşimleri içgörü sağlamak olup olmadığını tespit etmek zordur. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) nerede belirli viral ve hücresel proteinler viral genom10,11,12,13,14 ' e bağlamak tanımlamak için kullanılan , 15 ve immunocytochemistry ile kombine floresan In situ hibridizasyon (balık) vDNA16,17,18ile, colocalize hücresel faktörler görselleştirme sağladı 19 , 20. bu deneyleri kayma ve temporal analiz için izin. Ancak, çok özel antikorlar, sınırlı hassasiyet ve virüs ana bilgisayar etkileşimleri önceki fikir ihtiyacını ihtiyacını sınırlamaları içerir. Bu nedenle bir yöntemi iPOND (yalıtım doğmakta olan DNA üzerinde proteinlerin)21 tarihinde göre geliştirilen ve seçmeli olarak etiket ve vDNA üzerinden arındırmak için aniPOND (hızlandırılmış yerli iPOND)22 viral genom tarafsız tanımlanması için hücreleri enfekte Kütle spektrometresi ile ilişkili proteinler. iPOND hücresel çoğaltma çatal dynamics soruşturma için vesile olmuştur.
Enfekte hücreleri üzerinden viral genom seçici arıtma için vDNA çoğaltılıyor modifiye ethynyl nükleozitler, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) veya 5-ethynyl-2´-kovalent tarafından takip deoxycytidine (EdC) (Resim 1), taşır konjugasyon için biotin azid viral genom ve ilişkili proteinler streptavidin kaplı boncuk (şekil 2B) üzerinde tek adım arıtma kolaylaştırmak için kimya'ı tıklatın. Önemlisi, enfeksiyonlar hücresel DNA ikileşmesi belirli vDNA etiketleme etkinleştirmek için nişanlı değil sabit hücrelerde, devam etmektedir. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu hücre döngüsü tutuklama nedenleri ve hücresel DNA çoğaltma23,24engeller. Virüs önce gelen viral genom (şekil 1A) ile ilişkili protein analizi için enfeksiyon prelabeled ya da yeni sentezlenmiş vDNA (şekil 1B) ile ilişkili protein analizi için DNA ikileşmesi sırasında etiketli 25. Ayrıca, nabız chase analiz doğa viral çoğaltma çatal (şekil 1 c)26ile ilişkili proteinlerin araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, vDNA ethynyl-modified kovalent protein dinamiği (şekil 2A ve şekil 3) kayma soruşturma için bir fluorophore için Birleşik. Görüntüleme vDNA doğrudan görselleştirme için sağlar ve vDNA-protein etkileşimleri doğrulama için ücretsiz bir yaklaşımdır ve viral genom enfeksiyon boyunca izlemek için adapte edilebilir. Biz bu yaklaşımlar daha da herpesviral enfeksiyon, gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme, dahil olmak üzere herhangi bir yönünü çalışmaya ve diğer DNA virüsleri çalışmaya değiştirilebiliyordu tahmin. Ayrıca, 5-ethynyl üridin ile etiketleme (AB) RNA viral genom analizi için izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre kültürü, Viral enfeksiyon ve EdC etiketleme ( şekil 1)
Aşağıdaki protokol virüsler ile çalışma gerektirir. Kurumunuzun için bakınız ' s biyo-güvenlik protokollerini virüsler ve diğer biyolojik ajanlar güvenli taşıma ile ilgili. Bu protokolün Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından kabul edildi.
- Bir Konfluent 150 cm 2 doku kültürü şişesi MRC-5 hücre trypsinize ve hücreleri 100 mL DMEM artı % 10 içeren 600 cm 2 doku kültürü plakasına transfer FBS. Varlığında % 5 CO 2 3-4 gün confluency ve sabit faz ulaşmak için için 37 ° C'de kuluçkaya. Konfluent 600 cm 2 çanak ~ 7 x 10 7 hücreler içerir. Her koşul için 1 plaka ve her karşılık gelen negatif kontrol için 1 plaka hazırlayın.
Not: Bu sadece vDNA etiketli ve sonraki adımlar saf emin olmak için hücresel DNA ikileşmesi etkisizleştirmek için durağan faz hücre ulaşmalıdır.
Not: Her örnek ücretsiz bir negatif kontrol süresi noktası EdC ek olmadan ve aynı enfeksiyon koşulları kullanılarak hazırlanan etiketsiz gerektirir.
Not: Bu deneme sürümü ölçekli A tandem hücresel DNA'sı karşılaştırılabilir hücre büyüme, enfeksiyon, koşullar, etiketleme EdC kullanarak görüntüleme tarafından etiketleme için test etmek ve Puan zaman yapılmalıdır (see Adım 2). - 7 x 10 8 PFU HSV-1 7 ml seyreltik soğuk Tris-Buffered serum fizyolojik (TBS). Büyüme orta çıkarın ve 37 ° C'de saklayın Bulaştırmak için 7-mL sulandırılmış virüs MRC-5 hücreleri ve kaya oda sıcaklığında 1 h için ekleyin. Aşağıdaki adsorpsiyon, inoculum kaldırmak, 50 mL oda sıcaklığında TBS ile durulayın ve özgün büyüme orta yerine. Varlığında % 5 CO 2 37 ° C'de kuluçkaya. Bu adımı her deneysel durumu ve negatif kontrol yapılmalıdır.
Not: Artan EdC etiketleme HSV-1 mutantlar arızalı için viral dUTPase (UL50 gen) ve/veya urasil glycosylase (UL2 gen) ifade kullanılarak elde edilebilir. HSV-1 dUTPase düşük substrat özgüllüğü vardır ve birkaç nükleozit analogları 25 , 27 aktivasyonu düşürebilir. - Etiketi viral genom EdC ile. Gelen genleri (1.3.1.), genleri (1.3.2.) veya viral çoğaltma çatal (1.3.3.) çoğaltma etiketlemek için yönergeleri izleyin.
Not: Tek adım 1.3.1, 1.3.2 veya 1.3.3 gelen genleri, çoğaltılmış genleri veya çoğaltma çatal sonraki adımlar sırasıyla analiz edilecek olup bağlı olarak yapılmalıdır.
Not: EdU veya f-ara EdU EdC için yedek olabilir. Nükleozit analogları toksisite izlenmeli ve en aza indirgemek.- Kullanım prelabeled adım 1.2 enfeksiyonunda yürütmek ve adım 2'ye devam etmek için hisse senetleri veya 3 4 h içinde yazı çoğaltılmamış vDNA ( şekil 1A) araştırmak için enfeksiyon (HPI).
Not: yukarıda açıklanan protokol 25 kullanarak hisse senetleri prelabeled virüs hazırlayın. Virüs stokları herhangi bir kalıntı EdC kaldırmak için G-25 sütununu tarayarak geçti. - Etiket kopyalayan vDNA 5-25 µM ekleyerek EdC için 2-4 h ( şekil 1B) enfekte hücreleri hücre kültür orta için. Eklemeden önce EdC seyreltik büyüme orta 1 mL. Viral çoğaltma çatal, vDNA çoğaltma başlangıcından sonra etiketlemek için
- (≥ 4 HPI), vDNA 5-25 µM ile çoğaltma darbe etiket EdC 5-20 dk için. Kovalamak için 3 x 25-100 µM 2´deoxycytidine içeren chase orta ile yıkayın (deoxyC) ve sonra chase orta bir ek 20-40 dakika ( şekil 1 c) huzurunda kuluçkaya.
Not: Kullanmadan önce 37 ° C ve % 5 CO 2 darbe ve chase orta equilibrated.
Not: darbe chase deneyler için bu hücreyi girmek ve onlar DNA çoğaltılıyor içine dahil edilebilir önce fosforile nükleozitler geçen süreyi dikkate almak önemlidir. Bu ampirik olarak belirlenmelidir.
Not: darbe chase deneyler çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan deneysel koşullar altında viral çoğaltma oranını hesaplamak. Bu bir tek adım büyüme saat ders 26 sırasında viral genom kantitatif PCR tarafından belirlenebilir.
Not: Viral genom görüntüleme için adım 2'ye geçin ve viral genom arıtma için adım 3'e devam.
- Kullanım prelabeled adım 1.2 enfeksiyonunda yürütmek ve adım 2'ye devam etmek için hisse senetleri veya 3 4 h içinde yazı çoğaltılmamış vDNA ( şekil 1A) araştırmak için enfeksiyon (HPI).
2. EdC görüntüleme etiketli DNA ( şekil 2A)
Not: hücresel DNA deneyleri etiketli değildir doğrulamak için viral genom arıtma yöntemi ile tandem görüntüleme gerçekleştirmek yararlıdır. Görüntüleme etiketli vDNA doğası görselleştirmek için ve proteomik verileri doğrulamak için de kullanılabilir. Hücresel ve viral DNA desenleri boyama örnekleri şekil 3 ' te gösterilen.
- Enfeksiyonlar taşımak ve EdC adım 1 kullanarak dışında gösterildiği gibi etiketleme coverslips büyüme orta 1 mL içeren bir 12-iyi doku kültürü tabak koşullara küçülttüm.
- 1 mL % 3.7 hücrelerle düzeltme paraformaldehyde 1 x PBS RT., 15 dakika içinde Fiksasyon sonra durulama 2 x 1 mL % 3 BSA PBS ile hücreleri.
Dikkat: Paraformaldehyde kalıcı ya da ciddi yaralanmalara neden olabilir. Güvenlik önlemleri izleyin.
Not: Protokol burada durdu ve coverslips ikinci yıkamaya 4 ° c ilâ 3 gün saklanabilir için. - Permeabilize 1 mL permeabilization arabellek içeren hücreleri [Tablo malzemeleri görmek] sallanan süre oda sıcaklığında 20 dk için.
- Durulama 1 mL % 3 BSA ve sonra oda sıcaklığında 30 dakika ile 1 mL % 3 BSA PBS içinde blok ile sallanan süre.
- Eklemek tıklayın tepki kokteyl 1 mL [Tablo malzemeleri görmek] kovalent Alexa Fluor 488 çekimlerine coverslips azid EdC için DNA etiketli. 30 dk için oda sıcaklığında sallanan süre kuluçkaya. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.
- Leke hücresel DNA ile sallanan süre bir 1:2,000 seyreltme Höchst içinde PBS, oda sıcaklığında 30 dk için 1 mL. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.
- Leke standartlarına göre birincil ve ikincil antikorlar ile dolaylı ayirt protokolleri 25.
Not: Etiketli vDNA ICP8, ICP4 veya UL42 ile colocalizes ve hücresel etiketli DNA ile Höchst leke colocalizes. - Dağ coverslips slayta ve görüntü bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri.
Not: Birkaç hafta için 4 ° C'de slaytlar depolanabilir.
3. VDNA ve ilişkili proteinler arıtma
Not: Bu protokol çeşitli yönleri Leung ve ark. uyarlanmıştır 22
Not: tüm arabellekleri ve Kimyasalları kullanmadan önce buzda soğutulmuş ve tüm adımları buza aksi belirtilmedikçe yapılmalıdır.
- Hasat çekirdeği.
Not: çekirdeklerin izolasyon önce formaldehit crosslink proteinler DNA için kullanılabilir. Daha sıkı yıkama koşulları daha sonra boncuk streptavidin kaplı üzerinde DNA arıtma sırasında kullanılabilir. CR içinSirbu vd. osslinking ve yıkama koşullara bakınız 21.- 20 mL çekirdek ayıklama arabellek (NF'leri) ile büyüme orta eski yerine koymak ve 4 ° C'de ara sıra sallanan ile 20 dk için kuluçkaya. Hücre çekirdeği içinde mikroskop görünür olacak.
- Çekirdeği kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka scrape ve 50 mL konik tüp aktarmak. 2500 x g çekirdekleri cips, süpernatant atın için 4 ° c de 10 dakika santrifüj.
Not: mavi boyama çekirdeği hücrelerden yalıtım doğrulamak için kullanılabilir Trypan. - Yavaşça 10 ml PBS, 15 mL konik tüp transferi nükleer Pelet çıkarmak ve cips 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de 2500 x g, 10 dk centrifuging.
Not: Çekirdeklerin donmuş olabilir ve protokol bu noktada duraklatıldı. Bunu yapmak için yavaşça nükleer Pelet 500 resuspend buz gibi µL tampon ve bir etanol/kuru buz banyosu tüpte kuluçkaya. Çekirdeği-80 ° C'de dondurulmuş mağaza Kullanmadan, çekirdek, oda sıcaklığında erimek, hızlı bir şekilde aktarmak buz, 10 mL PBS, yavaşça karıştırın, 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından cips için rock eklemek için ve tamamen PBS kaldırmak. Çekirdeği dondurma düşük verim neden olabilir.
- Kovalent eşlenik biotin azid EdC için etiketli vDNA.
- 10 mL tıklayın tepki nükleer Pelet mix [Tablo malzemeleri görmek] yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 5 kere ile 10 mL damlalıklı resuspend.
Not: Bu tıklayın tepki karışımda bulunan reaktifler belirtilen sıraya göre eklenir önemlidir. - 4 ° C'de 1 h için döndürme Döndürme sırasında hazırlamak ve arabellekleri B1, B2 ve B3 [bkz: Malzemeler tablo] chill.
- 4 ° C. tamamen Kaldır'de 2500 x g, 10 dk centrifuging tarafından Pelet çekirdeği tepki karıştır'ı tıklatın ve yavaşça 10 mL PBS resuspending ve 4 de 2500 x g, 10 dk centrifuging Pelet yıkama ° C.
- Yavaşça 1 ml PBS nükleer Pelet ve transfer büyük pipet ucu kullanarak 1.5 mL microfuge Tube resuspend. Cips çekirdekler için 2.500 x 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de g ve sıvı azot flaş donma, 10 dk centrifuging.
Not: Bu noktada protokol duraklatılmış ve donmuş çekirdeği saklanabilir sonraki lizis-80 ° C. donma çözülme yardımcı olur, dolayısıyla çekirdeklerin ne zaman adım 3.3 için aynı gün bile geçmeden dondurulmuş flaş önerilir.
- 10 mL tıklayın tepki nükleer Pelet mix [Tablo malzemeleri görmek] yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 5 kere ile 10 mL damlalıklı resuspend.
- Çekirdeği lyse ve DNA parçası.
- Buz çekirdeği çözülme ve 500 µL arabellek B1 yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. 45 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
- Sonicate örnekleri 6 kere için 30 s her % 40 genlik 3 mm microtip sonda kullanarak. Buz 30 örnekleri yer s bakliyat arasında. Sonication sonra örnekleri görünmesi gereken açık, değil bulutlu.
Not: Sonication koşulları tek tek sonicators için optimize edilmelidir. Sonication koşulları optimize etmek ayrıntılı yönergeler için Leung ve ark. için başvurun 22. - cips hücre artıkları 14.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de centrifuging tarafından Pelet boyutunu önemli ölçüde azaltmak gerekir. Süpernatant 100 µM hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve aracılığıyla akış korumak.
- Ekle 500 µL arabellek B2 süzülmüş süpernatant. 900 µL Bu örnek için 3.4.2. adımda kullanılan.
- Bir aliquot DNA izolasyonu (50 µL veya 1/20 birim) için her durumun alıp 50 µL 2 x SDS-bikarbonat çözüm ekleyin [Tablo malzemeleri görmek]. DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.
- Her koşul giriş protein (50 µL veya 1/20 birim) için bir aliquot almak ve 50 µL 2 x Laemmli örnek arabellek eklemek, sıvı nitrojen içinde dondurmak ve depolamak-80 ° C. kullanımda adım 3.5.6.
- Bağlama biotinylated DNA streptavidin kaplı boncuklar.
- 1.5 mL microfuge tüp boncuk Bulamaç 300 µL aktarma tarafından hazırlamak Streptavidin T1 manyetik boncuklar. Boncuk örnek başına bir tüp hazırlayın. Yıkama boncuk 3 x ile 1 mL arabellek B2 yanında vortexing resuspend, boncuk ayırmak için bir mıknatıs uygulamak ve yıkama arabellek aspirating.
Not: en yüksek düzeyde verim ve minimal arka plan bağlayıcı koşulları sonuç bağlama en iyi duruma getirilmiş. Deneysel Streptavidin T1 manyetik boncuklar özel boncuk yanı sıra diğer Streptavidin boncuk ve daha az arka plan bağlayıcı Streptavidin C1 boncuk daha önemli ölçüde daha fazla bir bağlama kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir ( şekil 4A ). - Ekleyin 900 µL örnek adım 3.3.4. yıkanmış boncuk ve Döndür'ün gece saat 4'te ° C.
Not: örnek onlara eklendikten sonra girdap boncuk etmeyin.
Not: önemli miktarda DNA veya protein etiketlenmemiş negatif kontrol izole Eğer bu adım bir gecede 4 h için arka plan bağlayıcı azaltmak için azaltılabilir.
- 1.5 mL microfuge tüp boncuk Bulamaç 300 µL aktarma tarafından hazırlamak Streptavidin T1 manyetik boncuklar. Boncuk örnek başına bir tüp hazırlayın. Yıkama boncuk 3 x ile 1 mL arabellek B2 yanında vortexing resuspend, boncuk ayırmak için bir mıknatıs uygulamak ve yıkama arabellek aspirating.
- Yıkama boncuk ve vDNA ve ilişkili proteinler elute.
Not: Bu filtre ipuçları için kalan adımları kullanmak için tavsiye edilir.- Yer örnekleri süpernatant Kaldır, manyetik microfuge tüp raf içine yavaşça 1 ml arabellek B2, döndürme 4 ° C'de 5 dakika süreyle resuspend.
- Tekrarlama adım 3.5.1 üç kez.
- Örnekleri bir manyetik microfuge tüp raf içine yerleştirin, süpernatant kaldırmak, yavaşça 1 mL arabellek B3, resuspend ve 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürmek
- İlişkili DNA izolasyonu için yeni bir tüp transfer 100 µL boncuk karışıma (1/10 inci cilt). Bu tüp mıknatıs için geçerlidir, süpernatant kaldırmak, SDS-bikarbonat çözüm x 100 µL 1 boncuk resuspend ve DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.
- Kalan 900 µL boncuk karışımı adım 3.5.3 içeren tüp geçerlidir. mıknatıs için süpernatant kaldırmak ve protein ve DNA-protein kompleksleri elute için Laemmli örnek arabellek x 50 µL 2 boncuk resuspend.
- Kaynatın örnekleri 15 95 ° c min, girdap, hızlı spin microfuge ve mıknatıs uygulanır. Yeni tüp, flaş donma ve-80 mağazasında eluate transfer ° C.
Not: kullanım kap kilitleri tüpler pop sağlamak için süre kaynatma açın.
Not: Protokol bu noktada durdu ve örnekleri için birkaç hafta-80 ° C'de saklanabilir. - Analiz protein örnekleri Coomassie mavi boyama, western Blot ya da Standart prosedürler 25 tarafından kütle spektrometresi. Temsilcisi-den sonuçlanmak göstermek şekil 4 ve şekil 5.
Not: protein verim için kütle spektrometresi yeterli olup olmadığını belirlemek için her örneğinin 7.5 µL analiz için Coomassie boyama mavi tarafından kullanılır ve Batı temsilcisi viral genom kurutma için 7,5 µL protein (ICP4, ICP8 veya UL42) ilişkili. Lysates adım 3.3.6 aynı hacmi. yanında giriş protein düzeyleri için denetime çalıştırılır. Kalan örnek (35 µL) sonra kitle tarafından analiz 25 daha önce açıklandığı gibi spektrometresi.
- DNA izolasyon
- adımları 3.3.5 örneklerinden kuluçkaya. ve 3.5.4. 65 ° c 4-16 h. çıkarmak için manyetik boncuklar, gerekirse örnek.
- Ayıklamak örnekleri ile 150 µL fenol: kloroform: izoamil alkol (PCI) ve sulu faz için yeni bir tüp transfer.
- 100 µL ile kalan PCI ayıklamak Tris-EDTA (TE) ve sulu faz için yeni bir tüp ekleyin.
- Ayıklamak örnekleri ile 200 µL kloroform: izoamil alkol (24:1).
- Arındırmak PCR arıtma Kit üreticiye göre kullanarak sulu faz ' s protokolü.
Not: pH göstergesi arabellek PB ile örnek için eklendiğinde mor dönecek. 10 ve # eklemek181; L 3M NaOAc pH 5,0 örnek pH düşmesine. - Bir yer kullanarak belirlemek DNA toplama.
Not: Bu protokol genellikle 100-400 ng boncuk bağlı DNA verir. Hiçbir DNA negatif kontrol içinde EdC değil eklendi adım 1. 3'eluate tespit edilmelidir. - DNA'sı düşük bir DNA bağlamasında depolanan tüp 4 veya - 20 ° C ve gerçek zamanlı PCR veya yüksek işlem hacmi sıralama analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tıklayın kimya kullanım hücrelerden DNA arıtma için iPOND yöntemi21tarafından ilk başarılı oldu. İPOND hücresel çoğaltma çatal ilişkili proteinlerin tanımlanması için arındırmak için amaçtır. Bu teknik özellikle enfeksiyon sırasında vDNA protein etkileşimleri çalışmaya adapte olması. EdC (şekil 1), ile viral genom eşitlenmiş enfeksiyonlar ile kombine etiketlemek için yaklaşım manipülasyon seçici yalıtım ve vDNA ayrı nüfus incelenmesi için izin verdi. HSV-1 DNA kovalent eki görüntüleme için bir fluorophore veya biotin arıtma (Şekil 2) kolaylaştırmak için EdC (şekil 1) taşır. Virüs önce gelen genleri (şekil 1A) ile ilişkili protein analizi için enfeksiyon prelabeled veya yeni sentezlenmiş vDNA (şekil 1B)25ile ilişkili protein analizi için DNA ikileşmesi sırasında etiketli. Ayrıca, nabız chase analiz doğa viral çoğaltma çatal (şekil 1 c)26ile ilişkili proteinlerin araştırmak için kullanılabilir. DNA yapısı hakkında mekansal bilgi etiketli DNA ve destek için tanımlanan vDNA-protein etkileşimler (şekil 3) sağlamak için hücre içinde görüntülenmeyecektir. Birlikte ele alındığında, burada açıklanan protokoller HSV-1 genleri üzerinde oluşan dinamik değişiklikleri içgörü sağlamak için birden çok üretken enfeksiyon yönlerini proteomik soruşturma için izin. Bu yaklaşımlardan daha fazla gecikme süresi ve reaktivasyonu, viral mutantlarla ilişkili fenotipleri incelemenize ve diğer DNA ve RNA virüsleri incelemek araştırmak için adapte.
Bu protein saflaştırma yöntemi yönlerini Leung ve arkadapte edildi. 22. EdC arıtma DNA etiketli burada önemli bir gelişme Streptavidin T1 boncuk streptavidin kaplı özel boncuk yerine kullanımı içindir. DNA arıtma optimize etmek için çeşitli boncuklar streptavidin kaplı enfeksiyon EdC ve en fazla protein kurtarma EdC (şekil 4A) varlığında yokluğunda gerçekleştirildiği zaman nonspesifik bağlama için denendi. Bu deneyler için western Blot vDNA bağlayıcı protein ICP4 gerçekleştirilmiştir. Streptavidin arka plan bağlayıcı EdC ve en fazla protein kurtarma EdC varlığında yokluğunda en az miktarda boncuk sonuçlandı T1 yürütülen purifications.
VDNA ile ilişkili proteinler proteomik western Blot ve kütle spektrometresi gibi yöntemlerle tespit edilebilir. Western Blot bilinen etkileşimleri dinamikleri araştırmak için kullanılabilir ve kütle spektrometresi tarafsız bir yaklaşım roman vDNA ilişkili proteinler tanımlamak için kullanılabilir. Bir örnek protein verim artan EdC etiketleme bir fonksiyonu şekil 4B' gösterildiği gibi. Genellikle açık bir bantlama deseni, yerine bir smear Coomassie boyama mavi tarafından görülmektedir. DNA protein örnek mevcut olduğundan veya protein bolluğu olduğundan muhtemeldir. Tıklayın tepki olarak kullanılan bakır katalizör kısmi bozulma, protein ve nükleik asitler28,29neden olabilir unutmamak önemlidir. Western Blot tarafından ICP4 benzer düzeyde genellikle eluates (Adım 3.5.5.) olarak bu giriş örnek nükleer lystates (Adım 3.3.6.) hazırlanan aynı miktarda bulunması EdC ile 60 dk için etiketli vDNA arınma sonra tespit edilir. Bu bilgi kurtarma kitle spektrometrik analizi için kalan örnek göndermek için yeterli olup olmadığını belirlemek için bir rehber olarak kullanılabilir.
Nano sıvı Kromatografi ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) saf vDNA ile ilişkili proteinler tanımlamak için25 daha önce açıklandığı gibi yapılabilir. LC-MS/MS veri EdC etiketli deneysel örnek ve karşılık gelen etiketlenmemiş negatif kontrol arasında spektral sayısı (SpC) değerleri karşılaştırarak analiz edilir. Proteinler aşağıdaki ölçütleri temel alarak deneysel örnek zenginleştirilmiş kabul edilir: 1) protein vardır en az 5 tayf sayar (SpC) deneysel örneğinde, 2) protein denetimde algılanmaz veya denetim tarafından üzerinde en az four-fold zenginleştirilmiş SpC değerleri ve 3 bölme dayalı) protein üzerinde iki veya daha fazla biyolojik çoğaltır denetiminde zenginleştirilmiştir. Normalleştirilmiş spektral bereket faktörü (NSAF: 
) molekül ağırlığı (MW) ve toplam protein verim farklılıkları için hesap için kullanılabilir. Bu denklem bir örnek içinde bireysel proteinlerin göreli bereket belirler ve iki farklı deneysel koşullar içinde (karşılaştırma giriş viral genom (örneğin, vDNA farklı miktarda saflaştırılmış doğrudan karşılaştırma sağlar Şekil 1A) genleri (şekil 1B) çoğaltılan).
Protein zenginleştirme verileri sunmak için birden çok yolu vardır. Bazı örnekler pasta grafikleri, Venn diyagramları ve protein etkileşim ağları içerir. Pasta grafikler biyolojik belirli bir işlemde (şekil 5A) çalışması için bilinen tespit protein oranını göstermek için kullanılabilir. Ne zaman bir protein genellikle birden fazla biyolojik işlevi vardır ancak, sorunlar ortaya çıkabilir. Farklı pasta grafikleri arasında verileri karşılaştırmak zordur. Venn diyagramları farklı deneysel koşullar altında tanımlanan proteinler arasındaki ilişkileri göstermek yararlıdır, ancak tespit proteinler (şekil 5B) hakkında fonksiyonel herhangi bir bilgi vermeyin. Protein etkileşim ağları saptanan proteinler arasındaki olası etkileşimlerin bir görsel illüstrasyon tasvir ve biyolojik süreçler türleri hakkında bilgi sağlar (şekil 5C) dahil. Birkaç online kaynaklar tahmin edilen protein-protein etkileşimler DİZESİ (alma, etkileşim genler/proteinler için arama aracı)30da dahil olmak üzere eşlemek için kullanılabilir. Online Araçlar genellikle proteomik verileri türleri çeşitli işleme ve ana bilgisayar proteinler viral genom mekaniği yer hakkında değerli bilgiler sağlamak için donatılmıştır. Ancak, viral proteinler genelde analiz karmaşık hale getirebilir veritabanlarında dahil değildir. Bu nedenle, bir karar vermek proteomik verileri sunmak nasıl ifade etmek istiyorum büyük sonuçlar dikkate almak önemlidir.
Resim 1:Ong > Etiket HSV-1 DNA yaklaşımlar. (Agelen virüs, MRC-5 dinlenme durumunu tahlil etmek) G0 hücrelerde prelabeled HSV-1 ile enfekte ve genleri çoğaltılmamış viral DNA çalışmaya 4 HPI denetlesinler. (Durumunu tahlil için,B) virüs yinelenmiş, MRC-5 hücreleri etiketlenmemiş HSV-1 ile bulaşmış ve EdC (turuncu yıldız) enfekte hücreleri büyüme ortamına eklenen ve 2-4 h için viral DNA ikileşmesi (≥4 HPI) başlangıcından sonra inkübe. (Viral çoğaltma çatal, tahlil,C) enfekte hücreleri 5-20 dk. çoğaltma çatal sonra deoxyC ile takip için EdC ile etiketli darbe vardır. EdC DNA etiketli turuncu olduğunu. Bu rakam Dembowski ve DeLuca25değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: DNA analizi EdC etiketli için bu makalede açıklanan yordamlar. (A) bir yöntemin görüntüleme için EdC DNA etiketli. Tagged DNA yeşille temsil edilir. (B) bir yöntemin arıtma ve EdC bir aşağı akım analizi vDNA etiketli. Bu rakam Dembowski ve DeLuca25değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: EdC görselleştirme etiketli DNA'sı. Hücreleri enfekte, etiketli ve şekil 1 ' de açıklandığı gibi yansıma ve Şekil 2. Etiketli hücresel ve viral DNA'ın temsilcisi görüntüleri gösterilir. Hücresel DNA Höchst leke ve vDNA ICP4 ile colocalizes. Ölçek çubuğu: 5 µm.This şekil Dembowski ve DeLuca25 ve Dembowski ve ark. değiştirildiği 26. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Temsilcisi protein saflaştırma sonuçları. (A)karşılaştırma protein verim arıtma adımları birkaç farklı türde streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak yapılmıştır. Enfeksiyon varlığında protein verim karşılaştırmak için EdC (+) veya arka plan bağlayıcı karşılaştırmak için EdC (-) yokluğunda gerçekleştirilmiştir. Enfeksiyonlar ve EdC etiketleme şekil 1B adımında açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir ve DNA-protein kompleksleri karşılaştırılabilir streptavidin kaplı boncuk farklı miktarda kullanarak şekil 2B içinde anlatılan adımları göre saf. Üst panel: özel boncuk veya Streptavidin M-280 arıtma üzerinde streptavidin kaplı sonra protein verim karşılaştırılması. Alt paneli: karşılaştırma protein verim arıtma üzerinde Streptavidin M-270, sonra M-280, Streptavidin C1 veya Streptavidin T1. Western Blot viral protein ICP4 karşı antikor ile gerçekleştirilmiştir. Saf ICP4 karşılaştırma için ilk şerit gösterilir. Uzun pozlama alt panelin ICP4 benzer bir yoğunluk Lanes "280" üst panel olduğu gibi gözlemlemek için gerekli oldu. (B) temsilcisi protein arıtma sonuçları EdC etiketleme, zamanın bir fonksiyonu olarak gösterilir. Enfeksiyonlar ve EdC etiketleme şekil 1B adımında açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir ve DNA-protein kompleksleri Streptavidin T1 boncuk kullanarak şekil 2B içinde anlatılan adımları göre saf. EdC etiketleme 0, 20, 40, veya 60 dk ve Coomassie (üst) Boyama mavi için yapılmıştır ve western Blot (alt) sonuçları gösterilir. Western Blot belirli antikorlar ile ICP4, UL42 veya GAPDH için gerçekleştirilmiştir. Eluate örnek--dan adım 3.5.5 çekildi. ve lysate--dan adım 3.3.6. L protein merdiven gösterirken ok streptavidin, gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Örnekleri proteomik verileri sunmak için farklı yolları. (A)pasta grafikler özetlemek proteinler viral genom 6 HPI saf ilişkili protein eluates kütle spektrometresi tarafından tespit edilmiştir. Değerleri işlev her kategori için tanımlanan proteinler sayısını gösterir. T tespit proteinler toplam sayısını gösterir. Renkleri belirtmek aşağıdaki Kategoriler: Kromatin remodeling, turuncu - DNA ikileşmesi, sarı - nükleer taşıma, deniz mavisi - sitoiskeleti, koyu mavi - HSV yapısal proteinler ve gri - diğer/bilinmeyen - RNA işlenmesi, kırmızı - transkripsiyon, yeşil - mor. (B) Venn diyagramları tasvir proteinler viral genom 6, 8 veya 12 HPI ile ilişkilendirilmesi için tanımlanan çakışma. (C) A dize eşlemesi proteinler viral çoğaltma çatal üzerinde 5 dk sonra EdC darbe zenginleştirilmiş göstermektedir. 5-fold zenginleştirilmiş insan proteinler ile karşılaştırıldığında etiketlenmemiş negatif kontrol dize30 sadece yüksek güven etkileşimlerini görüntülemek için veri ayarları kullanılarak oluşturulan fonksiyonel etkileşim harita içinde gösterilir. Gene adları etkileşimleri eşlemek için kullanılmıştır. Daireler proteinler o işlev içinde aynı biyolojik süreci gösterir. Bu rakam25 Dembowski ve DeLuca ve Dembowski ve ark. güncellenmiştir 26. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı, değilse dikkatle takip önemli ölçüde azaltılmış protein verim veya kirlenme hücresel DNA ile sonuçlanabilir birden çok adım içerir. Bu sabit hücre hücresel DNA etiketli saf ve değil emin olmak için tüm deneyler için kullanılır önemlidir. HSV-1 genomu sentez için hücresel DNA polimeraz kullanmaz çünkü bu hücresel DNA polimerazlar protein örnek yokluğunda tarafından onaylanabilir. EdC etiketleme ve çekirdekleri adımları hasat sırasında örnekleri her eşit işlenir emin olmak için sendeleyerek. Arıtma adımları sırasında çekirdeği çok fazla pipetting tarafından işlemek değil için özen gösterilmelidir. Bu çekirdekler yanı sıra damlalıklı ipuçları taraf için anlaşmazlık nedeniyle örnek kaybı erken lizis yol açabilir. Ayrıca, sonication adım bireysel sonicators için optimize edilmiş ve streptavidin kaplı boncuk biotin bağlama için kullanılan miktarı en iyi protein verimini titre.
Birkaç değişiklikleri bu iletişim kuralı için yapılan ve bir adım crosslink protein DNA için ek veya farklı virüs veya hücre tipleri kullanımını içerir. Proteomik soruşturma için kullanmak için bir hücre tipi seçerken, bu türler için protein sıra veritabanının kullanılabilirliğini denetlemek önemlidir. Proteomik kaynak yetersizliği protein veri akış aşağı analizi önemli ölçüde sınırlayacaktır. Başka bir sınırlama çok sayıda hücre için ihtiyaç vardır, bu nedenle nöronlar gibi yeterli Primer hücre bu deneme için hazırlamak zor olabilir. Viral enfeksiyon hücresel DNA ikileşmesi bağlı değildir sürece bu yöntem diğer DNA veya RNA virüsleri ile uyumlu olmalıdır. Ayrıca, HSV-1 mutantlar oluşan DNA-protein etkileşimleri değişiklikleri keşfetmek için ilginç olabilir. Bu iletişim kuralı için başka bir değişiklik daha sıkı yıkama koşulları için arıtma21sırasında izin verecek çekirdek yalıtım önce formaldehit crosslinking adım ek olabilir. Formaldehit ek çekirdek hasat yeteneği etkilemez ancak düşük protein verim içinde zor Glossar protein elüsyon sırasında ters çevirerek nedeniyle neden olabilir.
Bu iletişim kuralı sonuçlarından viral DNA muayene ediliyor ortalama durumunu temsil eder. Bu nedenle, kompleksleri, birlikte aynı veya ayrı DNA molekülleri olup olmadığını ayırt etmek zordur. vDNA yöntem tanımlamak burada yüksek kararlılık düşsel ile birlikte etiketleme proteomik verileri doğrulamak için kullanılan ve hücre içindeki etiketli DNA'ın farklı popülasyonlar arasında ayırt etmek için yardımcı olabilir. Ayrıca, ChIP-seq yöntemi bir takip olarak proteinler viral genom üzerinde belirli konumlarını tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu yazının hazırlanmasında yardım için Hannah Fox anıyoruz. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01AI030612 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
