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Immunology and Infection

एसोसिएटेड वायरल और सेलुलर प्रोटीन की पहचान के लिए वायरल डीएनए का शुद्धिकरण

Published: August 31, 2017 doi: 10.3791/56374
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विशेष रूप से टैग और चुनिंदा वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए संक्रमित कोशिकाओं से वायरल डीएनए को अलग करने के लिए है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी-1) डीएनए संक्रमित कोशिकाओं से जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जुड़े वायरल और सेलुलर प्रोटीन की पहचान के लिए अलग करने के लिए । हालांकि प्रोटीन है कि वायरल जीनोम के साथ बातचीत संक्रमण के परिणाम के निर्धारण में प्रमुख भूमिका निभाते हैं, वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन का एक व्यापक विश्लेषण पहले संभव नहीं था । यहाँ हम एक विधि है कि संक्रमित कोशिकाओं से एचएसवी-1 जीनोम के प्रत्यक्ष शुद्धि सक्षम बनाता है प्रदर्शन । नकल वायरल डीएनए चुनिंदा संशोधित न्यूक्लियोटाइड है कि एक alkyne कार्यात्मक समूह में शामिल है के साथ लेबल है । लेबल डीएनए तो विशेष रूप से है और अचल एक तांबे के माध्यम से बायोटिन azide के आबंध लगाव के माध्यम से टैग (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition या प्रतिक्रिया क्लिक करें । बायोटिन-टैग डीएनए streptavidin-लेपित मोतियों पर शुद्ध है और जुड़े प्रोटीन eluted और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं । इस विधि चयनात्मक लक्ष्यीकरण और अलगाव एचएसवी-1 प्रतिकृति कांटे या पूरे जीनोम जटिल जैविक वातावरण से सक्षम बनाता है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण के अनुकूलन herpesviral संक्रमण के विभिंन पहलुओं की जांच के लिए अनुमति देगा, साथ ही साथ अंय डीएनए वायरस के जीनोम की परीक्षा ।

Introduction

वायरस एक सीमित क्षमता के लिए आवश्यक कार्य बाहर ले जाने और इसलिए वायरल जीन अभिव्यक्ति, प्रतिकृति, मरंमत, पुनर्संयोजन, और परिवहन सहित संक्रमण के महत्वपूर्ण पहलुओं की सुविधा के लिए मेजबान कारकों पर निर्भर है । इन मेजबान कारकों की गतिविधियों अक्सर वायरल इनकोडिंग प्रोटीन द्वारा संवर्धित कर रहे हैं । इसके अलावा, वायरस पता लगाने और वायरल संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं द्वारा हस्तक्षेप से बचना चाहिए । इसलिए, वायरस मेजबान बातचीत संक्रमण के परिणाम हुक्म । सर्वोपरि महत्व की समझ कैसे वायरस सेलुलर मशीनरी को वायरल प्रक्रियाओं की सुविधा के लिए अनुकूलित करने के लिए सेल्यूलर पर्यावरण को बदल । विशेष रूप से ब्याज की पहचान है जो कारकों और प्रक्रियाओं संक्रामक चक्र में वायरल जीनोम पर कार्रवाई ।

दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1 (एचएसवी-1) एक डबल फंसे डीएनए वायरस है कि मानव आबादी का एक बड़ा अनुपात संक्रमित है । संक्रमण के पहले घंटे के भीतर, वायरल जीनोम नाभिक में प्रवेश करती है, जहां वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक आदेश दिया झरना वायरल डीएनए (vDNA) प्रतिकृति के साथ समंवय में मग्न1। नाभिक में, जीनोम epigenetic विनियमन के अधीन हैं, मरंमत और पुनर्संयोजन से गुजरना, और capsids में पैक कर रहे हैं, ऐसी है कि पहली संतान virions से कम छह घंटे के भीतर उत्पादन कर रहे हैं । संक्रमण के पाठ्यक्रम में वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन के व्यापक मूल्यांकन नींव रखना करने के लिए प्रक्रियाओं के आणविक विवरण की जांच करेगा कि वायरल जीनोम पर अधिनियम, और अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जिसमें वायरल और सेलुलर कारकों संक्रमण के विभिन्न चरणों में शामिल हैं ।

वायरल संक्रमण में शामिल मेजबान कारकों की जांच के लिए पिछले तरीकों एसोसिएटेड सेलुलर प्रोटीन के विश्लेषण के लिए वायरल प्रोटीन का अपनत्व शुद्धिकरण शामिल है2,3,4,5 , ६ , 7 , 8 , 9. ये परख मेजबान एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं में शामिल सेलुलर कारकों की पहचान, साथ ही वायरल क्रोमेटिन संशोधन, जीन अभिव्यक्ति, और डीएनए की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । हालांकि, यह पता लगाना मुश्किल है कि बातचीत vDNA के साथ सहयोग पर निर्भर करता है, और प्रोटियोमिक् केवल बातचीत है कि एक विशिष्ट वायरल कारक के एक समारोह के रूप में होने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जहां विशिष्ट वायरल और सेलुलर प्रोटीन वायरल जीनोम को बांध10,11,12,13,14 , 15 और immunocytochemistry के साथ संयुक्त सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट सेलुलर कारकों के दृश्य सक्षम है कि vDNA के साथ colocalize16,17,18, 19 , 20. इन परख स्थानिक और लौकिक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, सीमाएं अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी, सीमित संवेदनशीलता, और वायरस मेजबान बातचीत में पिछले अंतर्दृष्टि के लिए की जरूरत के लिए की जरूरत है शामिल हैं । इसलिए हम एक iPOND पर आधारित विधि विकसित (नवजात डीएनए पर प्रोटीन का अलगाव)21 और aniPOND (त्वरित देशी iPOND)22 चुनिंदा लेबल और वायरल जीनोम की निष्पक्ष पहचान के लिए संक्रमित कोशिकाओं से vDNA को शुद्ध जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संबद्ध प्रोटीन । iPOND सेलुलर प्रतिकृति कांटा गतिशीलता की जांच के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।

संक्रमित कोशिकाओं से वायरल जीनोम के चयनात्मक शुद्धिकरण के लिए, नकल vDNA ethynyl संशोधित nucleosides, 5-ethynyl-2 ´-deoxyuridine (EdU) या 5-ethynyl-2 ´-deoxycytidine (EdC) के साथ लेबल किया गया है (चित्रा 1), आबंध द्वारा पीछा विकार पर क्लिक करें रसायन विज्ञान के माध्यम से बायोटिन azide के लिए वायरल जीनोम के एकल कदम शुद्धिकरण और streptavidin-लेपित मोतियों पर जुड़े प्रोटीन की सुविधा (चित्रा बीसी) । महत्वपूर्ण बात, संक्रमण स्थिर कोशिकाओं में किया जाता है, जो सेलुलर डीएनए प्रतिकृति में vDNA के विशिष्ट लेबलिंग सक्षम करने के लिए नहीं लगे हैं । इसके अलावा, एचएसवी-1 संक्रमण कोशिका चक्र गिरफ्तारी का कारण बनता है और सेलुलर डीएनए प्रतिकृति23,24को रोकता है । वायरस आने वाले वायरल जीनोम (चित्र 1a) या नव संश्लेषित vDNA (चित्र 1bके साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए डीएनए प्रतिकृति के दौरान लेबल के साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए संक्रमण से पहले लेबल किया जा सकता है) 25. इसके अलावा, पल्स चेस विश्लेषण वायरल प्रतिकृति कांटे (चित्रा 1C)26के साथ जुड़े प्रोटीन की प्रकृति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, ethynyl संशोधित vDNA प्रोटीन गतिशीलता (चित्रा 2a और चित्रा 3) के स्थानिक जांच के लिए एक fluorophore के लिए संयुग्मित covalently किया जा सकता है । इमेजिंग vDNA के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है और vDNA-प्रोटीन बातचीत के सत्यापन के लिए एक मानार्थ दृष्टिकोण है, और संक्रमण भर में वायरल जीनोम ट्रैक अनुकूलित किया जा सकता है । हमें आशा है कि इन दृष्टिकोण और herpesviral संक्रमण के किसी भी पहलू का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, विलंबता और पुनर्सक्रियण सहित, और अंय डीएनए वायरस का अध्ययन । इसके अलावा, 5-ethynyl uridine (ईयू) के साथ लेबलिंग आरएनए वायरल जीनोम के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सेल कल्चर, वायरल इंफेक्शन, और EdC लेबलिंग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > आरेख 1 )

< p class = "jove_content" > निंन प्रोटोकॉल में वायरस के साथ कार्य करना शामिल है । वायरस और अन्य जैविक एजेंटों के सुरक्षित हैंडलिंग के संबंध में कृपया अपनी संस्था & #39; s बायो-सेफ्टी प्रोटोकॉल को देखें । इस प्रोटोकॉल पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

  1. Trypsinize एक धाराप्रवाह १५० सेमी 2 टिशू कल्चर MRC की कुप्पी-5 कोशिकाओं और एक ६०० सेमी 2 टिशू कल्चर प्लेट १०० मिलीलीटर DMEM प्लस 10% FBS युक्त करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । ३७ पर मशीन & #176; सी 5% सह 2 की उपस्थिति में 3-4 दिनों के लिए प्रवाह और स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए । एक धाराप्रवाह ६०० cm 2 डिश शामिल ~ 7 x 10 7 कोशिकाओं । प्रत्येक शर्त के लिए 1 प्लेट और प्रत्येक इसी नकारात्मक नियंत्रण के लिए 1 थाली तैयार करें ।
    नोट: कोशिकाओं केवल vDNA लेबल और बाद के चरणों में शुद्ध सुनिश्चित करने के लिए सेलुलर डीएनए प्रतिकृति को बाधित करने के लिए स्थिर चरण तक पहुँचने चाहिए.
    नोट: प्रत्येक नमूना EdC के अतिरिक्त के बिना एक ही संक्रमण की स्थिति और समय बिंदु का उपयोग कर तैयार एक मानार्थ लेबल वाले नकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता है ।
    नोट: एक छोटा इस प्रयोग के संस्करण नीचे किया जाना चाहिए मिलकर में की तुलना सेल विकास, संक्रमण, EdC लेबलिंग शर्तों का उपयोग इमेजिंग द्वारा सेलुलर डीएनए के लेबल के लिए परीक्षण, और समय अंक (चरण 2 देखें) ।
  2. पतला 7 x 10 8 PFU एचएसवी-1 म 7 मिलि शीत Tris-बफर खारा (टीबीएस) । ३७ & #176; C पर विकास माध्यम और स् टोर निकालें । संक्रमित करने के लिए, 7 मिलीलीटर पतला वायरस MRC-5 कोशिकाओं और रॉक के लिए 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जोड़ें । सोखना के बाद, इनोक्युलम निकालें, ५० एमएल कमरे के तापमान टीबीएस के साथ कुल्ला, और मूल विकास माध्यम की जगह । ३७ पर मशीन & #176; ग 5% कं 2 की उपस्थिति में । यह चरण प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति और नकारात्मक नियंत्रण के लिए किया जाना चाहिए ।
    नोट: वृद्धि EdC लेबलिंग वायरल dUTPase (UL50 जीन) और/या uracil glycosylase (UL2 जीन) की अभिव्यक्ति के लिए एचएसवी-1 म्यूटेंट दोषपूर्ण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । एचएसवी-1 dUTPase कम सब्सट्रेट विशिष्टता है और कई nucleoside अनुरूप के सक्रियण कम कर सकते हैं < सुप वर्ग = "xref" > २५ , < सुप क्लास = "xref" > २७ .
    3. EdC के साथ
  3. लेबल वायरल जीनोम । आने वाले जीनोम (1.3.1.), नकल जीनोम (1.3.2.), या वायरल प्रतिकृति कांटे (1.3.3.) लेबल के लिए निर्देशों का पालन करें ।
    नोट: केवल कदम 1.3.1, 1.3.2, या 1.3.3 बाहर किया जाना चाहिए पर निर्भर करता है कि आने वाले जीनोम, दोहराया जीनोम, या प्रतिकृति कांटे के बाद के चरणों में विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, क्रमशः.
    नोट: EdU या f-आरा edu के लिए EdC प्रतिस्थापित किया जा सकता है । nucleoside सादृश्यों की विषाक्तता पर नजर रखी जानी चाहिए और छोटी से कम ।
    1. चरण १.२ में संक्रमण को पूरा करने के लिए, लेबल वाले स्टॉक का उपयोग करें और चरण 2 या 3 में 4 h पोस्ट संक्रमण (hpi) की जांच करने के लिए आगे बढ़ना unप्रतिकृति vDNA (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 1a ).
      नोट: पहले बताए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूर्व-लेबल वाले वायरस स्टॉक तैयार करें < सुप वर्ग = "xref" > २५ . वायरस स्टॉक किसी भी अवशिष्ट EdC को हटाने के लिए जी 25 कॉलम के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए ।
    2. लेबल नकल vDNA जोड़कर 5-25 & #181; M EdC के लिए संक्रमित कोशिकाओं के सेल कल्चरल मीडियम को 2-4 h (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > figure 1b ). जोड़ने से पहले, विकास मध्यम के 1 मिलीलीटर में EdC पतला करें ।
    3. वायरल प्रतिकृति कांटे लेबल करने के लिए, vDNA प्रतिकृति की शुरुआत के बाद (& #8805; 4 hpi), पल्स लेबल नकल vDNA के साथ 5-25 & #181; M EdC के लिए 5-20 मिनट । पीछा करने के लिए, 25-100 से युक्त चेस माध्यम के साथ 3x कुल्ला & #181; M 2 & #180;d eoxycytidine (deoxyC), और फिर एक अतिरिक्त 20-40 मिनट के लिए चेस माध्यम की उपस्थिति में मशीन (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
      नोट: पल्स और चेस मीडियम को equilibrated होना चाहिए ३७ & #176; ग और 5% कं 2 उपयोग करने से पहले.
      नोट: पल्स चेस प्रयोगों के लिए, यह सेल में प्रवेश करने के लिए nucleosides के लिए लेता है समय की राशि पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है और वे डीएनए नकल में शामिल किया जा सकता से पहले phosphorylated हो. यह निर्धारित किया जाना चाहिए empirically.
      नोट: पल्स चेस प्रयोगों के संकल्प का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वायरल प्रतिकृति दर की गणना. यह एक एकल कदम वृद्धि समय पाठ्यक्रम के दौरान वायरल जीनोम की मात्रात्मक पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जा सकता है < सुप वर्ग = "xref" > २६ .
      नोट: इमेजिंग वायरल जीनोम के लिए कदम 2 और वायरल जीनोम के शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ना के लिए कदम आगे बढ़ना 3.
< p class = "jove_title" > 2. EdC लेबल्ड डीएनए (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a )

< p class = "jove_content" > नोट: यह सत्यापित करने के लिए कि सेलुलर डीएनए प्रयोगों में लेबल नहीं है वायरल जीनोम शुद्धि विधि के साथ मिलकर इमेजिंग बाहर ले जाने के लिए उपयोगी है । इमेजिंग भी लेबल vDNA की प्रकृति कल्पना और प्रोटियोमिक् डेटा को मांय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सेलुलर और वायरल डीएनए धुंधला पैटर्न के उदाहरणों में दिखाया गया है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ .

  1. संक्रमण और EdC लेबलिंग बाहर ले जाने के रूप में coverslips पर एक 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में स्केल नीचे शर्तों का उपयोग कर के अलावा चरण 1 में वृद्धि मध्यम के 1 मिलीलीटर युक्त पकवान ।
  2. 1 मिलीलीटर ३.७% के साथ तय सेल 1x में 15 मिनट के लिए paraformaldehyde । निर्धारण के बाद, कुल्ला कोशिकाओं 1 एमएल के साथ 2x 3% BSA में पंजाब.
    चेतावनी: Paraformaldehyde गंभीर या स्थाई चोट के कारण हो सकता है । सुरक्षा सावधानियों का पालन करें.
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है और coverslips 4 & #176 पर संग्रहित किया जा सकता है; C 3 दिनों तक के लिए दूसरे वॉश में.
  3. Permeabilize कोशिकाओं के साथ 1 मिलीलीटर permeabilization बफर [देखें तालिका की सामग्री ] के लिए 20 मिन कमरे के तापमान पर जबकि कमाल.
  4. 3% BSA की 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला और फिर रॉक जबकि कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पंजाब में 1 मिलीलीटर 3% BSA के साथ ब्लॉक ।
  5. क्लिक करें प्रतिक्रिया कॉकटेल के 1 मिलीलीटर जोड़ें [सामग्री के तालिका देखें] को coverslips covalently संयुग्म Alexa Fluor ४८८ azide के लिए EdC लेबल डीएनए । जबकि कमाल 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । महाप्राण और कुल्ला दो बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ ।
  6. एक 1 के 1 मिलीलीटर के साथ सेलुलर डीएनए दाग: पंजाब में Hoechst के 2000 कमजोर पड़ने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट जबकि कमाल । महाप्राण और कुल्ला दो बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ ।
  7. के अनुसार प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग मानक अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस चलत < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
    नोट: त्यसपछि vDNA colocalizes साथ ICP8, ICP4, या UL42 र त्यसपछि सेलुलर डीएनए colocalizes साथ Hoechst दाग.
  8. स्लाइड और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि कोशिकाओं पर माउंट coverslips.
    नोट: स्लाइड कई हफ्तों के लिए 4 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 3. vDNA और जुड़े प्रोटीन्स की शुद्धि

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को Leung et al. से रूपांतरित किया गया है < सुप वर्ग = "xref" > २२
नोट: सभी बफ़र्स और रिएजेंट उपयोग करने से पहले बर्फ पर ठंडा किया जाना चाहिए और सभी कदम बर्फ पर किया जाना चाहिए जब तक अंयथा संकेत दिया ।

  1. फसल नाभिक.
    नोट: नाभिक के अलगाव से पहले, formaldehyde डीएनए के लिए प्रोटीन crosslink करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिक कठोर धोने की स्थिति तो streptavidin-लेपित मोतियों पर डीएनए शोधन के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है । सीआर के लिएosslinking और वॉश की स्थिति देखें Sirbu एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 21 .
    1. 20 मिलीलीटर नाभिक निष्कर्षण बफर (नेब) के साथ वृद्धि के माध्यम से बदलें और 4 & #176 पर 20 मिनट के लिए मशीन सामयिक कमाल के साथ; सी । नाभिक माइक्रोस्कोप में दृश्यमान हो जाएगा.
    2. एक सेल खुरचनी का उपयोग कर प्लेट से नाभिक परिमार्जन और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण । २,५०० पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक x g पर 4 & #176; C गोली नाभिक करने के लिए, supernatant.
      त्यागें नोट: Trypan नीले दाग कोशिकाओं से नाभिक के अलगाव को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. धीरे 10 मिलीलीटर पंजाब में परमाणु गोली, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब हस्तांतरण, और गोली 10 मिनट के लिए २,५०० x g पर 4 & #176 में के लिए केंद्रापसारक द्वारा दर्ज करें; C. पूरी तरह से हटाएं पंजाबियों.
      नोट: नाभिक जम सकता है और प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है । ऐसा करने के लिए, धीरे ५०० & #181 में परमाणु गोली reसस्पेंड; एल ठंड बफर और एक इथेनॉल/सूखी बर्फ स्नान में ट्यूब मशीन । टोर जम नाभिक पर-८० & #176; ग. उपयोग करने से पहले, कमरे के तापमान पर गल नाभिक, जल्दी से बर्फ को हस्तांतरण, 10 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ने, रॉक धीरे मिश्रण करने के लिए, 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली २,५०० x g पर 4 & #176; C पर, और पूरी तरह से पंजाबियों को हटा दें । ठंड नाभिक कम उपज में परिणाम हो सकता है ।
  2. Covalently संयुग्म बायोटिन-azide को EdC त्यसपछि vDNA
    1. 10 मिलीलीटर में परमाणु गोली reसस्पेंड क्लिक करें प्रतिक्रिया मिश्रण [सामग्री के तालिका देखें] धीरे से ऊपर और नीचे 5 बार एक 10 मिलीलीटर pipetting के साथ प्लास्टिक ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि क्लिक करें प्रतिक्रिया मिश्रण में शामिल रिएजेंट संकेत क्रम में जोड़े जाते हैं ।
    2. रोटेट के लिए 4 ज & #176; ग. तैयार और सर्द घूर्णन करते हुए बफ़र्स B1, B2, और B3 [सामग्री की तालिका देखें].
    3. गोली नाभिक द्वारा 10 मिनट के लिए पर २,५०० x g पर 4 & #176; c. पूरी तरह से क्लिक करें प्रतिक्रिया मिश्रण को हटा दें और धीरे से 10 मिलीलीटर पंजाबियों में reसस्पैंड द्वारा गोली धो और 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक में २,५०० x g पर 4 & #176; C.
    4. धीरे 1 मिलीलीटर पंजाबियों में परमाणु गोली reसस्पेंड और एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब एक बड़े बोर पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण । गोली नाभिक 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा २,५०० x g पर 4 & #176; C. पूरी तरह से हटा पंजाब और फ्लैश फ्रीज में तरल नाइट्रोजन.
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और जमे हुए नाभिक पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C. फ्रीज गल lysis बाद में मदद करता है तो यह अनुशंसित है कि नाभिक भी जमे हुए जब एक ही दिन ३.३ कदम करने के लिए आगे बढ़ने फ़्लैश ।
  3. लाइसे नाभिक और टुकड़ा डीएनए.
    1. गल नाभिक पर बर्फ और reसस्पैंड में ५०० & #181; एल बफर B1 द्वारा pipetting ऊपर और नीचे । ४५ min.
      2. के लिए बर्फ पर मशीन
    2. Sonicate नमूने एक 3 मिमी microtip जांच का उपयोग ४०% आयाम पर प्रत्येक 30 एस के लिए 6 बार । दालों के बीच 30 एस के लिए बर्फ पर जगह नमूने । sonication के बाद, नमूने स्पष्ट दिखाई देते हैं, बादल नहीं होना चाहिए ।
      नोट: Sonication शर्तों व्यक्तिगत sonicators के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । sonication शर्तों का अनुकूलन करने के लिए कैसे पर विस्तृत निर्देशों के लिए देखें Leung एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
    3. गोली सेल मलबे से १४,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176; C. गोली का आकार काफी कम होना चाहिए । १०० & #181 के माध्यम से supernatant को फ़िल्टर करें; M सेल छलनी और के माध्यम से प्रवाह को बनाए रखने.
    4. Add ५०० & #181; l बफर B2 ते छान supernatant. ९०० & #181; l इस नमूने का उपयोग चरण 3.4.2 में किया जाएगा.
    5. डीएनए अलगाव के लिए प्रत्येक शर्त का एक aliquot ले लो (५० & #181; l या 1/20वीं मात्रा) और जोड़ ५० & #181; L 2x एसडीएस-bicarb हल [ सामग्री के तालिका देखें] । डीएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल (चरण ३.६) के लिए आगे बढ़ें ।
    6. इनपुट प्रोटीन के लिए प्रत्येक शर्त का एक aliquot ले लो (५० & #181; l या 1/20वें वॉल्यूम) और ५० & #181 जोड़ें; L 2x Laemmli नमूना बफर, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और स्टोर पर-८० & #176; C. चरण 3.5.6.
      7. में उपयोग करें
  4. बाँध biotinylated डीएनए ते streptavidin लेपित मोतियों.
    1. ३०० & #181; मनका घोल के एल के एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब स्थानांतरित करके Streptavidin T1 चुंबकीय मोती तैयार करते हैं । नमूना प्रति मोतियों की एक ट्यूब तैयार करें । reसस्पैंड करने के लिए भंवर द्वारा 1 मिलीलीटर बफर बी 2 के साथ 3x मनका धो, मोतियों को अलग करने के लिए एक चुंबक लगाने, और धोने बफर aspirating ।
      ध्यान दें: ऑप्टिमाइज़ की गई बाइंडिंग शर्तों का परिणाम अधिकतम यील्ड और न्यूनतम पृष्ठभूमि बाइंडिंग में होता है. यह प्रयोग Streptavidin T1 चुंबकीय मोती agarose मोतियों की तुलना में एक काफी अधिक बाध्यकारी क्षमता है, साथ ही अन्य Streptavidin मोती, और Streptavidin C1 मोतियों की तुलना में कम पृष्ठभूमि बाध्यकारी है कि निर्धारित किया गया था (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4a       ).
    2. Add ९०० & #181; L के सैंपल से स्टेप 3.3.4. धो मोतियों को और रात भर घुमाने पर 4 & #176; C.
      नोट: भंवर मोती नहीं एक बार नमूना उंहें जोड़ा है ।
      नोट: यदि डीएनए या प्रोटीन की महत्वपूर्ण मात्रा में unलेबल्ड नकारात्मक नियंत्रण अलग कर रहे हैं, इस कदम को रातोंरात से 4 h पृष्ठभूमि बाइंडिंग को कम करने के लिए कम किया जा सकता है ।
  5. धो मोतियों और elute vDNA और जुड़े प्रोटीन.
    नोट: यह शेष चरणों के लिए फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है ।
    1. जगह नमूने एक चुंबकीय microfuge ट्यूब रैक में, हटाने supernatant, धीरे से 1 मिलीलीटर बफर B2 में reसस्पेंड, 4 & #176 पर घुमाएँ; C for 5 min.
    2. दोहराएँ चरण 3.5.1 तीन बार.
    3. एक चुंबकीय microfuge ट्यूब रैक में नमूनों जगह, supernatant हटाने, धीरे से 1 मिलीलीटर बफर B3 में reसस्पेंड, और 4 & #176 पर घुमाएं; C for 5 min.
    4. Transfer १०० & #181; L मनका मिश्रण (1/10 th volume) एक नई ट्यूब के लिए बाध्य डीएनए अलगाव के लिए । चुंबक के लिए इस ट्यूब को लागू करें, supernatant निकालें, १०० में मोतियों को पुनः निलंबित & #181; L 1x एसडीएस-bicarb समाधान और डीएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल (चरण ३.६) के लिए आगे बढ़ें ।
    5. से युक्त ट्यूब को लागू कर शेष ९०० & #181; l मनका मिश्रण से कदम 3.5.3. चुंबक के लिए, supernatant निकालें, और ५० & #181 में मोती reसस्पेंड; l 2x Laemmli नमूना बफर elute प्रोटीन और डीएनए प्रोटीन परिसरों के लिए ।
    6. पर फोड़े नमूने ९५ & #176; 15 मिनट, भंवर के लिए सी, जल्दी microfuge में स्पिन, और चुंबक लागू होते हैं । एक नई ट्यूब, फ्लैश फ्रीज करने के लिए eluate स्थानांतरण, और स्टोर पर-८० & #176; ग.
      नोट: उपयोग टोपी ताले सुनिश्चित करें कि ट्यूबों खुला पॉप नहीं है, जबकि उबलते.
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और नमूने पर संग्रहित किया जा सकता-८० & #176; C कई हफ्तों के लिए.
    7. मानक प्रक्रियाओं द्वारा Coomassie नीले दाग, पश्चिमी सोख्ता, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन के नमूनों का विश्लेषण < सुप वर्ग = "xref" > २५ . प्रतिनिधि परिणाम < सुदृढ वर्ग में दिखाए जाते हैं = "xfig" > चित्रा ४ र < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ५ .
      नोट: यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन यील्ड मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए पर्याप्त है, ७.५ & #181; प्रत्येक नमूने के एल Coomassie नीले दाग और ७.५ & #181; l के लिए एक प्रतिनिधि वायरल जीनोम जुड़े प्रोटीन (ICP4, ICP8, या UL42) के पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है । चरण 3.3.6 से lysates की एक ही मात्रा । इनपुट प्रोटीन के स्तर के लिए नियंत्रण के साथ चला रहे हैं । शेष नमूना (३५ & #181; L) तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहले वर्णित के रूप में विश्लेषण किया जाता है < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
  6. डीएनए अलगाव
    1. कदम से नमूने 3.3.5. और 3.5.4. at ६५ & #176; C के लिए 4-16 h. यदि आवश्यक हो, तो चुंबकीय मोतियों से नमूना निकालें ।
    2. निकालने के नमूने के साथ १५० & #181; L phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (पीसीआई) और एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण हस्तांतरण.
    3. निकालें १०० & #181 के साथ शेष PCI; L Tris-EDTA (TE) और एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण जोड़ें.
    4. निकालने के नमूने के साथ २०० & #181; L क्लोरोफॉर्म: isoamyl मद्य (24:1).
    5. निर्माता & #39; एस प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर जलीय चरण शुद्ध करें ।
      नोट: बफर पंजाब में पीएच संकेतक जामुनी बारी जब नमूना में जोड़ा जाएगा । जोड़ 10 & #१८१; एल 3m NaOAc पीएच ५.० नमूना के पीएच को कम करने के लिए ।
    6. एक fluorometer.
      का उपयोग डीएनए एकाग्रता का निर्धारण नोट: इस प्रोटोकॉल आम तौर पर पैदावार १००-४०० मनका बाध्य डीएनए एनजी । जिसमें EdC चरण १.३ में नहीं जोड़ा गया नकारात्मक नियंत्रण के eluate में कोई डीएनए का पता लगाया जाना चाहिए ।
    7. डीएनए को 4 या-20 & #176 पर कम डीएनए बाइंडिंग ट्यूब में संग्रहित किया जा सकता है; सी और वास्तविक समय पीसीआर या उच्च प्रवाह अनुक्रमण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

कोशिकाओं से डीएनए की शुद्धि के लिए क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग सबसे पहले iPOND विधि21द्वारा पूरा किया गया था । iPOND का उद्देश्य संबद्ध प्रोटीन की पहचान के लिए सेलुलर प्रतिकृति कांटे को शुद्ध करने के लिए है । हम विशेष रूप से संक्रमण के दौरान vDNA प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक को अनुकूलित किया है । EdC के साथ वायरल जीनोम लेबल करने के लिए दृष्टिकोण में हेरफेर (चित्रा 1), सिंक्रनाइज़ संक्रमण के साथ संयुक्त, चयनात्मक अलगाव और vDNA की अलग आबादी की जांच के लिए अनुमति दी गई है. एचएसवी-1 डीएनए EdC (चित्रा 1) के साथ लेबल (चित्रा 2) शुद्धि के लिए इमेजिंग या बायोटिन के लिए एक fluorophore के लिए आबंध लगाव की सुविधा है । वायरस आने वाले जीनोम (चित्र 1a) या नव संश्लेषित vDNA (चित्र 1b)25के साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए डीएनए प्रतिकृति के दौरान लेबल के साथ जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण के लिए संक्रमण से पहले हो सकता है । इसके अलावा, पल्स चेस विश्लेषण वायरल प्रतिकृति कांटे (चित्रा 1C)26के साथ जुड़े प्रोटीन की प्रकृति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । डीएनए की पहचान की vDNA-प्रोटीन बातचीत के लिए लेबल डीएनए और समर्थन की प्रकृति के बारे में स्थानिक जानकारी प्रदान करने के लिए कोशिकाओं के भीतर visualized किया जा सकता है (चित्रा 3) । एक साथ लिया, प्रोटोकॉल यहां वर्णित उत्पादक संक्रमण के कई पहलुओं की proteomic जांच के लिए गतिशील परिवर्तन है कि एचएसवी-1 जीनोम पर होने में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए अनुमति देते हैं । इन दृष्टिकोण आगे विलंबता और पुनर्क्रियाशीलता की जांच करने के लिए, वायरल म्यूटेंट के साथ जुड़े phenotypes की जांच करने के लिए, और अंय डीएनए और आरएनए वायरस का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस प्रोटीन शुद्धि विधि के पहलुओं Leung एट अलसे अनुकूलित किया गया । 22. यहां EdC लेबल की शुद्धि के लिए एक बड़ा सुधार डीएनए के बजाय Streptavidin-लेपित agarose मोतियों की Streptavidin T1 मोतियों का उपयोग है । डीएनए शुद्धि का अनुकूलन करने के लिए, streptavidin-लेपित मोतियों की कई प्रकार के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए परीक्षण किया गया था जब संक्रमण edc के अभाव में किया गया था और edc की उपस्थिति में अधिकतम प्रोटीन वसूली के लिए (चित्र 4a) । इन प्रयोगों के लिए वेस्टर्न सोख्ता को vDNA बाइंडिंग प्रोटीन ICP4 के लिए बाहर किया जाता था । Streptavidin T1 मोतियों पर बाहर किए गए शुद्धिकरण edc के अभाव में पृष्ठभूमि बाध्यकारी और edc की उपस्थिति में अधिकतम प्रोटीन वसूली की कम राशि के परिणामस्वरूप ।

vDNA से जुड़े प्रोटीन्स को वेस्टर्न सोख्ता और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित proteomic तरीकों से पहचाना जा सकता है । पश्चिमी सोख्ता ज्ञात बातचीत और जन स्पेक्ट्रोमेट्री की गतिशीलता की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक निष्पक्ष दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उपंयास vDNA जुड़े प्रोटीन की पहचान । EdC लेबलिंग बढ़ाने के एक समारोह के रूप में प्रोटीन उपज का एक उदाहरण चित्रा 4Bमें दिखाया गया है । एक धब्बा, बल्कि एक स्पष्ट बैंडिंग पैटर्न से, आमतौर पर Coomassie नीले दाग से मनाया जाता है । यह संभावना है क्योंकि वहां डीएनए प्रोटीन के नमूने में मौजूद है या क्योंकि वहां प्रोटीन की प्रचुरता है । यह भी ध्यान दें कि क्लिक प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया तांबे उत्प्रेरक प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की आंशिक गिरावट28,29का कारण बन सकता है महत्वपूर्ण है । पश्चिमी सोख्ता द्वारा, ICP4 के समान स्तर आमतौर पर eluates में पाए जाते हैं (step 3.5.5.) vDNA के शुद्धिकरण के बाद कि EdC के साथ ६० मिनट के लिए लेबल किया गया था, जो कि परमाणु lystates (step 3.3.6.) से तैयार इनपुट नमूना की समान मात्रा में मौजूद है । यह जानकारी कि क्या पुनर्प्राप्ति शेष नमूना मास-spectrometric विश्लेषण के लिए भेजने के लिए पर्याप्त है यह निर्धारित करने के लिए एक मार्गदर्शिका के रूप में उपयोग किया जा सकता है ।

नैनो तरल क्रोमैटोग्राफी साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस/ms) के रूप में किया जा सकता है पहले25 वर्णित के रूप में शुद्ध vDNA के साथ जुड़े प्रोटीन की पहचान । LC-ms/ms डेटा EdC-लेबल प्रयोगात्मक नमूना और इसी अनलेबल्ड नकारात्मक नियंत्रण के बीच वर्णक्रमीय गणना (SpC) मूल्यों की तुलना करके विश्लेषण कर रहे हैं । प्रोटीन को निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर प्रयोगात्मक नमूने में समृद्ध माना जाता है: 1) प्रोटीन है प्रयोगात्मक नमूने में कम से कम 5 वर्णक्रमीय गिनती (SpC), 2) प्रोटीन नियंत्रण में नहीं पाया जाता है या कम से चार गुना द्वारा नियंत्रण पर समृद्ध है SpC मूल्यों को विभाजित करने के आधार पर, और 3) प्रोटीन दो या अधिक जैविक प्रतिकृति में नियंत्रण पर समृद्ध है । सामान्यीकृत वर्णक्रमीय बहुतायत कारक (ंसाफ:) आणविक वजन (मेगावाट) और कुल प्रोटीन यील्ड में अंतर के लिए खाते में इस्तेमाल किया जा सकता है । Equation 1 यह समीकरण एक नमूने के भीतर व्यक्तिगत प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करता है और दो अलग प्रयोगात्मक स्थितियों जिसमें vDNA के विभिंन मात्रा में शुद्ध कर रहे है की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, इनपुट वायरल जीनोम की तुलना ( चित्र 1a) को दोहराया जीनोम (चित्र 1b)) ।

वहां कई मायनों में प्रोटीन संवर्धन डेटा मौजूद हैं । कुछ उदाहरणों में पाइ चार्ट्स, वेन आरेख और प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क शामिल हैं. पाइ चार्ट्स का उपयोग पहचाने गए प्रोटीन के अनुपात को समझाने के लिए किया जा सकता है जो किसी विशिष्ट जैविक प्रक्रिया (चित्र 5) में कार्य करने के लिए जाना जाता है । हालांकि, समस्याओं पैदा कर सकते है जब एक प्रोटीन एक से अधिक जैविक समारोह है, जो अक्सर मामला है । विभिंन पाइ चार्ट्स में डेटा की तुलना करना भी कठिन होता है । वेन आरेख विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत पहचान प्रोटीन के बीच संबंधों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन पहचान प्रोटीन के बारे में कोई कार्यात्मक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं (चित्रा 5B). प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क पहचाने गए प्रोटीन के बीच संभावित बातचीत के दृश्य चित्रण को चित्रित करते हैं और जैविक प्रक्रियाओं के प्रकारों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो (चित्रा 5C) शामिल हैं । कई ऑनलाइन संसाधनों की भविष्यवाणी की मानचित्रण के लिए उपलब्ध है प्रोटीन-स्ट्रिंग सहित प्रोटीन संपर्क (बातचीत जीन की पुनः प्राप्ति के लिए खोज उपकरण/ ऑनलाइन उपकरण आम तौर पर प्रजातियों की एक किस्म से प्रोटियोमिक् डेटा को संभालने और मेजबान वायरल जीनोम यांत्रिकी में शामिल प्रोटीन के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने के लिए सुसज्जित हैं । हालांकि, वायरल प्रोटीन आम तौर पर डेटाबेस में शामिल नहीं हैं, जो विश्लेषण जटिल कर सकते हैं । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए प्रमुख निष्कर्ष एक देना चाहूंगा जब तय कैसे प्रोटियोमिक् डेटा पेश करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1:ांग > दृष्टिकोण लेबल एचएसवी-1 डीएनए. (क) आने वाले वायरस की स्थिति को परख करने के लिए, जी0 में MRC-5 कोशिकाओं को लेबल वाले एचएसवी से संक्रमित हैं-1 और जीनोम से कम 4 hpi पर परख रहे है unदोहराया वायरल डीएनए का अध्ययन । (B) प्रतिरूपित वायरस की स्थिति को परख करने के लिए, MRC-5 कोशिकाओं को अनलेबल्ड एचएसवी-1 और EdC (नारंगी तारे) से संक्रमित कर संक्रमित कोशिकाओं के विकास माध्यम में जोड़ा जाता है और वायरल डीएनए प्रतिकृति (≥ 4 hpi) की शुरुआत के बाद 2-4 ज के लिए मशीनिंग की जाती है । (ग) को परख वायरल प्रतिकृति कांटों, संक्रमित कोशिकाओं को 5-20 मिनट के लिए EdC के साथ लेबल नाड़ी रहे हैं । प्रतिकृति कांटे तो deoxyC के साथ पीछा किया जा सकता है । EdC लेबल डीएनए नारंगी है । इस आंकड़े को Dembowski से और25को लुका से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: इस पेपर में EdC लेबल्ड डीएनए के विश्लेषण के लिए बताई गई कार्यविधियां । (A) इमेजिंग EdC लेबल वाले डीएनए के लिए विधि की एक बाह्यरेखा । टैग की गईं डीएनए हरे रंग में प्रतिनिधित्व किया है । (B) EdC लेबल vDNA के शुद्धिकरण और अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए विधि की एक बाह्यरेखा । इस आंकड़े को Dembowski से और25को लुका से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: EdC लेबल का दृश्य डीएनए । आरेख 1 और चित्र 2में बताए गए अनुसार कक्ष संक्रमित, लेबल और imageed थे । लेबल सेलुलर और वायरल डीएनए के प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । ICP4 के साथ Hoechst दाग और vDNA के साथ सेलुलर डीएनए colocalizes । स्केल बार: 5 µm । यह आंकड़ा Dembowski और लुका25 और Dembowski एट अल से संशोधित किया गया था । 26. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रतिनिधि प्रोटीन शुद्धि परिणाम । (क) प्रोटीन उपज की तुलना जब शुद्धि कदम बाहर streptavidin लेपित मोतियों की कई विभिंन प्रकार का उपयोग किया गया । संक्रमण edc की उपस्थिति में किया गया था (+) प्रोटीन यील्ड की तुलना करने के लिए या edc के अभाव में (-) पृष्ठभूमि बाइंडिंग की तुलना करने के लिए । संक्रमण और EdC लेबलिंग को चित्रा 1b और डीएनए में वर्णित के रूप में किया गया था-प्रोटीन कॉंप्लेक्स चित्रा बी में उल्लिखित चरणों के अनुसार शुद्ध किया गया streptavidin लेपित मोतियों की विभिंन प्रकार की तुलनीय मात्रा का उपयोग कर । शीर्ष पैनल: streptavidin लेपित agarose मोतियों या streptavidin एम-२८० पर शुद्धिकरण के बाद प्रोटीन की पैदावार की तुलना । नीचे पैनल: Streptavidin एम-२७०, एम-२८०, Streptavidin C1, या Streptavidin T1 पर शुद्धिकरण के बाद प्रोटीन उपज की तुलना. पश्चिमी सोख्ता वायरल प्रोटीन ICP4 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ किया जाता था । शुद्ध ICP4 तुलना के लिए पहली लेन में दिखाया गया है । नीचे पैनल के अब जोखिम को गलियों में ICP4 के एक समान तीव्रता "२८०" के रूप में शीर्ष पैनल में निरीक्षण की आवश्यकता थी । (B) EdC लेबलिंग के समय के कार्य के रूप में प्रतिनिधि प्रोटीन शुद्धि परिणाम दिखाए जाते हैं । संक्रमण और EdC लेबलिंग को चित्रा 1b और डीएनए में वर्णित के रूप में किया गया था-प्रोटीन परिसरों चित्रा बी में उल्लिखित चरणों के अनुसार शुद्ध किया गया Streptavidin T1 मोतियों का उपयोग । EdC लेबलिंग को 0, 20, ४०, या ६० मिनट के लिए किया गया था और Coomassie नीला धुंधला (ऊपर) और वेस्टर्न सोख्ता (नीचे) परिणाम दिखाए गए हैं । पश्चिमी सोख्ता ICP4, UL42, या GAPDH के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ किया जाता था । eluate सैंपल को स्टेप 3.5.5 से लिया गया था । और lysate से कदम 3.3.6 । तीर streptavidin इंगित करता है, जबकि एल प्रोटीन सीढ़ी इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: प्रोटियोमिक् डेटा प्रस्तुत करने के विभिंन तरीकों के उदाहरण. (क) पाइ चार्ट्स उन प्रोटीन्स को सारांशित करते हैं, जो 6 hpi पर शुद्ध किए गए वायरल जीनोम से जुड़े बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन eluates द्वारा पहचाने गए थे । मान प्रत्येक कार्यशील श्रेणी के लिए पहचाने गए प्रोटीन की संख्या इंगित करते हैं । T पहचाने गए प्रोटीन की कुल संख्या को इंगित करता है । रंग निम्नलिखित श्रेणियों का संकेत देते हैं: बैंगनी-आरएनए प्रोसेसिंग, लाल-प्रतिलेखन, ग्रीन-क्रोमेटिन remodeling, ऑरेंज-डीएनए प्रतिकृति, येलो-न्यूक्लियर ट्रांसपोर्ट, चैती-cytoskeleton, डार्क ब्लू-एचएसवी स्ट्रक्चरल प्रोटीन्स, और ग्रे-अन्य अनजान/ (B) वेन आरेख 6, 8 या 12 hpi पर वायरल जीनोम के साथ संबद्ध होने के लिए पहचाने गए प्रोटीन के ओवरलैप को दर्शाते हैं । (ग) एक स्ट्रिंग मानचित्र एक 5 मिनट EdC पल्स के बाद वायरल प्रतिकृति कांटे पर समृद्ध प्रोटीन को दर्शाया गया है । मानव प्रोटीन 5 से समृद्ध, unलेबल्ड नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में कार्यात्मक संपर्क मानचित्र, जो केवल उच्च विश्वास बातचीत को प्रदर्शित करने के लिए डेटा सेटिंग्स के साथ स्ट्रिंग30 का उपयोग कर उत्पंन किया गया था में दिखाया जाता है । जीन के नाम पर बातचीत का नक्शा इस्तेमाल किया गया. हलकों प्रोटीन है कि एक ही जैविक प्रक्रिया में कार्य संकेत मिलता है । यह आंकड़ा Dembowski और लुका25 और Dembowski एट अल से संशोधित किया गया था । 26. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल कई कदम है जो, अगर ध्यान से पीछा नहीं, काफी कम प्रोटीन उपज या सेलुलर डीएनए के साथ संदूषण में परिणाम कर सकते है शामिल हैं । यह महत्वपूर्ण है कि स्थिर कोशिकाओं सभी प्रयोगों के लिए सुनिश्चित करें कि सेलुलर डीएनए लेबल और शुद्ध नहीं है के लिए उपयोग किया जाता है । इस प्रोटीन के नमूने में सेलुलर डीएनए polymerases के अभाव से पुष्टि की जा सकती है क्योंकि एचएसवी-1 जीनोम संश्लेषण के लिए सेलुलर डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग नहीं करता है । EdC लेबलिंग और नाभिक संचयन चरणों के दौरान, नमूनों को यह सुनिश्चित करने के लिए चौंका देना चाहिए कि प्रत्येक समान रूप से संसाधित है । शुद्धिकरण कदम के दौरान, देखभाल के लिए बहुत ज्यादा pipetting द्वारा नाभिक हेरफेर नहीं लिया जाना चाहिए । यह नाभिक के समय से पहले lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, साथ ही प्लास्टिक सुझावों के पक्ष से चिपके के कारण नमूना नुकसान. इसके अलावा, sonication कदम व्यक्तिगत sonicators के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और streptavidin-लेपित मोतियों की मात्रा बायोटिन बंधन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए इष्टतम प्रोटीन उपज के लिए titrated होना चाहिए ।

कई संशोधनों के इस प्रोटोकॉल को बनाया जा सकता है और विभिंन वायरस या कोशिका प्रकार या एक कदम के अलावा डीएनए के लिए प्रोटीन crosslink के उपयोग में शामिल हैं । जब proteomic जांच के लिए उपयोग करने के लिए एक सेल प्रकार का चयन, यह है कि प्रजातियों के लिए एक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस की उपलब्धता के लिए जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रोटियोमिक् संसाधनों की कमी काफी प्रोटीन डेटा के बहाव के विश्लेषण की सीमा होगी । एक और सीमा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए की जरूरत है, इसलिए यह इस प्रयोग के लिए, न्यूरॉन्स के रूप में पर्याप्त प्राथमिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इस विधि के रूप में वायरल संक्रमण सेलुलर डीएनए प्रतिकृति पर निर्भर नहीं करता है जब तक अंय डीएनए या आरएनए वायरस के साथ संगत होना चाहिए । इसके अलावा, यह डीएनए में परिवर्तन का पता लगाने के लिए दिलचस्प होगा-प्रोटीन बातचीत है कि एचएसवी-1 म्यूटेंट में होते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए एक और संशोधन नाभिक के अलगाव से पहले एक formaldehyde crosslinking कदम के अलावा हो सकता है, जो शुद्धि21के दौरान और अधिक कठोर धोने की स्थिति के लिए अनुमति होगी । formaldehyde के अलावा फसल नाभिक करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा, लेकिन मुश्किल से प्रोटीन रेफरेंस के दौरान crosslinks reversing की वजह से कम प्रोटीन उपज में परिणाम हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल से परिणाम वायरल डीएनए की औसत स्थिति का प्रतिनिधित्व की जांच की जा रही है । इसलिए, यदि जटिल एक ही या अलग डीएनए अणुओं पर एक साथ कर रहे हैं भेद करने के लिए यह मुश्किल है. vDNA लेबलिंग तरीके उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संयोजन में यहां वर्णित प्रोटियोमिक् डेटा सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक सेल के भीतर डीएनए लेबल के विभिंन आबादियों के बीच अंतर करने में मदद कर सकते हैं । इसके अलावा, चिप seq वायरल जीनोम पर प्रोटीन के विशिष्ट स्थानों की पहचान करने के लिए एक अनुवर्ती विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि की तैयारी में मदद के लिए हंना फॉक्स स्वीकार करते हैं । इस काम को NIH ग्रांट R01AI030612 ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MRC-5 cells ATCC CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-082 Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish Thermo Fisher Scientific 166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column) GE Healthcare 17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) Sigma-Aldrich T511307 Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
2´-deoxycytidine (deoxyC) Sigma-Aldrich D3897 Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
Nuclear Extraction Buffer (NEB) Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper Bellco glass 7731-22000 Autoclave before use
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
PBS, pH 7.2 (10x) 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) Fisher Scientific C489 Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide Invitrogen B10184 Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year 
Click Reaction Mix Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)  
Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001 Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
Freezing buffer Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1 Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2 Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3 Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe Sonics VCX 130
Cell strainer Falcon 352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65601
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 260750F
2x Laemmli sample buffer Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
Cap locks for 1.5 mL tube Fisher Scientific NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
12-well tissue culture dish Corning 3513
Coverslips Fisher Scientific 12-545-100 Autoclave before use
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-5
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605 Prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) Sigma-Aldrich T8787 Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Molecular Probes C10337 Prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342 Life Technologies H1399 Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
Mouse anti-ICP8 primary antibody Abcam ab20194 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) Abcam ab19311 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody Life Technologies a11005 Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
2x SDS-bicarb solution 2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks 65 °C and 95 °C

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References

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  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
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Dembowski, J. A., Deluca, N. A.… More

Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56374, doi:10.3791/56374 (2017).

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