Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist um zu isolieren, Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) DNA aus infizierten Zellen für die Identifizierung von verbundenen viralen und zelluläre Proteinen durch Massenspektrometrie. Obwohl die Proteine, die Interaktion mit viraler Genome Hauptrollen in den Ausgang der Infektion spielen, war eine umfassende Analyse des Virusgenoms verbundenen Proteine nicht früher möglich. Hier zeigen wir eine Methode, die die direkte Reinigung von HSV-1 Genomen von infizierten Zellen ermöglicht. Virale DNA Replikation wird selektiv mit NUK gekennzeichnet, die eine Alkinen funktionelle Gruppe enthalten. Beschrifteten DNA wird ausdrücklich und unwiderruflich beschriftet über die kovalente Befestigung der Biotin-Azid über ein Kupfer (I)-Azid-Alkinen Cycloaddition oder Klick Reaktion katalysiert. Biotin-markierten DNA wird auf Streptavidin beschichteten Perlen gereinigt und damit verbundenen Proteine sind eluiert und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode ermöglicht die selektive Ausrichtung und Isolierung von HSV-1-Replikation Gabeln oder ganzer Genome von komplexen biologischen Umgebungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassung dieses Ansatzes zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der herpesviral Infektion, sowie die Prüfung der Genome von anderen DNA-Viren.
Introduction
Viren haben eine begrenzte Kapazität zur Durchführung von wesentlichen Funktionen und hängt daher Host Faktoren, kritische Aspekte einer Infektion wie virale Genexpression, Replikation, Reparatur, Rekombination und Transport zu erleichtern. Die Aktivitäten dieser Host Faktoren werden oft durch Viral kodierten Proteine ergänzt. Darüber hinaus müssen Viren Erkennung und Störungen durch zelluläre Reaktionen auf virale Infektion vermeiden. Virus-Wirt Interaktionen bestimmen daher das Ergebnis einer Infektion. Von größter Bedeutung ist das Verständnis wie Viren verändern die zelluläre Umgebung anpassen der zelluläre Maschinerie um virale Prozesse zu vereinfachen. Von besonderes Interesse ist die Ermittlung viraler Genome während des ansteckenden Zyklus welche Faktoren und Prozesse einwirken.
Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) ist eine doppelte DNA-Virus gestrandet, die einen wesentlichen Teil der menschlichen Bevölkerung infiziert. Innerhalb der ersten Stunde der Infektion tritt das virale Genom den Zellkern, wo erfolgt eine geordnete Kaskade der viralen Genexpression in Abstimmung mit der viralen DNA (vDNA) Replikation1. Im Zellkern Genome epigenetische Regulierung unterliegen, Reparatur und Rekombination zu unterziehen und in Capsids, verpackt sind, so dass die ersten Nachkommen Virionen innerhalb von weniger als sechs Stunden produziert werden. Die umfassende Auswertung des Virusgenoms verbundenen Proteine im Laufe der Infektion bilden die Grundlage um die molekularen Details der Prozesse zu untersuchen, die auf virale Genom, und bieten einen Einblick in die viralen und zellulären Faktoren engagieren sich in verschiedenen Stadien der Infektion.
Bisherige Methoden zur Untersuchung von Host Faktoren bei der Virusinfektion sind Affinitätsreinigung von viralen Proteinen für die Analyse der damit verbundenen zellulären Proteinen2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. diese Tests wurden für die Identifizierung von zellulären Faktoren maßgeblich Host antivirale Reaktionen sowie virale Chromatin Modifikation, Genexpression, und DNA zu reparieren. Allerdings ist es schwierig, festzustellen, ob Interaktionen richten sich nach der Vereinigung mit vDNA und Proteomics nur Einblick in die Interaktionen, die in Abhängigkeit von den spezifischen viralen Faktor auftreten. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde verwendet, um ermitteln, wo bestimmte virale und zelluläre Proteine binden an viralen Genomen10,11,12,13,14 , 15 und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) kombiniert mit Immunocytochemistry ermöglichte die Visualisierung von zellulären Faktoren, die mit vDNA16,17,18, colocalize 19 , 20. diese Assays für die räumliche und zeitliche Analyse zu ermöglichen. Einschränkungen enthalten jedoch die Notwendigkeit hochspezifische Antikörper, begrenzte Empfindlichkeit und die Notwendigkeit einer vorherigen Einblick in Virus-Wirt-Interaktionen. Daher entwickelten wir eine Methode basiert auf iPOND (Isolierung von Proteinen auf die entstehenden DNA)21 und AniPOND (beschleunigte native iPOND)22 selektiv beschriften und reinigen vDNA aus infizierten Zellen für die unvoreingenommene Identifizierung des viralen Genoms damit verbundenen Proteine durch Massenspektrometrie. iPOND hat für die Untersuchung der zellulären Replikation Gabel Dynamik beigetragen.
Für die selektive Reinigung von viraler Genome von infizierten Zellen repliziert vDNA Ethynyl geändert Nukleoside, 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxycytidine (EdC) (Abbildung 1), gefolgt von kovalenten trägt Konjugation, Biotin-Azid über Klicken Sie Chemie, Einzelschritt Reinigung des viralen Genomen und damit verbundenen Proteine auf Streptavidin beschichteten Perlen (Abb. 2 b) zu erleichtern. Wichtig ist, sind Infektionen in stationären Zellen durchgeführt die nicht in der zellulären DNA-Replikation tätig sind, ermöglichen spezifische Kennzeichnung des vDNA. Des weiteren HSV-1 Infektion verursacht Zellzyklus Festnahme und hemmt zelluläre DNA-Replikation23,24. Virus können prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden viraler Genome (Abbildung 1A) oder beschriftet während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b) zugeordnet werden 25. Darüber hinaus Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. Darüber hinaus kann Ethynyl geändert vDNA kovalent an ein Fluorophor für räumliche Untersuchung von Proteindynamik (Abb. 2A und Abbildung 3) konjugiert werden. Bildgebung ermöglicht die direkte Visualisierung des vDNA ist ein kostenloses Ansatz für die Validierung des vDNA-Protein-Interaktionen und lässt sich anpassen, virale Genome während Infektion zu verfolgen. Wir erwarten, dass diese Ansätze weiter geändert werden, könnten um jeden Aspekt der herpesviral Infektion, einschließlich Latenz und Reaktivierung, zu studieren und andere DNA-Viren zu studieren. Darüber hinaus könnte Etikettierung mit 5-Ethynyl Uridin (EU) für die Analyse der viralen RNA-Genome ermöglichen.
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Protocol
1. Zellkultur, Virusinfektion und EdC Beschriftung ( Abbildung 1)
das folgende Protokoll schließt die Arbeit mit Viren. Entnehmen Sie bitte Ihrer Institution ' s Bio-Sicherheit Protokolle für sichere Handhabung von Viren und anderen biologischen Arbeitsstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board von der University of Pittsburgh genehmigt.
- Trypsinize eine konfluierende 150 cm 2 Gewebekultur Flasche MRC-5 Zellen und übertragen Sie die Zellen auf einer 600 cm 2 Gewebekultur Teller mit 100 mL DMEM plus 10 % FBS. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2 für 3-4 Tage, confluency und stationäre Phase zu erreichen. Ein konfluierende 600 cm 2 Teller enthält ~ 7 x 10 7 Zellen. Bereiten Sie 1 Platte für jede Kondition und 1 Platte für jede entsprechende Negativkontrolle.
Hinweis: Zellen die stationäre Phase um hemmen zelluläre DNA-Replikation, um sicherzustellen, dass nur vDNA ist beschriftet und in den nachfolgenden Schritten gereinigt erreichen müssen.
Hinweis: Jede Probe erfordert ein kostenloses unmarkiertem Negativkontrolle vorbereitet, mit dem gleichen Infektionsbedingungen und Zeitpunkt ohne Zusatz von EdC.
Hinweis: A verkleinerte Version von diesem Experiment sollte durchgeführt werden parallel zum Testen für die Kennzeichnung der zellulären DNA durch Bildgebung mit vergleichbaren Zellwachstum, Infektion, EdC, die Bedingungen, zu beschriften und Zeitpunkten (siehe Schritt2). - Verdünnen, 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL kalte Tris-Buffered Kochsalzlösung (TBS). Entfernen Sie Wachstumsmedium und Lagern bei 37 ° C. Zu infizieren, MRC-5 Zellen 7 mL verdünnten Virus hinzu und rock für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach Adsorption Inokulum zu, spülen Sie mit 50 mL Raumtemperatur TBS und ersetzen Sie die ursprüngliche Wachstumsmedium. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2. Dieser Schritt sollte für jede Versuchsbedingung und negativ-Kontrolle durchgeführt werden.
Hinweis: Erhöhte EdC Kennzeichnung lässt sich mit HSV-1 Mutanten defekt für die Expression der viralen dUTPase (UL50-gen) bzw. Uracil Glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase hat geringe Substratspezifität und die Aktivierung von mehreren Nukleosid-Analoga 25 , 27 verringern kann. - Label viraler Genome mit EdC. Folgen Sie den Anweisungen um eingehende Genome (1.3.1), Replikation Genome (1.3.2.) oder virale Replikation Gabeln (1.3.3.) zu beschriften.
Hinweis: Nur Schritt 1.3.1 und 1.3.2 1.3.3 sollte erfolgen, je nachdem, ob eingehende Genome, replizierte Genomen oder Replikation Gabeln in den nachfolgenden Schritten bzw. analysiert werden.
Hinweis: EdU oder f-Ara-EdU kann für EdC ersetzt werden. Die Toxizität von Nukleosid-Analoga sollten überwacht und minimiert werden.- Verwendung prelabeled Bestände, Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen und fahren mit Schritt2 oder 3 innerhalb von 4 Stunden buchen (Hpi) Infektion untersuchen Langzeittransaktionen vDNA ( Abbildung 1A).
Hinweis: Bereiten Sie Aktien mit der zuvor beschriebenen Protokoll 25 prelabeled Virus. Virus Bestände müssen durchlaufen eine G-25 Spalte entfernen Rückstände EdC. - Label replizierende vDNA durch Zugabe von 5-25 µM EdC, Zellkulturmedium infizierter Zellen für 2-4 h ( Abbildung 1 b). Bevor Sie hinzufügen, verdünnen EdC in 1 mL Wachstumsmedium.
- , Virale Replikation Gabeln, nach Beginn der vDNA Replikation zu kennzeichnen (≥ 4 Hpi), Puls-Label replizieren vDNA mit 5-25 µM EdC für 5-20 min. Um zu jagen, 3 X mit Chase 25-100 µM 2´deoxycytidine-haltigem Medium spülen (DeoxyC) und inkubieren Sie in Anwesenheit von Chase Medium für eine zusätzliche 20-40 min ( Abbildung 1).
Hinweis: Puls und Chase Medium sollte auf 37 ° C und 5 % CO 2 vor Gebrauch equilibriert.
Hinweis: Für Puls-Chase-Experimente ist es wichtig, die Zeitspanne zu berücksichtigen braucht es für Nukleoside, geben die Zelle und phosphoryliert werden, bevor sie in die Replikation von DNA integriert werden können. Dies muss empirisch ermittelt werden.
Hinweis: Um die Auflösung der Puls Chase Experimente zu ermitteln, berechnen Sie die virale Replikation Rate unter den experimentellen Bedingungen verwendet. Dies kann durch quantitative PCR viral Genome bestimmt werden, in einem einzigen Schritt Wachstum Zeit Kurs 26.
Hinweis: Für imaging-viraler Genome gehen Sie zu Schritt2 und für die Reinigung von viralen Genomen fahren Sie mit Schritt 3.
- Verwendung prelabeled Bestände, Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen und fahren mit Schritt2 oder 3 innerhalb von 4 Stunden buchen (Hpi) Infektion untersuchen Langzeittransaktionen vDNA ( Abbildung 1A).
2. Bildgebung des EdC gekennzeichnet DNA ( Abbildung 2A)
Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie Bildgebung im Tandem mit der virale Genom-Reinigung-Methode um sicherzustellen, dass zelluläre DNA in Experimenten nicht beschriftet ist. Bildgebung kann auch verwendet werden, die Natur der beschrifteten vDNA visualisieren und Proteomics Daten validiert. Beispiele für zelluläre und virale DNA Färbung Muster sind in Abbildung 3.
- Infektionen durchzuführen und EdC Kennzeichnung wie in Schritt 1 außer angegeben Bedingungen auf Deckgläsern in eine 12-Well-Zellkultur-Schale mit 1 mL Wachstumsmedium verkleinert.
- Fix Zellen mit 1 mL 3,7 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 15 min bei RT Nach der Fixierung, Zellen spülen 2 X mit 1 mL 3 % BSA in PBS.
Achtung: Paraformaldehyd kann ernsthafte oder dauerhafte Schäden verursachen. Sicherheitsvorkehrungen zu folgen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Deckgläsern können bis zu 3 Tage bei 4 ° C in der zweiten Wäsche gelagert werden. - Permeabilize Zellen mit 1 mL Permeabilisierung Puffer [siehe Tabelle der Materialien] für 20 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.
- Spülen mit 1 mL 3 % BSA und dann Block mit 1 mL 3 % BSA mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.
- Fügen Sie 1 mL der Klick Reaktion cocktail [siehe Tabelle der Materialien] auf Deckgläsern kovalent Alexa Fluor 488 konjugieren Azid, EdC gekennzeichnet DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.
- Fleck zelluläre DNA mit 1 mL einer 1:2,000 Verdünnung von Hoechst mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS. Indirekte Immunfluoreszenz
- Fleck mit primären und sekundären Antikörper nach Standard Protokolle 25.
Hinweis: Markierte vDNA colocalizes mit ICP8, ICP4 oder UL42 und mit der Bezeichnung zelluläre DNA mit Hoechst-Fleck colocalizes. - Montieren Deckgläsern auf Folien und image-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Hinweis: Dias können bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
3. Reinigung des vDNA und verbundenen Proteine
Hinweis: verschiedene Aspekte dieses Protokolls wurden angepasst von Leung Et Al. 22
Hinweis: alle Puffer und Reagenzien sollten auf dem Eis vor Gebrauch gekühlt werden und alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Kerne ernten.
Hinweis: Vor der Isolation der Kerne, kann Formaldehyd an Crosslink Proteine, DNA verwendet werden. Strengere waschen Bedingungen können dann während der DNA-Reinigung auf Streptavidin beschichteten Perlen verwendet werden. Für crOsslinking und waschen Bedingungen siehe Sirbu Et al. 21.- ersetzen Wachstumsmedium mit 20 mL Extraktionspuffer Kerne (NEB) und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C mit gelegentlichen Schaukeln. Kerne werden im Mikroskop sichtbar werden.
- Kerne von der Platte mit einem Schaber Zelle zu kratzen und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C zu pellet-Kerne, den Überstand verwerfen.
Hinweis: Trypan Blaufärbung verwendet werden, kann um die Isolierung von Kernen von Zellen prüfen. - Sanft das nukleare Pellet in 10 mL PBS, Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr zu verdrängen und pellet durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS.
Hinweis: Kerne können eingefroren werden und das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Dazu sanft Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 500 µL Einfrieren zu puffern und inkubieren Sie das Rohr im Eisbad Ethanol/trocken. Speichern Sie gefrorene Kerne bei-80 ° C. Vor Gebrauch Kerne bei Raumtemperatur auftauen, schnelle Übertragung von Eis, fügen Sie 10 mL PBS, Rock sanft zu mischen, durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C, pellet und PBS vollständig zu entfernen. Einfrieren von Kernen ertragsreduzierten führen kann.
- Kovalent conjugate Biotin-Azid, EdC beschriftet vDNA.
- Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 10 mL Klick Reaktion [siehe Tabelle der Materialien] durch Mischen sanft auf und ab pipettieren 5 Mal mit einer 10 mL pipettieren.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Reagenzien in der Klick-Reaktion-Mix enthalten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden. - Für 1h bei 4 ° c drehen Während der Drehung vorzubereiten und chill Puffer B1, B2 und B3 [siehe Tabelle Material].
- Pellet Kerne durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen klicken Sie auf Reaktion Mischung und waschen das Pellet durch sanft resuspending in 10 mL PBS und Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c
- Aufschwemmen sanft die nukleare Pellet in 1 mL PBS und den Transfer zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch mit einem großkalibrigen Pipettenspitze. Pellet-Kernen durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und gefrorene Kerne können bei-80 ° c Einfrieren Auftauen hilft bei nachfolgenden Lyse gelagert werden, so ist es empfehlenswert, dass Kerne flash eingefroren werden, auch wenn am selben Tag auf Schritt 3.3 ausgehend.
- Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 10 mL Klick Reaktion [siehe Tabelle der Materialien] durch Mischen sanft auf und ab pipettieren 5 Mal mit einer 10 mL pipettieren.
- Lyse Kerne und DNA-fragment.
- Kerne auf Eis auftauen und Aufschwemmen in 500 µL Puffer B1 durch Pipettieren rauf und runter. Inkubation auf Eis für 45 min.
- Sonicate Proben 6 Mal für 30 s bei 40 % Amplitude mittels 3 mm Microtip Sonde. Legen Sie Proben auf Eis für 30 s zwischen den Pulsen. Nach Beschallung, Proben erscheinen sollte, klar, nicht bewölkt.
Hinweis: Für individuelle Ultraschallgeräte sollte Beschallung Bedingungen optimiert werden. Eine ausführliche Anleitung zur Optimierung der Beschallung Bedingungen beziehen sich auf Leung Et al. 22. - pellet-Zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Die Pellets sollten deutlich verkleinern. Den Überstand durch 100 µM Zelle Sieb filtern und behalten die Durchströmung.
- Hinzufügen 500 µL Puffer B2, die gefilterte überstand. 900 µL dieses Beispiels wird im Schritt 3.4.2 verwendet werden.
- Nehmen eine aliquote jede Bedingung für die DNA-Isolierung (50 µL oder 1/20 Volumen) und fügen Sie 50 µL 2 x SDS-Bicarb Lösung [siehe Tabelle der Materialien]. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).
- Nehmen eine aliquote jeder Bedingung für Eingabe Protein (50 µL oder Volume 1/20) und 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer hinzufügen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° c Verwendung in Schritt 3.5.6.
- Bind biotinylierte DNA zu Streptavidin beschichteten Perlen.
- Bereiten Streptavidin T1 magnetische Beads von 300 µL der Wulst Gülle auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen. Bereiten Sie eine Tube Perlen pro Probe. Wash Perlen 3 X mit 1 mL Puffer B2 durch Vortexen, Aufschwemmen, anwenden ein Magneten um die Perlen zu trennen und Absaugen der Waschpuffer.
Hinweis: Optimiert verbindliche Bedingungen führen zu maximaler Ertrag und minimaler Hintergrund verbindlich. Es wurde experimentell festgestellt, dass Streptavidin T1 magnetische Beads eine deutlich höhere Bindungskapazität als Agarose Korne, sowie andere Streptavidin-Perlen und haben weniger Hintergrund verbindlich als Streptavidin C1 Perlen ( Abbildung 4A ). - Fügen Sie 900 µL Probe aus Schritt 3.3.4. die gewaschenen Perlen und drehen über Nacht bei 4 ° c
Hinweis: Verwenden Sie nicht Wirbel Perlen einmal Probe hinzugefügt wird.
Hinweis: Wenn erhebliche Mengen von DNA oder Protein in die unbeschriftete Negativkontrolle isoliert sind, dieser Schritt reduziert werden von Übernachtungen bis 4 h, Hintergrund Bindung zu reduzieren.
- Bereiten Streptavidin T1 magnetische Beads von 300 µL der Wulst Gülle auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen. Bereiten Sie eine Tube Perlen pro Probe. Wash Perlen 3 X mit 1 mL Puffer B2 durch Vortexen, Aufschwemmen, anwenden ein Magneten um die Perlen zu trennen und Absaugen der Waschpuffer.
- Waschen Perlen und vDNA und damit verbundenen Proteine eluieren.
Hinweis: Es wird empfohlen, Filter-Tips für die verbleibenden Schritte zu verwenden.- Ort-Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, entfernen überstand, Aufschwemmen sanft in 1 mL Puffer B2, drehen bei 4 ° C für 5 min.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5.1 dreimal.
- Die Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, überstand zu entfernen, sanft in 1 mL Puffer B3, Aufschwemmen und drehen bei 4 ° C für 5 min.
- Transfer 100 µL Perle Mischung (1/10 th Volumen), eine neue Röhre für gebundene DNA-Isolierung. Gelten diese Röhre für den Magneten, überstand zu entfernen, Perlen in 100 µL 1 x SDS-Bicarb Lösung Aufschwemmen und fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).
- Gelten die Röhrchen mit den restlichen 900 µL Perle Mischung aus Schritt 3.5.3. an den Magnet entfernen überstand und Aufschwemmen Perlen in 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer auf Protein- und DNA-Protein-komplexe eluieren.
- Kochen Proben bei 95 ° C für 15 min, Wirbel, schnell in der Microfuge spin, und Magnet. Eluat zu übertragen, um eine neue Röhre, Flash-Einfrieren und bei-80 ° c
Hinweis: Verwendung Kappe Schlösser um sicherzustellen, dass die Rohre nicht pop öffnen während des Kochens.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und Proben können für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden. - Analysieren Proteinproben Coomassie blaue Färbung, westliche Beflecken oder Massenspektrometrie von Standardverfahren 25. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt.
Hinweis: Um festzustellen, ob Proteinausbeute für Massenspektrometrie ausreicht, 7,5 µL jeder Probe dient zur Analyse von Coomassie blaue Färbung und 7,5 µL für das westliche Beflecken eines repräsentativen viralen Genoms verbundenen Protein (ICP4, ICP8 oder UL42). Das gleiche Volumen von Lysaten von Schritt 3.3.6. Neben Steuern für Eingabe Protein-Ebene ausgeführt werden. Die restlichen Probe (35 µL) wird dann analysiert, durch Masse Spektrometrie wie zuvor beschrieben 25.
- DNA-Isolierung
- inkubieren Sie die Proben aus Schritte 3.3.5. und 3.5.4. bei 65 ° C für 4-16 h. entfernen probieren von magnetischen Beads, wenn nötig.
- Proben mit 150 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (PCI) zu extrahieren und die wässrige Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.
- Extrahieren den verbleibenden PCI mit 100 µL Tris-EDTA (TE) und einen neuen Schlauch der wässrigen Phase hinzu.
- Extrahieren Proben mit 200 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol (24:1).
- Reinigen die wässrige Phase mit dem PCR-Reinigung-Kit nach Angaben des Herstellers ' s Protokoll.
Hinweis: Die pH-Indikator im Puffer PB schaltet lila, wenn die Probe hinzugefügt. Fügen Sie 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5,0 bis den pH-Wert der Probe zu verringern. - Bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
Hinweis: Dieses Protokoll liefert in der Regel 100-400 ng Wulst-gebundene DNA. Keine DNA sollte erkannt werden, in das Eluat die negativ-Kontrolle in der EdC war nicht in Schritt 1.3 hinzugefügt. - DNA kann gespeichert werden, in einer niedrigen DNA-Bindung Rohr bei 4 oder -20 ° C und eignet sich für Real-Time PCR oder Hochdurchsatz-Sequenzierung Analyse.
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Representative Results
Die Verwendung von Klick-Chemie zur Reinigung von DNA aus Zellen wurde zuerst durch die iPOND Methode21erreicht. IPOND soll zellulären Replikation Gabeln für die Identifizierung von assoziierten Proteinen zu reinigen. Wir haben diese Technik, um speziell vDNA-Protein-Interaktionen während der Infektion studieren angepasst. Manipulation des Ansatzes für die virale Genome mit EdC (Abbildung 1), kombiniert mit synchronisierten Infektionen zu beschriften hat für die selektive Isolierung und Untersuchung der getrennten Populationen des vDNA erlaubt. HSV-1-DNA wird mit EdC (Abbildung 1) Erleichterung der kovalenten Bindung an ein Fluorophor für die Bildgebung oder Biotin für die Reinigung (Abbildung 2) gekennzeichnet. Virus kann prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden Genome (Abbildung 1A) oder mit der Bezeichnung während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b)25zugeordnet. Darüber hinaus kann Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. DNA kann in den Zellen für identifizierte vDNA-Protein-Interaktionen (Abbildung 3) räumliche Informationen über die Art der beschrifteten DNA und Unterstützung zu visualisiert werden. Zusammengenommen lassen die hier beschriebenen Protokolle für die Proteomik Untersuchung mehrere Aspekte des produktiven Infektion Einblick in die dynamischen Veränderungen, die auftreten, auf HSV-1 Genome. Diese Ansätze könnte weiter angepasst werden, um Latenz und Reaktivierung, Zusammenhang mit viralen Mutanten Phänotypen zu untersuchen und andere DNA- und RNA-Viren zu studieren zu untersuchen.
Aspekte dieser Protein-Reinigung-Methode wurden von Leung Et al.angepasst. 22. hier eine wesentliche Verbesserung für die Reinigung von EdC DNA beschriftet ist die Verwendung von Streptavidin T1 Perlen statt Streptavidin beschichteten Agarose Korne. Zur Optimierung der DNA Reinigung wurden mehrere Arten von Streptavidin beschichteten Perlen für unspezifische Bindung getestet, wenn Infektion in der Abwesenheit von EdC und für maximale Proteingewinnung in Anwesenheit von EdC (Abb. 4A) durchgeführt wurde. Für diese Untersuchungen wurde die westliche Beflecken für vDNA-Bindeprotein ICP4 durchgeführt. Reinigungen an Streptavidin T1 Perlen die geringste Menge an Hintergrund-Bindung in der Abwesenheit von EdC und die maximale Proteingewinnung in Anwesenheit von EdC führte durchgeführt.
Zugeordnete vDNA Proteine können durch Proteomik Methoden einschließlich westliche Beflecken und Massenspektrometrie identifiziert werden. Westliche Beflecken kann verwendet werden, um die Dynamik des bekannten Wechselwirkungen zu untersuchen und Massenspektrometrie kann als eine unvoreingenommene Ansatz verwendet werden, um neuartige vDNA verbundenen Proteine zu identifizieren. Ein Beispiel des Proteins führen wie eine Funktion der zunehmenden EdC Beschriftung in Abbildung 4 bdargestellt ist. Ein Abstrich, anstatt eine klare Bandenmuster wird in der Regel von Coomassie blaue Färbung beobachtet. Dies ist wahrscheinlich, weil es DNA in der Protein-Probe gibt oder gibt es eine Fülle von Protein. Es ist auch wichtig zu beachten, dass der Kupfer Katalysator verwendet in der Klick-Reaktion Teilabbau von Proteinen und Nukleinsäuren28,29verursachen kann. Durch westliche Beflecken, sind ähnliche Niveaus der ICP4 in der Regel in Eluaten (Schritt 3.5.5.) nach Reinigung des vDNA erkannt, mit der Bezeichnung für 60 min mit EdC als das Geschenk in die gleiche Menge an Eingabesample aus nuklearen Lystates (Schritt 3.3.6) vorbereitet wurde. Diese Informationen können als Leitfaden verwendet werden, um festzustellen, ob Erholung ausreicht, um die restlichen Probe für massenspektrometrische Analyse schicken.
Nano Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) kann durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben25 um Zusammenhang mit gereinigtem vDNA Proteine zu identifizieren. LC-MS/MS-Daten werden durch den Vergleich der spektralen Zählwerte (SpC) zwischen der EdC-Label experimentelle Probe und die entsprechenden unbeschriftete negativ-Kontrolle analysiert. Proteine werden als in der experimentellen Probe anhand der folgenden Kriterien angereichert werden: (1) Protein hat mindestens 5 spektrale zählt (SpC) in die experimentelle Probe, 2) Protein wird im Steuerelement nicht erkannt oder ist die Kontrolle von mindestens vervierfacht angereichert basierend auf Teilung SpC Werte und 3) des Proteins ist die Kontrolle in zwei oder mehrere biologische Wiederholungen bereichert. Der normalisierte spektrale Fülle-Faktor (NSAF: 
) verwendet werden, um Unterschiede im Molekulargewicht (MW) und Gesamt-Protein Ertrag zu berücksichtigen. Diese Gleichung bestimmt die relative Häufigkeit der einzelnen Proteine innerhalb einer Probe und ermöglicht den direkten Vergleich von zwei verschiedenen experimentellen Bedingungen, in denen unterschiedliche Mengen an vDNA (z. B. Eingabe viraler Genome (Vergleich gereinigt werden Abbildung 1A) auf repliziert Genome (Abbildung 1 b)).
Es gibt mehrere Möglichkeiten, Protein angereicherten Daten zu präsentieren. Einige Beispiele sind Kreisdiagrammen, Venn-Diagramme und Protein-Interaktion-Netzwerke. Kreisdiagramme lässt sich den Anteil der Proteine identifiziert zu illustrieren, die bekannt sind, funktionieren in einem bestimmten biologischen Prozess (Abb. 5A). Jedoch können Probleme auftreten, wenn ein Protein hat mehr als eine biologische Funktion, die was oft der Fall ist. Es ist auch schwierig, Daten über verschiedene Kreisdiagramme zu vergleichen. Venn-Diagramme sind nützlich, um Beziehungen zwischen Proteinen identifiziert unter verschiedenen experimentellen Bedingungen unter Beweis stellen, sondern bieten keine funktionelle Informationen über die Proteine identifiziert (Abb. 5 b). Protein-Interaktion-Netzwerke eine visuelle Darstellung der möglichen Wechselwirkungen zwischen identifizierte Proteine zu porträtieren und liefern Informationen über die Arten von biologischen Prozessen, sind beteiligt (Abbildung 5). Mehrere Online-Ressourcen stehen für die Zuordnung von vorhergesagten Proteinprotein Interaktionen einschließlich STRING (Such-Tool für den Abruf der Interaktion Gene/Proteine)30. Online-Tools sind in der Regel zu handhaben Proteomics-Daten aus einer Vielzahl von Arten und liefern wertvolle Informationen über Host-Proteinen, die in der virale Genom Mechanik ausgestattet. Virale Proteine sind jedoch in der Regel nicht in Datenbanken enthalten die Analyse erschweren können. Daher ist es wichtig, die wichtigsten Schlussfolgerungen zu betrachten, die man bei der Entscheidung, wie Sie Proteomics Daten präsentieren zu vermitteln möchte.
Abbildung 1:Ong > Ansätze zur Bezeichnung HSV-1 DNA. (A), um den Zustand der eingehenden Virus ruht MRC-5 assay Zellen in G0 prelabeled HSV-1 infiziert sind und Genome sind bei weniger als 4 Hpi, Langzeittransaktionen virale DNA Studie untersucht. (B), um den Zustand der assay Virus repliziert, MRC-5 Zellen mit unbeschrifteten HSV-1 infiziert sind und EdC (orange Sterne) ist das Wachstumsmedium infizierter Zellen hinzugefügt und für 2-4 h nach Beginn der viralen DNA-Replikation (≥4 Hpi) inkubiert. (C), um die virale Replikation Gabeln assay infizierten Zellen sind Puls beschriftet mit EdC für 5-20 min. Replikation Gabeln dann mit DeoxyC gejagt werden können. EdC gekennzeichnet DNA ist Orange. Diese Zahl wurde von Dembowski und DeLuca25geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verfahren in diesem Dokument beschriebenen, für die Analyse von EdC DNA beschriftet. (A) einen Überblick über das Verfahren zur Bildgebung EdC DNA bezeichnet. Tagged DNA wird in grün dargestellt. (B) einen Überblick über die Methode für die Reinigung und nachgelagerte Analyse von EdC beschriftet vDNA. Diese Zahl wurde von Dembowski und DeLuca25geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Visualisierung von EdC gekennzeichnet DNA. Zellen wurden infiziert, beschriftet und bebildert wie in Abbildung 1 beschrieben und Abbildung 2. Repräsentative Bilder von beschrifteten zellulären und virale DNA angezeigt werden. Zelluläre DNA colocalizes mit Hoechst-Fleck und vDNA mit ICP4. Maßstab: 5 µm.This Bild wurde geändert von Dembowski und DeLuca25 und Dembowski Et Al. 26. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Protein Reinigung Ergebnisse. (A) Vergleich der Proteinausbeute beim Reinigungsschritte durchgeführt wurden verschiedene Arten von Streptavidin beschichteten Perlen. Infektion erfolgte im Beisein von EdC (+), Eiweiß-Ertrag zu vergleichen oder in Ermangelung von EdC (-) Hintergrund Bindung zu vergleichen. Infektionen und EdC Kennzeichnung wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 b beschrieben und DNA-Protein-komplexe wurden gemäss der in Figur 2 b mit vergleichbaren Mengen der verschiedenen Arten von Streptavidin beschichteten Perlen beschriebenen Schritte gereinigt. Oberseite: Vergleich der Proteinausbeute nach der Reinigung auf Streptavidin Agarose Korne oder Streptavidin M-280 beschichtet. Bodenplatte: Vergleich der Proteinausbeute nach der Reinigung auf Streptavidin-M-270, M-280, Streptavidin C1 bzw. Streptavidin T1. Westliche Beflecken wurde mit einem Antikörper gegen das virale Protein ICP4 durchgeführt. Gereinigten ICP4 wird auf der ersten Spur zum Vergleich angezeigt. Längerer Exposition der Unterplatte bedurfte, um eine ähnliche Intensität von ICP4 in Gassen "280" wie in der oberen Leiste zu beobachten. (B) repräsentative Protein Reinigung Ergebnisse als Funktion der Zeit der EdC Kennzeichnung werden angezeigt. Infektionen und EdC Kennzeichnung wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 b beschrieben und DNA-Protein-komplexe wurden gemäss der in Figur 2 b mit Streptavidin T1 Perlen beschriebenen Schritte gereinigt. EdC Kennzeichnung erfolgte bei 0, 20, 40 oder 60 min und Coomassie blaue Färbung (oben) und western Blot (unten) Ergebnisse werden angezeigt. Westliche Beflecken wurde mit spezifischen Antikörpern für ICP4, UL42 oder GAPDH durchgeführt. Schritt 3.5.5 wurde die Eluat Probe entnommen. und ab Schritt 3.3.6 lysate. Der Pfeil zeigt Streptavidin, während L Protein Leiter angibt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Beispiele für die verschiedenen Proteomics Daten präsentieren. (A) Kreisdiagramme zusammenfassen Proteine, die durch Massenspektrometrie von Protein-Eluate viraler Genome gereinigt 6 HPI zugeordnet identifiziert wurden. Werte geben die Anzahl der Proteine, die für jede funktionale Kategorie identifiziert. T gibt die Gesamtzahl der Proteine identifiziert. Farben zeigen die folgenden Kategorien: Transkription - RNA Processing, rot - grün - violett, Chromatin remodeling, nukleare Transport - DNA-Replikation, gelb - Orange, Teal - Zytoskeletts, dunkelblau - HSV Strukturproteinen und grau - Sonstiges/unbekannt. (B) Venn-Diagramme zeigen die Überlappung von Proteinen identifiziert, um virale Genome bei 6, 8 oder 12 Hpi zugeordnet werden. (C) A STRING Karte zeigt Proteinen angereichert auf virale Replikation Gabeln nach 5 min EdC Puls. Menschliche Proteine angereichert mit 5-fach gegenüber die unbeschriftete Negativkontrolle erscheinen in der funktionelle Interaktion Karte, die mit STRING-30 mit Dateneinstellungen anzuzeigenden nur hohes Vertrauen Wechselwirkungen erzeugt wurde. Gen Namen wurden verwendet, um Interaktionen zuzuordnen. Kreise zeigen Proteine diese Funktion in der gleichen biologischen Prozess. Diese Zahl wurde von Dembowski und DeLuca25 und Dembowski Et Al. modifiziert. 26. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die wenn nicht sorgfältig befolgt deutlich reduzierten Proteinausbeute oder Kontamination mit zellulären DNA führen können. Es ist wichtig, dass stationäre Zellen für alle Experimente verwendet werden, um sicherzustellen, dass zelluläre DNA nicht beschriftet und gereinigt ist. Dies kann durch das Fehlen der zellulären DNA-Polymerasen in der Protein-Probe bestätigt werden, weil HSV-1 nicht zelluläre DNA-Polymerase für die Genom-Synthese nutzen. Während EdC Kennzeichnung und Kerne ernten Schritte sollten Proben gestaffelt werden, um sicherzustellen, dass jeder gleichermaßen verarbeitet wird. Während Reinigungsschritte sollte darauf geachtet werden, nicht zu Kernen durch zuviel Pipettieren zu manipulieren. Dies kann zu vorzeitigen lyse der Zellkerne sowie Probenverlust durch Festhalten an den Seiten des Pipettieren Tipps führen. Darüber hinaus der Beschallung Schritt sollten für einzelne Ultraschallgeräte optimiert werden und die Menge an Streptavidin beschichteten Perlen für Biotin-Bindung verwendet sollte für optimale Proteinausbeute titriert werden.
Mehrere Änderungen dieses Protokolls vorgenommen werden und umfassen die Verwendung von verschiedenen Viren oder Zelltypen oder das Hinzufügen eines Schrittes zu Crosslink Protein DNA. Bei der Auswahl eines Zelle Typs für Proteomik-Untersuchung ist es wichtig, die Verfügbarkeit einer Protein-Sequenz-Datenbank für diese Art überprüfen. Proteomics Geldmangel wird nachgelagerte Analyse von Protein-Daten erheblich einschränken. Eine weitere Einschränkung ist die Notwendigkeit für eine große Anzahl von Zellen, also es kann schwierig sein, genug Primärzellen, wie Neuronen, für dieses Experiment vorbereiten. Diese Methode sollte kompatibel mit anderen DNA- oder RNA-Viren werden, solange die Virusinfektion nicht von zellulären DNA-Replikation abhängig. Darüber hinaus wäre es interessant zu Veränderungen der DNA-Protein Interaktionen zu erforschen, die in HSV-1 durch Mutation entstehende Variationen auftreten. Eine weitere Änderung dieses Protokolls wäre die Zugabe von Formaldehyd Vernetzung Schritt vor Isolation der Kerne, die strengere waschen Bedingungen während der Reinigung21ermöglichen würde. Die Zugabe von Formaldehyd wird keinen Einfluss auf die Fähigkeit, Kerne ernten aber verminderte Protein Ertrag wegen schwer Rückwärtsfahren Querverbindungen während Protein Elution ergeben kann.
Ergebnisse aus diesem Protokoll repräsentieren den durchschnittlichen Zustand der viralen DNA untersucht. Daher ist es schwierig zu unterscheiden, wenn komplexe zusammen auf der gleichen oder separate DNA-Moleküle sind. vDNA Kennzeichnung in Verbindung mit hochauflösenden Bildgebung hier beschriebene Methoden kann verwendet werden, um die Proteomik-Daten zu überprüfen und kann helfen, um zu unterscheiden zwischen verschiedenen Populationen von beschrifteten DNA in einer Zelle. Darüber hinaus könnte ChIP-Seq als Follow-up Methode verwendet werden, um die spezifischen Standorte der Proteine auf das virale Genom zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bestätigen Hannah Fox für Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH R01AI030612 zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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