Denne protokollen er å komme seg og forberede sjeldne målcellene fra en blanding med ikke-mål bakgrunn celler for molekylær genetisk karakterisering på encellede nivå. DNA kvalitet er ikke behandlet enkeltceller og tillater encellede program (begge screening basert og målrettet analyse).
Sjeldne målcellene kan isoleres fra en høy bakgrunn av ikke-målet celler ved hjelp av antistoffer spesifikke for overflate proteiner av målcellene. En nylig utviklet metoden bruker en medisinsk wire functionalized med anti-epitelial celle vedheft molekyl (EpCAM) antistoffer i vivo isolering av sirkulerende tumor celler (CTCs)1. En pasient-matchet kohort i ikke-metastatisk prostatakreft viste at i vivo isolasjon teknikken resulterte i en høyere prosentandel av pasienter positiv for CTCs samt høyere CTC teller i forhold til gjeldende gullstandarden i CTC opplisting. Som cellene kan gjenopprettes fra gjeldende medisinsk utstyr, ble en ny functionalized wire (referert til som enhet) produsert slik at fangst og påfølgende avdeling av celler av enzymatisk behandling. Cellene kan feste til enheten, visualisert på et mikroskop og frittliggende bruke enzymatisk behandling. Gjenopprettede celler er cytocentrifuged på membran-belagt lysbilder og høstet individuelt ved hjelp av laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver er så utsatt for encellede hele genomet forsterkning tillater flere nedstrøms analyse inkludert sortering og mål-spesifikke tilnærminger. Prosedyren for isolasjon og gjenoppretting gir høy kvalitet DNA fra enkeltceller og svekke ikke påfølgende hele genomet forsterkning (WGA). En enkeltcelle forsterket DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som matrise sammenlignende genomet hybridisering (matrise-CGH) eller sekvenser. Enheten kan ex vivo isolasjon fra kunstig sjeldne celle prøver (i.e. 500 målcellene piggete i 5 mL av perifert blod). Mens avdeling celler er akseptabel (50-90%), utvinningsgrad på frittstående celler på lysbilder spenner over en rekke som er avhengige av cellen linjen brukes ( 50%) og trenger litt mer oppmerksomhet. Denne enheten er ikke fjernet for bruk i pasienter.
Nylig ble CellCollector DC01, en medisinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer for å isolere CTCs fra perifert blod av pasienter, lagt til metodisk spekteret av CTC opplisting1,2,3 . I en pågående studie i ikke-metastatisk prostatakreft, denne functionalized wire rapporter nesten dobbelt så mange pasienter skal CTC-positive og høyere CTC teller i CTC-positive pasienter i forhold til CellSearch, gullstandarden i CTC opplisting3 . På grunn av denne oppmuntrende ytelse, isolering av celler fra en functionalized medisinske wire for én celle analyse ville være ønskelig, men verken enzymatisk behandling med cellen avdeling løsninger (f.eks trypsin) eller laser microdissection tillater utvinning av intakt celler (data ikke vist).
Hvis brøkdel av fanget celler, var en ny generasjon functionalized ledninger utstyrt med en bestemt polymer. Dette polymer, som forbinder fange antistoffer til ledningen, er utsatt for utgivelsen buffer behandling slik at avdeling av intakt celler (CellCollector DC03 referert til som enhet). Nye functionalized enheten lar isolering av målcellene fra ulike konsentrasjoner av cellen linje kreftceller piggete i bovin serum albumin (BSA) / fosfat bufret saltvann (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For å lette visuell gjenkjenning av celler på enheten og etter utvinning, målet kreftceller er merket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA flekk før utvinne behandling (dvs. lading og frakobling). Behandlings effekter på DNA kvaliteten på enkeltceller ble tidligere vurdert etter WGA ved hjelp av en kvalitetskontroll PCR4,5, matrise-CGH6,7 og målrettet sekvensering7 viser ingen forskjell sammenlignet med ikke-behandlet celler micromanipulated celle suspensjoner7. Fordelen med denne metoden ligger i kombinasjonen av sjeldne målcellen pre berikelse og utvinning av celler i én celle nedstrøms analyse (figur 1). Gjeldende CE-merket i vivo samlingen enheten brukes vanligvis for opplisting av CTCs i stedet for én celle molekylær karakterisering2,8. Men mer omfattende analyse å undersøke heterogenitet blant CTCs etter analyse på enkeltcelle nivå (i.e. målrettet sekvensering på encellede nivå). Andre cellebasert metoder er basert på immunomagnetic isolasjon av EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering basert på dielectrophoresis for påfølgende molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering av CTCs er en viktig forutsetning for gjennomføring deres nyttig i en klinisk setting og er like viktig i grunnleggende forskning av metastatisk kaskade. Parallelt med CTCs, har sirkulerende svulst DNA (ctDNA) blitt av stor betydning da DNA-analyse av tumor byrden med minimal teknisk isolasjon prosedyrer11,12. Cellen basert tilnærminger kan tjene som et supplerende bidrag som gjør det mulig for RNA13,14 og protein15 uttrykk analyse og også for CTC avledet celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om hindringer som lav celle utvinning og klarering for bruk i pasienter fremdeles må overvinnes, Fang og slipp metoden tar et viktig neste skritt mot karakteristikk av sjeldne målcellene.
Beskrevet protokollen tar sikte på å hente celler fra en functionalized wire (referert til som enhet) for ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testet tre EpCAM-positive linjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i prinsippet kan denne metoden brukes til enhver celle linje uttrykke EpCAM. EpCAM-positive målcellene kan presenteres på enheten som ren celle suspensjon (se 2.1.) eller blandet inn i et overskudd av bakgrunnen celler (f.eks. perifert blod, se 2.2.). Mens spesielt sistnevnte kan brukes til å teste isolasjon kapasiteter under sjeldne celle forhold, finjustering av antall celler knyttet til ledningen kan gjøres med det beskrevet lav-volumet tilnærming (se 2.3.). Forskjeller mellom linjer er å forvente, hastighet egnet cellen tettheter for lading ledningen, rotasjon samt inkubasjonstiden må testes empirisk ved å evaluere antall tilknyttede celler ved hjelp av en immunofluorescence mikroskop.
For genomisk nedstrøms programmer på én celle nivå WGA, kreves. WGA metoden for valg kan variere mellom laboratorier, og i prinsippet vår metode er åpen for alle metoder enn kan håndtere prøver innhentet fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokollen bruker vi en metode basert på enzymatisk fragmentert DNA på grunn av en bedre ytelse i forhold til en varme-fragmentering basert WGA7. Valgfritt, enkelt celler kan bli videresendt til isotermiske WGA slik at etterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tar sikte på å gjenopprette intakt celler etter å være knyttet til en ny generasjon functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generasjonen av functionalized ledninger, som også representerer berikelse bare CE-godkjent i vivo enheter på markedet så langt, ble brukt for opplisting CTCs i metastasized kreftpasienter. Tidligere publikasjoner og våre egne data tyder isolasjon i vivo teknikk for å være mer følsomme forhold til gjeldende gullstandarden teknologi2. Derfor kan utstyre denne i vivo isolasjon teknikken med en funksjon for gjenoppretting som realiseres i enheten kombinere høy CTC utvinning med karakterisering på encellede nivå.
Men enheten fjernes ikke for bruk i pasienter, dermed kliniske data er ikke tilgjengelig. Ex vivo programmer (dvs. isolere CTCs fra perifert blod etter utvalg) anbefales ikke som teknologien er tilpasset innstillingene i cubital forgjeves, f.eks lav diameteren på den forgjeves (øke sannsynligheten for direkte kontakt mellom CTCs og fange antistoffer) og lange tiden (30 min, slik at 2-3 L blod skjedde ledningen). Men som beskrevet i delen 2.2. målcellene kan også være isolert fra blandet prøver7.
En gjeldende begrensning av metoden er ineffektiv utvinning av unfixed celler etter løsgjøring fra ledninger. Dette kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering trinn før avdeling behandling.
I sammendraget er denne protokollen et første skritt mot kombinert bruk av en i vivo isolasjon teknikk med celle utvinning for å karakterisere genmodifiserte enkeltceller. Ytterligere innsats må ta optimalisering av celle utvinning og klarering for dens anvendelse i pasienter1,2. Personlig medisin for behandling overvåking og terapi beslutninger er imidlertid utover opplisting av CTCs. Dermed er denne metoden et første skritt mot genomisk CTC karakterisering på enkeltcelle nivå.
Søknader mot encellede transcriptome analyse synes mulig som intakt celler er høstet. Men gjenstår det å bli vurdert om utvinne prosedyren har en innvirkning på RNA integritet (f.eks videresending gjenopprettede enkeltceller til direkte lyse etterfulgt av RT-qPCR22). Hvis karakteristikk av enkeltceller (f.eks CTCs) kan bli forskjøvet til transcriptome nivå, slik at mer detaljerte analyser. I denne forbindelse, RNA-seq bruker Smart-seq2 gir et verdifullt verktøy for RNA nedstrøms analyse av enkeltceller som preamplified cDNA (innhentet under RNA-seq biblioteket forberedelse) kan utsettes for kvantitative PCR. Dette vil tillate en kombinert mål og screening-basert analyse av enkeltceller gjenopprettede22,23.
Gjeldende functionalized ledninger er basert på anti-EpCAM antistoffer som er en mye brukt epithelial for positiv utvalg av CTCs24. Som flere CTCs kan downregulate epitel markører som cytokeratins eller EpCAM25, vil legge antistoffer som HER2/nye øke sjansen for CTC isolasjon. Flere antistoff basert berikelse strategier er utviklet og gjennomgått av Ferreira et al. i 201626. En blanding av antistoffer immobilisert på en wire kan være en fremtidig forbedring av teknologien fører til isolasjon av mange og flere undergrupper av CTCs.
Det er obligatorisk for alle foranstaltningene innvolvere wire håndtering for å holde den funksjonelle delen av ledningen neddykket i løsning for å opprettholde sin funksjonalitet. Vi anbefaler for å plassere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; f.eks. trinn 3.1. -3.3.) og lagring. For å unngå upassende flekker, anbefaler vi nymalt forberedt flekker løsning i trinn 1.2.1. og 1.2.2. Svakt farget celler hemmer celle teller på ledningen og kan føre til undervurdering av tilknyttede cellene.
Er det nødvendig å unngå koble Pasteur pipette med gummi cap når setter inn ledningen i Pasteur pipette for påfølgende lasting av cellen suspensjon (trinn 2.3.4.). Gummi cap brukes til å holde wire på plass slik at den funksjonelle delen ligger inni tuppen av Pasteur pipette. Hvis hetten er tilknyttet for fast på baksiden av Pasteur pipette, er lasting av cellen suspensjon ikke mulig. I dette tilfellet lette hetten slik at luften som er fortrengt av lastet celle suspensjon kan la pipette.
Bøye ledningen er avgjørende for retningen under cellen teller i trinn 3.2. og 3.3. Montere ledninger med teip slik at ikke-fungerende slutten av ledningen kommer å ligge på en side. Etter skanning av hele lengden av funksjonelle rulles ledningen 180° så den andre halvdelen av funksjonelle ledningen kan skannes. Dette trinnet er viktig for initial eksperimenter å vurdere antall celler på ledningen. Når antall celler for en bestemt celle linje og prosedyre evalueres, fremgangsmåten kan gjentas uten celle teller (f.eks. bare sjekke for tilstedeværelsen av celler eller utelate dette trinnet). Forsiktig pipettering er avgjørende for å unngå tap av cellen når redusere volumet av nedbryting i trinn 4.8. Sikre pipettering gjøres jevnt uten å forårsake turbulens å pellet.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av østerrikske Science Fund (FWF), prosjekt-ingen. I 1220-B19 (til PS) som en del av ERANET prosjektet i translasjonsforskning Cancer Research (TRANSCAN) “Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal gjenværende sykdom i prostatakreft (CTC-SCAN)”. Doktorgradsstipendiat S.C. ble opplært i rammen av PhD-programmet molekylær medisin i medisinske universitet i Graz. Forfatterne erkjenner takknemlig Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk assistanse. Forfatterne takker Georg Peinhaupt for grafisk design støtte.
Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
Standard PCR reagents | |||
6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |