Summary
Målet med denne protokollen er spesielt merke og selektivt isolere virus-DNA fra infiserte celler for karakterisering av viral genomet forbundet proteiner.
Abstract
Målet med denne protokollen er for å isolere herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA fra infiserte celler for identifikasjon av tilknyttet viral og mobilnettet proteiner av masse massespektrometri. Selv om proteiner som samhandler med viral genomer spille viktige roller i å bestemme utfallet av infeksjon, var ikke en omfattende analyse av viral genomet forbundet proteiner tidligere mulig. Her viser vi en metode som gjør direkte rensing av HSV-1 genomer fra infiserte celler. Replikere virus-DNA er selektivt merket med endrede nukleotider som inneholder en alkyne funksjonsgruppe. Merket DNA er deretter spesielt og irreversibelt merket via kovalente feste biotin azide via en kobber (I)-katalysert azide-alkyne cycloaddition eller klikk reaksjon. Biotin-merket DNA er renset på streptavidin-belagt perler og tilhørende proteiner er elut og identifisert av massespektrometri. Denne metoden aktiverer selektiv målretting og isolering av HSV-1 replikering gafler eller hele genomer fra komplekse biologiske miljøer. Videre vil tilpasning av denne tilnærmingen tillate etterforskning av ulike aspekter av herpesviral infeksjon, samt undersøkelse av genomer andre DNA virus.
Introduction
Virus har begrenset kapasitet til å utføre grunnleggende funksjoner og derfor avhengig av vert faktorer for å lette kritiske aspekter av infeksjon inkludert viral genuttrykk, replikering, reparasjon, rekombinasjon og transport. Aktivitetene til disse vert faktorer er ofte forsterket av virally kodet proteiner. Dessuten, må virus unngå deteksjon og forstyrrelser av mobilnettet Svar å virusinfeksjon. Derfor diktere virus vert interaksjoner utfallet av infeksjon. Av avgjørende betydning er å forstå hvordan virus endre mobilnettet miljø for å tilpasse den cellulære maskineriet for å lette viral prosesser. Av spesiell interesse er å identifisere hvilke faktorer og prosesser handle på viral genomer gjennom smittsomme syklusen.
Herpes simplex er virus 1 (HSV-1) en dobbel strandet DNA virus som infiserer en betydelig del av befolkningen. I den første timen av infeksjon inn viral genomet kjernen, der en bestilte kaskade av viral genuttrykk følger sammen med viral replikasjon DNA (vDNA)1. I kjernen, genomer kan epigenetic regulering, gjennomgå reparasjon og rekombinasjon, og er pakket i capsids, slik at de første avkom virions produseres i mindre enn seks timer. Evaluering av viral genomet forbundet proteiner i løpet av infeksjon vil legge grunnlaget å etterforske molekylær detaljer om prosesser som handle på viral genomer og gir innsikt i hvilke viral og cellulære faktorer er involvert i ulike stadier av infeksjon.
Tidligere metoder for etterforskning av vert faktorer involvert i viral infeksjon inkluderer affinitet rensing av virale proteiner for analyse av tilhørende mobilnettet proteiner2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. disse analyser har vært medvirkende til å identifisere cellulære faktorer involvert i vert antiviral svar, samt viral chromatin endring, genekspresjon, og DNA-reparasjon. Det er imidlertid vanskelig å fastslå om interaksjoner, avhengig av tilknytningen vDNA og Proteomikk bare gi innsikt i samhandlinger som oppstår som en funksjon av en bestemt viral faktor. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er brukt til å identifisere hvor spesifikke viral og cellulær proteiner bindes til viral genomer,10,,11,,12,,13,,14 , 15 og fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kombinert med immunocytochemistry har aktivert visualisering av cellulære faktorer som colocalize med vDNA16,17,18, 19 , 20. disse analyser tillate romlige og tidsmessige analyse. Imidlertid omfatter begrensninger behovet for svært spesifikke antistoffer, begrenset følsomhet og behovet for forrige innsikt virus vert interaksjoner. Derfor utviklet vi en metode basert på iPOND (isolering av proteiner på begynnende DNA)21 og aniPOND (akselerert innfødt iPOND)22 selektivt etiketten og rense vDNA fra infiserte celler for objektiv identifikasjon av viral genomet tilhørende proteiner av massespektrometri. iPOND har vært instrumentell for etterforskningen av mobilnettet replikering gaffel dynamics.
For selektiv rensing av viral genomer fra infiserte celler, er replikere vDNA merket med ethynyl endret nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), etterfulgt av kovalente Bøyning til biotin azide via Klikk kjemi å lette enkeltsteg rensing av viral genomer og tilhørende proteiner på streptavidin-belagt perler (figur 2B). Viktigere, er infeksjoner gjennomført i stasjonære celler som ikke er engasjert i mobilnettet utryddelse aktivere bestemte merking av vDNA. Videre HSV-1-infeksjon forårsaker celle syklus arrestasjon og hemmer mobilnettet DNA replikering23,24. Virus kan prelabeled før infeksjon for analyse av proteiner forbundet med innkommende viral genomer (figur 1A) eller merket utryddelse for analyse av proteiner tilknyttet nylig syntetisk vDNA (figur 1B) 25. tillegg puls chase analyse kan brukes til å undersøke naturen av proteiner forbundet med viral replikasjon gafler (figur 1 c)26. I tillegg kan ethynyl endret vDNA være covalently konjugert til en fluorophore for romlig undersøkelse av protein dynamics (figur 2A og Figur 3). Bildebehandling tillater direkte visualisering av vDNA er en gratis metode for validering av vDNA-protein interaksjoner og kan tilpasses til å spore viral genomer gjennom infeksjon. Vi forventer at disse kan endres lenger å studere alle aspekter av herpesviral, inkludert ventetid og reaktivering, og å studere andre DNA virus. Videre kan merking med 5-ethynyl uridine (EU) tillate for analyse av RNA viral genomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur, virusinfeksjon og EdC merking ( figur 1)
følgende protokollen innebærer å arbeide med virus. Se din institusjon ' s bio-sikkerhet protokoller om sikker håndtering av virus og andre biologiske midler. Denne protokollen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret ved University of Pittsburgh.
- Trypsinize en confluent 150 cm 2 vev kultur kolbe MRC-5 celler og overføre cellene til en 600 cm 2 vev kultur plate inneholder 100 mL DMEM pluss 10% FBS. Ruge på 37 ° C i nærvær av 5% CO 2 i 3-4 dager nå confluency og stasjonære. En confluent 600 cm 2 rett inneholder ~ 7 x 10 7 celler. Forberede 1 plate for hver tilstand og 1 plate for hver tilsvarende negativ kontroll.
Merk: Celler må nå den stasjonære fasen å hemme mobilnettet utryddelse for å sikre at bare vDNA er merket og renset i de etterfølgende trinnene.
Merk: Hver krever en gratis umerkede negativ kontroll tilberedt med samme infeksjon betingelsene og tidspunkt uten tilsetning av EdC.
Merk: A nedskalert versjon av denne eksperiment bør utføres i tandem å teste for merking av mobilnettet DNA av bildevisning sammenlignbare cellevekst, infeksjon, EdC merking forhold, og tid poeng (se trinn 2). - Fortynne 7 x 10 8 PFU HSV-1 i 7 mL kaldt Tris-Buffered saltvann (SS). Fjerne oppblomstringen medium og lagre på 37 ° C. Infisere, legge til 7-mL utvannet viruset MRC-5 celler og rock 1t ved romtemperatur. Følgende adsorpsjon, fjerne inoculum, skyll med 50 mL romtemperatur TBS og erstatte den opprinnelige vekstmediet. Ruge på 37 ° C i nærvær av 5% CO 2. Dette trinnet skal utføres for hver eksperimentelle tilstand og negativ kontroll.
Merk: Økt EdC merking kan oppnås ved hjelp av HSV-1 mutanter defekt for uttrykket av viral dUTPase (UL50 gen) eller uracil glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase har lav substrat spesifisitet og kan redusere aktivering av flere nukleosid analogs 25 , 27. - Etiketten viral genomer med EdC. Følg instruksjonene for å merke innkommende genomer (1.3.1.), replikere genomer (1.3.2.) eller viral replikasjon gafler (1.3.3)..
Merk: Bare trinn 1.3.1, 1.3.2 eller 1.3.3 gjennomføres avhengig av om innkommende genomer, repliserte genomer eller replikering gafler er å bli analysert i de etterfølgende trinnene, henholdsvis.
Merk: EdU eller f-ara EdU kan erstattes for EdC. Toksisitet av nukleosid analogs bør overvåkes og minimert.- Bruk prelabeled å utføre infeksjon i trinn 1.2 og fortsette til trinn 2 eller 3 4 h legge infeksjon (hpi) for å undersøke unreplicated vDNA ( figur 1A).
Merk: Forberede prelabeled virus aksjer med tidligere beskrevet protokollen 25. Virus aksjer må sendes via en G-25-kolonnen for å fjerne eventuelle gjenværende EdC. - Etikett etterligner vDNA ved å legge til 5-25 µM EdC til celle kultur medium av infiserte celler for 2-4 h ( figur 1B). Før du legger til, fortynne EdC i 1 mL av oppblomstringen medium.
- Merke viral replikasjon forks, etter utbruddet av vDNA replikering (≥ 4 hpi), puls etiketten replikere vDNA med 5-25 µM EdC i 5-20 minutter. For å jage, skyll 3 x med chase medium som inneholder 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), og deretter Inkuber i nærvær av chase medium for en ytterligere 20-40 minutter ( figur 1 c).
Merk: Puls og chase medium bør være equilibrated 37 ° C og 5% CO 2 før bruk.
Merk: For puls chase eksperimenter er det viktig å vurdere hvor lang tid det tar for nucleosides til å angi cellen og bli fosforylert før de kan bli innlemmet i replikere DNA. Dette må avgjøres empirisk.
Merk: For å bestemme puls chase eksperimenter, beregne viral replikasjon hastigheten under eksperimentelle forhold brukes. Dette kan bestemmes av kvantitative PCR av viral genomer under en enkelt trinn vekst tid kurs 26.
Merk: For imaging viral genomer fortsette til trinn 2 og for rensing av viral genomer går videre til trinn 3.
- Bruk prelabeled å utføre infeksjon i trinn 1.2 og fortsette til trinn 2 eller 3 4 h legge infeksjon (hpi) for å undersøke unreplicated vDNA ( figur 1A).
2. Avbildning av EdC merket DNA ( figur 2A)
Merk: det er nyttig å utføre bildebehandling i tandem med viral genomet rensing metoden for å bekrefte at mobilnettet DNA ikke er merket i eksperimenter. Bildebehandling kan også brukes til å visualisere hva slags merket vDNA og Proteomikk datavalidering. Eksempler på mobilnettet og viral DNA flekker mønstre vises i Figur 3.
- Utføre infeksjoner og EdC merking som vist i trinn 1, bortsett fra bruker nedskalert forholdene på coverslips i en 12-vel vev kultur parabol med 1 mL av oppblomstringen medium.
- Fastsette celler med 1 mL 3,7% paraformaldehyde i 1 x PBS i 15 min på RT. Etter fiksering, skyll celler 2 x med 1 mL 3% BSA i PBS.
Forsiktig: Paraformaldehyde kan forårsake alvorlige eller permanent skade. Følg sikkerhetsreglene.
Merk: Protokollen kan pauses her og coverslips kan lagres på 4 ° C i andre vask for opptil 3 dager. - Permeabilize celler med 1 mL permeabilization buffer [se Tabellen for materiale] for 20 min ved romtemperatur mens rocking.
- Skyll med 1 mL av 3% BSA og blokk med 1 mL 3% BSA i PBS i 30 min ved romtemperatur mens rocking.
- Legge til 1 mL av Klikk reaksjonen cocktail [se Tabellen for materiale] å coverslips å covalently bøye Alexa Fluor 488 azide til EdC merket DNA. Inkuber ved romtemperatur for 30 min mens rock. Sug opp og skyll to ganger med 1 mL av PBS.
- Flekk mobilnettet DNA med 1 mL av en 1:2,000 fortynning av Hoechst i PBS i 30 min ved romtemperatur mens rock. Sug opp og skyll to ganger med 1 mL av PBS.
- Flekk med primære og sekundære antistoffer ifølge standarden indirekte immunofluorescence protokoller 25.
Merk: Merket vDNA colocalizes med ICP8, ICP4 eller UL42 og merket mobilnettet DNA colocalizes med Hoechst flekken. - Montere coverslips på lysbilder og image celler ved hjelp av mikroskop fluorescens.
Merk: Lysbilder kan lagres på 4 ° C i flere uker.
3. Rensing av vDNA og tilhørende proteiner
Merk: flere aspekter av denne protokollen er tilpasset fra Leung et al. 22
Merk: alle buffere og reagenser bør bli kjølt på is før bruk og alle trinnene bør utføres på is med mindre annet er angitt.
- Høste atomkjerner.
Merk: Før isolasjon av kjerner, formaldehyd kan brukes krysskobling proteiner til DNA. Strengere vask betingelser kan deretter brukes under DNA rensing på streptavidin-belagt perler. For crosslinking og vask se Sirbu et al. 21.- erstatte oppblomstringen medium med 20 mL kjerner utvinning Buffer (NEB) og Inkuber etter 20 min på 4 ° C med sporadiske rocking. Kjerner blir synlig i mikroskopet.
- Skrape kjerner fra platen med en celle skraper og overføre til en 50 mL konisk rør. Sentrifuge for 10 min 2500 x g på 4 ° C pellets kjerner, forkaste nedbryting.
Merk: Trypan blå flekker kan brukes til å bekrefte isolering av kjerner fra cellene. - Forsiktig fjerne den kjernefysiske pellet i 10 mL PBS, overføring til en 15-mL konisk tube, og pellets av sentrifugering i 10 min 2500 x g på 4 ° C. helt Fjern PBS.
Merk: Kjerner kan fryses og protokollen kan pauses på dette punktet. Gjør forsiktig resuspend den kjernefysiske pellet i 500 µL frysing buffer og Inkuber røret i en etanol/tørr isbadet. Lagre frosne kjerner på-80 ° C. Før bruk, tine kjerner i romtemperatur, raskt overføre til is, tilsett 10 mL PBS, rock forsiktig å blande, pellets med sentrifugering i 10 min 2500 x g ved 4 ° C, og fjerne PBS. Frysing kjerner kan føre til redusert utbytte.
- Covalently konjugat biotin-azide til EdC merket vDNA.
- Resuspend den kjernefysiske pellet 10 mL Klikk reaksjon blande [se Tabellen for materiale] ved forsiktig pipettering opp og ned 5 ganger med en 10 mL pipetter.
Merk: Det er viktig at reagenser i Klikk reaksjonen blanding er lagt i den angitte rekkefølgen. - Rotere 1t på 4 ° C. Mens rotere forberede og chill buffere T1, T2 og T3 [se Tabellen for materiale].
- Pellets kjerner av sentrifugering i 10 min 2500 x g på 4 ° C. helt fjerne Klikk reaksjonen blanding og vaske pellet forsiktig resuspending i 10 mL PBS og sentrifugering i 10 min 2500 x g på 4 ° C.
- Resuspend forsiktig kjernefysiske pellet i 1 mL PBS og overføre til en 1,5 mL microfuge rør med en stor bar pipette tips. Pellets kjerner av sentrifugering i 10 min på 2500 x g ved 4 ° C. helt Fjern PBS og flash fryse i flytende nitrogen.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og frosne kjerner kan lagres på-80 ° C. fryse tine hjelper med påfølgende lysis anbefales at kjerner være flash frossen selv når du går videre til trinn 3.3 på samme dag.
- Resuspend den kjernefysiske pellet 10 mL Klikk reaksjon blande [se Tabellen for materiale] ved forsiktig pipettering opp og ned 5 ganger med en 10 mL pipetter.
- Lyse kjerner og fragmentere DNA.
- Tine kjerner på is og resuspend i 500 µL Buffer B1 av pipettering opp og ned. Ruge på is 45 min.
- Sonicate prøver 6 ganger for 30 s hver på 40% amplituden ved hjelp av en 3 mm microtip sonde. Sett prøvene på is 30 s mellom pulser. Etter sonication, prøver skal vises tydelig, ikke skyet.
Merk: Sonication betingelser skal være optimalisert for individuelle sonicators. Detaljerte instruksjoner om hvordan du optimaliserer sonication betingelser gjelder Leung et al. 22. - pellets celle rusk av sentrifugering 14.000 x g i 10 min på 4 ° C. Pellet størrelsen bør redusere betydelig. Filtrere nedbryting gjennom 100 µM celle sil og beholde flyten gjennom.
- Legge til 500 µL Buffer B2 til den filtrerte nedbryting. 900 µL i dette eksemplet brukes i trinn 3.4.2.
- Tar en aliquot av hver betingelse for DNA isolasjon (50 µL eller 1/20 volum) og legge 50 µL 2 x SDS-bicarb løsning [se Tabellen for materiale]. Videre til DNA isolasjon protokollen (trinn 3,6).
- Tar en aliquot av hver betingelse for input protein (50 µL eller 1/20 volum) og legge til 50 µL 2 x Laemmli eksempel buffer, fryse i flytende nitrogen og lagre på-80 ° C. Bruk i trinn 3.5.6.
- Bind biotinylated DNA til streptavidin belagt perler.
- Forberede Streptavidin T1 magnetiske perler ved å overføre 300 µL av perle slurry til en 1,5 mL microfuge tube. Forberede en tube av perler per prøve. Vask perler 3 x med 1 mL Buffer B2 av vortexing til resuspend, bruke en magnet for å skille perler og aspirating vaskebuffer.
Merk: Optimalisert bindende betingelser føre maksimere avkastning og minimal bakgrunn bindende. Det identifiserte eksperimentelt at Streptavidin T1 magnetiske perler har en betydelig større innbindingen behandlingskapasitet enn agarose perler, samt andre Streptavidin perler, og mindre bakgrunn bindende enn Streptavidin C1 perler ( figur 4A ). - Legge til 900 µL av eksempel fra trinn 3.3.4. vasket perler og roter overnatting på 4 ° C.
Merk: Gjør ikke vortex perler når prøven er lagt til dem.
Merk: Hvis betydelige mengder DNA eller protein er isolert i umerkede negativ kontroll, dette trinnet kan reduseres fra overnatting til 4 h å redusere bakgrunn bindende.
- Forberede Streptavidin T1 magnetiske perler ved å overføre 300 µL av perle slurry til en 1,5 mL microfuge tube. Forberede en tube av perler per prøve. Vask perler 3 x med 1 mL Buffer B2 av vortexing til resuspend, bruke en magnet for å skille perler og aspirating vaskebuffer.
- Vask perler og elute vDNA og tilhørende proteiner.
Merk: Det anbefales å bruke filteret tips for resterende trinn.- Sted prøver i et magnetisk microfuge tube rack, Fjern nedbryting, forsiktig resuspend i 1 mL Buffer B2, rotere med 4 ° C i 5 min.
- Gjenta trinn 3.5.1 tre ganger.
- Plasser prøvene i en magnetisk microfuge tube rack, fjerne nedbryting, forsiktig resuspend i 1 mL Buffer B3, og vri på 4 ° C i 5 min.
- Overføre 100 µL perle blanding (1/10 th volum) til en ny tube bundet DNA isolering. Dette røret gjelder magneten, fjerne nedbryting, resuspend perler i 100 µL 1 x SDS-bicarb løsning og fortsette til DNA isolasjon protokollen (trinn 3,6).
- Bruke røret som inneholder den gjenværende 900 µL perle blandingen fra trinn 3.5.3. magnet, fjerne nedbryting og resuspend perler i 50 µL 2 x Laemmli eksempel buffer elute protein og DNA-protein komplekser.
- Koke eksempler på 95 ° C i 15 min, vortex, raskt spinne i microfuge og bruke magnet. Overføre eluate til en ny tube, flash fryse og butikk på-80 ° C.
Merk: Bruk cap låser å sikre at rør ikke pop åpne mens kokende.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet og prøver kan lagres på-80 ° C i flere uker. - Analyser protein prøver av Coomassie blå flekker, vestlige blotting eller massespektrometri av standard prosedyrer 25. Representant resultater er vist i Figur 4 og figur 5.
Merk: for å avgjøre hvis protein avkastning er tilstrekkelig for massespektrometri, 7,5 µL av hvert utvalg er brukt for analyse av Coomassie blå flekker og 7,5 µL for vestlige blotting av en representant viral genomet tilknyttede protein (ICP4, ICP8 eller UL42). Den samme mengden lysates fra trinn 3.3.6. kjøres sammen med kontroll for input protein nivå. Resterende utvalget (35 µL) er deretter analyseres av masse massespektrometri som beskrevet tidligere 25.
- DNA isolasjon
- ruge prøvene fra trinn 3.3.5. og 3.5.4. ved 65 ° C i 4-16 h. Fjern prøver fra magnetiske perler, eventuelt.
- Ekstra prøver med 150 µL fenol: kloroform: isoamyl alkohol (PCI) og overføre den vandige fasen til en ny tube.
- Pakke gjenværende PCI med 100 µL Tris-EDTA (TE) og legge den vandige fasen til en ny tube.
- Pakke ut prøver med 200 µL kloroform: isoamyl alkohol (24:1).
- Renser den vandige fasen bruker PCR rensing Kit ifølge produsenten ' s protokollen.
Merk: Indikatoren pH i Buffer PB vil slå lilla når lagt til utvalget. Legge til 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5.0 å senke pH i prøven. - Bestemmer DNA konsentrasjon ved hjelp av en fluorometer.
Merk: Denne protokollen gir vanligvis 100-400 ng perle-bundet DNA. Ingen DNA skal oppdages i eluate i kontrollen negative som EdC ikke ble lagt i trinn 1.3. - DNA kan lagres i en lav DNA-binding rør på 4 eller -20 ° C og kan brukes for sanntids PCR eller høy gjennomstrømning sekvensering analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruk av Klikk kjemi for rensing av DNA fra celler ble først gjort av iPOND metoden21. Formålet med iPOND er å rense mobilnettet replikering gafler for identifikasjon av tilhørende proteiner. Vi har tilpasset denne teknikken for å studere spesielt vDNA protein interaksjoner under infeksjon. Manipulering av tilnærming til etiketten viral genomer med EdC (figur 1), kombinert med synkroniserte infeksjoner, har tillatt for selektiv isolasjon og undersøkelse av egen befolkningen i vDNA. HSV-1 DNA er merket med EdC (figur 1) å lette kovalente vedlegg i en fluorophore for avbildning eller biotin for rensing (figur 2). Virus kan prelabeled før infeksjon for analyse av proteiner forbundet med innkommende genomer (figur 1A) eller merket utryddelse for analyse av proteiner tilknyttet nylig syntetisk vDNA (figur 1B)25. Videre kan puls chase analyse brukes til å undersøke naturen av proteiner forbundet med viral replikasjon gafler (figur 1 c)26. DNA kan visualiseres i celler å gi romlig informasjon om merket DNA og støtte for identifisert vDNA-protein interaksjoner (Figur 3). Samlet kan protokollene beskrevet her proteomic undersøkelse av flere aspekter av produktiv infeksjon for å gi innsikt i dynamiske endringer som oppstår på HSV-1 genomer. Disse metodene kan ytterligere tilpasses for å undersøke ventetid og reaktivering, undersøke fenotyper forbundet med viral mutanter, og å studere andre DNA og RNA-virus.
Aspekter av denne protein rensing metoden var tilpasset fra Leung et al. 22. her en stor forbedring for rensing av EdC merket DNA er bruk av Streptavidin T1 perler i stedet for streptavidin-belagt agarose perler. For å optimalisere DNA rensing, ble flere typer streptavidin-belagt perler testet for uspesifikke bindingen når infeksjon ble gjennomført i fravær av EdC og for maksimal protein utvinning i nærvær av EdC (figur 4A). For disse eksperimentene, ble vestlige blotting gjennomført for vDNA innbindingen protein ICP4. Rene på Streptavidin T1 perler resulterte i minst bakgrunn bindende i fravær av EdC og maksimal protein utvinning i nærvær av EdC.
Proteiner knyttet vDNA kan identifiseres ved proteomic metoder, inkludert vestlige blotting og massespektrometri. Vestlige blotting kan brukes til å undersøke dynamikken i kjente interaksjoner og massespektrometri kan brukes som en upartisk tilnærming til å identifisere romanen vDNA tilhørende proteiner. Et eksempel på protein gi som en funksjon av økende EdC merking er vist i figur 4B. En smear, i stedet for et klart stripemønster, er vanligvis observert av Coomassie blå flekker. Dette er sannsynligvis fordi det er DNA i protein prøven eller fordi det er en overflod av protein. Det er også viktig å merke seg at kobber katalysator brukes i Klikk reaksjonen kan forårsake delvis nedbrytning av proteiner og nukleinsyrer28,29. Av vestlige blotting, er lignende nivåer av ICP4 vanligvis funnet i eluates (trinn 3.5.5.) etter rensing av vDNA som ble kalt for 60 min med EdC som det finnes i samme mengde input eksempel forberedt fra kjernefysiske lystates (trinn 3.3.6.). Denne informasjonen kan brukes som en guide til å fastslå om utvinning er tilstrekkelig å sende resterende utvalget for masse spectrometric analyse.
Nano flytende kromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) kan utføres som beskrevet tidligere25 for å identifisere proteiner tilknyttet renset vDNA. LC--MS-/ MS data er analysert ved å sammenligne spectral teller (SpC) verdier mellom EdC-merket eksperimentelle prøven og tilhørende umerkede negativ kontroll. Proteiner er betraktet som å bli beriket i eksperimentell utvalget basert på følgende kriterier: 1) protein har minst 5 spectral teller (SpC) i eksperimentell utvalget, 2) protein ikke oppdages i kontrollen eller berikes over kontrollen av minst firling basert på dele SpC verdier og 3) protein er beriket over kontrollen i to eller flere biologiske gjentak. Den normaliserte spectral overflod faktoren (NSAF: 
) kan brukes hensyn til forskjeller i molekylvekt (MW) og total protein avkastning. Dette bestemmer den relative overfloden av personlige proteiner i et utvalg og tillater direkte sammenligning av to forskjellige eksperimentelle forhold der ulike mengder vDNA blir renset (for eksempel sammenligne input viral genomer ( Figur 1A) til replikert du genomer (figur 1B)).
Det er flere måter å presentere protein berikelse data. Eksempler inkluderer sektordiagrammer, Venn-diagrammer og protein samhandling nettverk. Sektordiagrammer kan brukes til å illustrere andelen proteiner identifisert som er kjent for å fungere i en bestemt biologisk prosess (figur 5A). Men kan problemer oppstå når en protein har flere biologisk funksjon, som ofte er tilfelle. Det er også vanskelig å sammenligne data over forskjellige sektordiagrammer. Venn-diagrammer er nyttige for å vise relasjoner mellom proteiner identifisert under ulike eksperimentelle forhold, men gir ikke funksjonelle informasjon om proteiner identifisert (figur 5B). Protein samhandling nettverk portrettere en visuell illustrasjon av potensielle interaksjoner mellom identifiserte proteiner og gi informasjon om hvilke biologiske prosesser som er involvert (figur 5C). Flere Internett-ressurser er tilgjengelige for tilordning spådd protein-protein interaksjoner inkludert streng (søkeverktøyet for henting av samspill gener/proteiner)30. Online verktøy er vanligvis utstyrt til å håndtere Proteomikk data fra en rekke arter og gi verdifull informasjon om vert proteiner involvert i viral genomet mekanikk. Imidlertid er virale proteiner vanligvis ikke inkludert i databaser, som kan komplisere analyse. Derfor er det viktig å vurdere de viktigste konklusjonene man ønsker å formidle når beslutter hvor å presentere Proteomikk data.
Figur 1:Ong > tilnærminger til etiketten HSV-1 DNA. (A) til analysen delstaten innkommende virus, hvile MRC-5 celler i G0 er infisert med HSV-1-prelabeled og genomer er assayed på mindre enn 4 hpi å studere unreplicated virus-DNA. (B) til analysen delstaten replikert virus, MRC-5 celler er infisert med umerkede HSV-1 og EdC (oransje stjerner) er lagt til vekstmediet av infiserte celler og ruges i 2-4 h etter utbruddet av viral utryddelse (≥4 hpi). (C) til analysen viral replikasjon forks, infiserte celler er puls merket med EdC for 5-20 min. replikering gafler kan deretter bli jaget med deoxyC. EdC merket DNA er oransje. Dette tallet er endret fra Dembowski & DeLuca25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fremgangsmåtene i dette dokumentet for analyse av EdC merket DNA. (A) en oversikt over metoden for bildebehandling EdC merket DNA. Merket DNA er representert i grønt. (B) en oversikt over metoden for rensing og nedstrøms analyse av EdC merket vDNA. Dette tallet er endret fra Dembowski & DeLuca25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Visualisering av EdC merket DNA. Celler var infisert, merket og fotografert som beskrevet i figur 1 og figur 2. Representant bilder merket mobilnettet og viral DNA vises. Mobilnettet DNA colocalizes med Hoechst flekken og vDNA med ICP4. Skala bar: 5 µm.This figur ble endret fra Dembowski og DeLuca25 og Dembowski et al. 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant protein rensing resultater. (A) sammenligning av protein avkastning når rensing trinn ble gjennomført ved hjelp av flere forskjellige typer streptavidin belagt perler. Infeksjon ble gjennomført i nærvær av EdC (+) til å sammenligne protein avkastning eller i fravær av EdC (-) til å sammenligne bakgrunn bindende. Infeksjoner og EdC merking ble utført som beskrevet i figur 1B og DNA-protein komplekser ble renset i henhold til fremgangsmåten i figur 2B med tilsvarende mengder av forskjellige typer streptavidin belagt perler. Topp panel: sammenligning av protein avkastning etter rensing på streptavidin belagt agarose perler eller Streptavidin M-280. Nedre panelet: sammenligning av protein avkastning etter rensing på Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 eller Streptavidin T1. Vestlige blotting ble gjennomført med et antistoff mot viral protein ICP4. Renset ICP4 vises i første kjørefelt for sammenligning. Lengre eksponering av det nedre panelet var nødvendig å observere en lignende intensiteten av ICP4 i baner "280" i toppanelet. (B) representant protein rensing resultatene som en funksjon av tiden av EdC merking vises. Infeksjoner og EdC merking ble utført som beskrevet i figur 1B og DNA-protein komplekser ble renset i henhold til fremgangsmåten i figur 2B bruker Streptavidin T1 perler. EdC merking ble gjennomført for 0, 20, 40, eller 60 min og Coomassie blå flekker (øverst) og vestlige blotting (nederst) resultatene vises. Vestlige blotting ble gjennomført med antistoffer spesifikke for ICP4, UL42 eller GAPDH. Eluate prøven ble tatt fra steg 3.5.5. og lysate fra trinn 3.3.6. Pilen viser streptavidin, mens L angir protein stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempler på forskjellige måter å presentere Proteomikk data. (A) sektordiagrammer oppsummere proteiner som ble identifisert av massespektrometri av protein eluates forbundet med viral genomer renset på 6 hpi. Verdiene indikerer antall proteiner identifisert for hver funksjonell kategori. T angir antall proteiner identifisert. Fargene angir følgende kategorier: lilla - RNA behandling, rød - transkripsjon, grønn - chromatin remodeling, oransje - utryddelse, gul - kjernefysiske transport, teal - cytoskjelett, mørk blå - HSV strukturelle proteiner og grå - andre/ukjent. (B) diagram viser overlappingen av proteiner kjennemerke for å bli assosiert med viral genomer 6, 8 eller 12 hpi. (C) en streng kartet viser proteiner beriket på viral replikasjon gafler etter 5 min EdC puls. Menneskelige proteiner beriket av 5-fold sammenlignet med umerkede negative kontrollen vises i funksjonell samhandling kartet, som ble generert ved hjelp streng30 med innstillingene for å vise bare høy tillit interaksjoner. Gene navn ble brukt til å tilordne interaksjoner. Sirklene viser proteiner som fungerer i samme biologisk prosess. Dette tallet ble endret fra Dembowski og DeLuca25 og Dembowski et al. 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen inneholder flere trinn som, hvis ikke den følges nøye, kan resultere i betydelig redusert protein avkastning eller forurensning med cellular DNA. Det er viktig at stasjonære celler brukes for alle eksperimentene slik at mobilnettet DNA ikke er merket og renset. Dette kan bekreftes av fraværet av mobilnettet DNA polymerases i protein utvalget fordi HSV-1 ikke utnytter mobilnettet DNA polymerase for genomet syntese. Under EdC merking og kjerner høsting trinnene, bør prøver være forskjøvet slik at hver behandles likt. I rensing trinnene, bør utvises ikke å manipulere kjerner av pipettering for mye. Dette kan føre til tidlig lysis av kjerner, samt prøve tap på grunn av stikker til sidene av Pipetter tips. Videre sonication trinnet skal være optimalisert for individuelle sonicators og hvor mye streptavidin-belagt perler brukt for biotin bindingen bør være titreres for optimal protein avkastning.
Flere endringer gjøres til denne protokollen og inkluderer bruk av ulike virus eller celletyper eller å legge til et trinn til krysskobling protein DNA. Når du velger en celle du vil bruke til proteomic undersøkelse, er det viktig å kontrollere om anvendeligheten av en protein sekvens database for at arter. En mangel på Proteomikk ressurser, begrenses betydelig nedstrøms analyse av protein data. En annen begrensning er behovet for et stort antall celler, derfor kan det være vanskelig å forberede nok primære celler, for eksempel neurons, dette eksperimentet. Denne metoden skal være kompatibel med andre DNA eller RNA virus som virusinfeksjon ikke er avhengig mobilnettet utryddelse. Videre, det ville være interessant å utforske endringer i DNA-protein interaksjoner som forekommer i HSV-1 mutanter. En annen endring til denne protokollen kan være tillegg av en formaldehyd crosslinking trinn før isolering av kjerner, som ville tillate for strengere vask forhold under rensing21. Tillegg av formaldehyd vil ikke påvirke muligheten til å høste kjerner, men kan resultere i redusert protein avkastning på grunn av så lett snu krysskoblinger under protein elueringsrør.
Resultater fra denne protokollen representerer den gjennomsnittlige delstaten virus-DNA undersøkt. Derfor er det vanskelig å skille hvis komplekser sammen på samme eller separat DNA molekyler. vDNA merking metodene som er beskrevet her i kombinasjon med høy oppløsning bilder kan brukes til å bekrefte Proteomikk data og kan bidra til å skille mellom forskjellige populasjoner av merket DNA i en celle. Videre kan ChIP-seq brukes som en oppfølging metoden til å identifisere bestemte områder av proteiner på viral genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner Hannah Fox for hjelp i utarbeidelsen av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
