Summary
Этот протокол является восстановление и подготовить редких целевые клетки из смеси с непромысловых фон ячеек для молекулярных генетических характеристик на уровне одной ячейки. ДНК качества равен-лечение единичных клеток и позволяет для одной ячейки приложений (оба скрининг на основе и Целевой анализ).
Abstract
Редкие целевые клетки могут быть изолированы от высокой фоне непромысловых клеток с использованием антител специфических для поверхностных белков клеток-мишеней. Недавно разработанный метод использует медицинская проволока функционализированных с анти эпителиальных клеток адгезии молекулы (EpCAM) антител в естественных условиях изоляции циркулирующих опухолевых клеток (CTCs)1. Пациента согласованной когорты в не метастатического рака предстательной железы показал, что метод изоляции в естественных условиях привело к более высокий процент больных положительные для CTCs, а также выше пунктам КТК по сравнению с текущей золотой стандарт в перечислении КТК. Как клетки не могут быть восстановлены из текущего медицинских устройств, новых функционализированных проволока (упоминаемый как устройство) был изготовлен позволяет захвата и последующего отряд клеток ферментативной обработки. Клетки могут приложить к устройству, визуализируется на микроскопе и отдельно с помощью ферментативной обработки. Восстановленные клетки cytocentrifuged мембраны покрытием слайды и собирают индивидуально с помощью лазера microdissection или микроманипуляции. Одноклеточных образцы подвергаются затем одноклеточных весь геном амплификации, позволяя несколько ниже по течению анализ, включая скрининг и целевые подходы. Процедура изоляции и восстановления дает высокое качество ДНК из одной клетки и не нанесет ущерба последующим весь геном амплификации (WGA). Одну ячейку амплифицированного ДНК может быть направлен скрининг и/или целевой анализ таких сравнительных генома гибридизации массив (массив CGH) или последовательности. Устройство позволяет ex vivo изоляции от образцы искусственного редких клетки (т.е. 500 клеток-мишеней шипами в 5 мл периферической крови). В то время как показатели отряд клеток являются приемлемыми (50-90%), скорость восстановления клеток отдельные слайды охватывает широкий ассортимент зависит от линии клеток (< 10 - > 50%) и требует дальнейшего внимания. Это устройство не очищается для использования у пациентов.
Introduction
Недавно CellCollector DC01, медицинская проволока функционализированных с анти EpCAM антитела для изоляции CTCs из периферической крови больных раком, был добавлен в методических спектр КТК перечисление1,2,3 . В настоящее исследование не метастатического рака простаты функционализированных провод сообщает почти в два раза больше пациентов КТК-позитивными и выше, КТК подсчитывает в КТК позитивных пациентов по сравнению с CellSearch, золотой стандарт в КТК перечисления3 . Благодаря этой обнадеживающие изоляции клеток из функционализированных медицинской проволоки одноклеточного анализа было бы желательным, но Ферментативная обработка растворами отряд ячейки (например , трипсин) ни microdissection лазер позволяет Восстановление нетронутым клеток (данные не показаны).
Чтобы разрешить отряд захваченных клеток, новое поколение функционализированных провода был оборудован конкретных полимеров. Этот полимер, который связывает захвата антител к проводу, восприимчивыми к лечению буфера релиз, позволяя отряд нетронутым клеток (CellCollector DC03 называют устройства). Новых функционализированных устройство позволяет изоляции клеток-мишеней от различных концентраций раковых клеток линии клеток шипами в бычьим сывороточным альбумином (БСА) / фосфат буфер солевой раствор (PBS) и периферической крови, соответственно.
Для облегчения визуального обнаружения клеток на устройстве и после восстановления, целевой раковые клетки обозначены с Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) и ДНК пятно перед началом восстановления лечения (т.е. Зарядка и отсоединение). Эффекты лечения на ДНК качество одиночных клеток посредством контроля качества ПЦР4,5,6,массив CGH7 ранее оценивались после WGA и целевые последовательности7 показаны никакой разницы по сравнению с micromanipulated-лечение клетки из суспензий клеток7. Преимущество этого метода заключается в сочетание редких целевую ячейку предварительного обогащения и восстановления клеток для одной ячейки вниз по течению анализа (рис. 1). Текущее устройство CE-маркировку в vivo коллекция обычно используется для перечисления ЦОК, а не для одной ячейки молекулярная характеристика2,8. Однако более всесторонний анализ расследовать неоднородность CTCs долго для анализа на уровне отдельной ячейки (т.е. целевые последовательности на уровне одной ячейки). Другие методы, основанные на ячейку основаны на иммуномагнитная изоляции EpCAM позитивных CTCs и обработки одной ячейки, основанные на диэлектрофореза для последующих молекулярно-генетический анализ9,10. Молекулярная характеристика CTCs является важным требованием для их полезной реализация в клинических условиях и столь же важно в фундаментальные исследования метастатического каскада. Параллельно с ЦОК циркулирующей ДНК опухоли (ctDNA) стало большое значение как она позволяет анализ ДНК опухолевых бремени с минимальной технической изоляции процедур11,12. Подходы на основе клеток может служить в качестве дополнительного вклада она позволяет РНК13,14 и белковый анализ выражения15 и также для КТК производных клетки культуры или ксенотрасплантатов16, 17. Несмотря на такие препятствия, как низкая клеток восстановления и разминирования для использования у пациентов по-прежнему необходимо преодолеть, поймать и отпустить метод принимает следующий важный шаг на пути к характеристике редких целевых ячеек.
Protocol
Все процедуры были утверждены Комитетом по этике медицинского университета в Граце (25-240 ex 12/13). Периферической крови для шипования экспериментов был пробы от здоровых людей.
Примечание: Этот протокол описывает изоляции HT-29 клеток (человека толстой кишки рак клеток линии) от PBS или искусственные смеси HT-29 клеток и периферической крови. Же эксперимент проводился с двух дополнительных клеточных линий (LNCaP и VCaP, экспериментальные данные в результатах представитель) и теоретически могут быть выполнены со всех ячеек, выражая EpCAM.
1. Подготовка клетки-мишени
- Культура клеток и маркировки клеток
Примечание: В настоящем Протоколе, клетки культивировали в 75 см² культуры колбы. Пожалуйста, измените количество реагентов соответственно, если используются другие устройства культуры клеток (например 25 см² культуры блюда, пластины 6-ну и т.д.). Все жидкости используются предварительно разогретую до 37 ° C на водяной бане. Если не указано иное, все протокол шаги выполняются при комнатной температуре (RT).- Культура клетки HT-29 в среде изменение Маккоя 5а с 2 мм L-глютамином, 20 мм Hepes, 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 ° C в атмосфере2 CO 5%.
- Когда клетки являются 90% притока, снимите носитель и промойте клетки с 10 мл ПБС.
- Для сбора клеток, добавить 2 мл раствора отряд клеток (таблица материалов и реагентов) в клетки и инкубации клеток примерно 5 минут при 37 ° C.
Примечание: Отряд решение содержит протеолитический и collagenolytic ферментов в 1 x PBS, 0.5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 3 мг/Л фенола красного. Сократить до минимума предварительно потепления время решения отряд клеток, как это будет неактивным после 1 ч при 37 ° C. Покровный слой клеточных для получения оптимального клеток отряда. - Проверьте отряд клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Все отдельные клетки перехода к 50 мл трубки заполнено автоматически с 10 мл среды культуры клеток (так же, как на шаге 1.1.1.) и Ресуспензируйте клетки, закупорить.
- Поместите оставшиеся суспензию клеток на горизонтальной Роликовый Смеситель на RT и перейти к шагу маркировки.
- Живой клетки маркировки клеток-мишеней
- Разбавить 1 мкл 5 мм CFSE (поставляется в диметилсульфоксида, ДМСО) в 1 мл ПБС предварительно нагревают при 37 ° C для получения решения маркировки CFSE готовым 5 мкм.
Примечание: Для достижения оптимального результата окрашивания, используйте свежеприготовленные решения. - Подготовить готовые к использованию ДНК окрашивание раствора (таблица материалов и реагентов) в однократном ПБС и хранить его на 2-6 ° C, защищать от света.
Примечание: Для достижения оптимального результата окрашивания, используйте свежеприготовленные решения. - Получить клетки от горизонтальных Роликовый Смеситель (шаг 1.1.6.) и Пелле клетки на 300 x g 10 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл ПБС.
- Промойте клетки снова с ПБС и Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл готовых к использованию CFSE маркировки решения.
- Инкубировать клетки при 37 ° C 15 мин и собирать клетки после центрифугирования в 300 x g на 3 мин.
- Ресуспензируйте маркированных клеток в 1 мл подогретым клеток питательной среды и позволяют клеткам восстанавливаться при 37 ° C за 30 мин.
- Урожай клетки центрифугированием при 300 x g 3 мин и Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл готовых к использованию ДНК, окрашивание раствора при 37 ° C в течение 10 мин.
- Пелле ячейки, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 4 мл ПБС. Оценить плотность клеток с помощью Горяева и проверить наличие флуоресценции маркировки с помощью микроскопа флуоресценции оснащены 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и флуоресцеин Изотиоцианаты фильтры (FITC) (Рисунок 2а и 2е).
- Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин и Ресуспензируйте Пелле ячейки по плотности клеток, необходимых для соответствующих эксперимент как указано в следующем разделе и место на льду.
- Разбавить 1 мкл 5 мм CFSE (поставляется в диметилсульфоксида, ДМСО) в 1 мл ПБС предварительно нагревают при 37 ° C для получения решения маркировки CFSE готовым 5 мкм.
2. Зарядка проволока
Примечание: Клетки могут быть изолированы от целевой ячейки/периферической крови spikings на миллилитр масштаба или путем предоставления небольшое количество клеток в микролитр масштабе. В то время как первый подход позволяет для имитации состояния редких клеток в периферической крови, последний может быть предпочтительным способом вложить несколько клеток с целью протокола оптимизации и тестирования.
- Зарядка проволока, с использованием большого количества клеточных суспензий
- Готовить 2% BSA, преграждая разрешение путем растворения 0,8 г BSA в 40 мл ПБС (использование культуры клеток). Растворите BSA первоначальной vortexing и последующего инкубации на RT на горизонтальной Роликовый Смеситель для 10-20 мин.
- Промыть пустой ЭДТА трубы/натрия Гепарин труб с 2 мл 2% BSA удалить остатки антикоагулянт и отменить решение. Блокировка поверхности трубы по инкубации на RT с 5 мл 2% BSA на горизонтальной Роликовый Смеситель на 15 об/мин за 30 мин и отменить решение.
- Разбавить маркированных клеток (раздел 1.2.) к плотности 100 000 клеток/мл и использовать 5 мл для зарядки провода.
- Добавьте 5 мл суспензии маркированных клеток (500 000 клетки в целом) трубу. Избегайте пузырей при добавлении суспензию клеток.
- Выньте провод из отсека для хранения, а также резиновый колпачок, держа провод и промойте его в однократном ПБС (рис. 3).
- Проникают крышку трубки резиновые ЭДТА трубы (шаг 2.1.4.) с помощью иглой шприца (20 Г) и вставьте провод, таким образом, что функциональная часть полностью погружен в суспензии клеток, когда крышку обратно на трубы и трубки помещается на наклонной роликовый смеситель.
Примечание: Тройной винтовой функциональная часть провода должны быть покрыты суспензию клеток на протяжении зарядки. - Поворот трубы на наклонной Роликовый Смеситель на 5 rpm для 30 минут, чтобы позволить клетки для присоединения проволоку.
- Промойте провода с 5 мл ПБС и хранить его в темноте в 2-6 ° C в 15 мл, содержащих ПБС до визуального осмотра.
Примечание: Функциональная часть провода всегда должно быть погружен в PBS, чтобы избежать вреда клетки.
- Изоляция клетки-мишени из искусственных смесей с периферической крови (альтернативный метод для зарядки: 2.1. Зарядка проволока, с использованием большого количества клеточных суспензий)
- Разбавить маркированных клеток (раздел 1.2.) для получения клеточных суспензий плотностью высокой клеток (> 1 000 000 клеток/мл), тем самым сохраняя низкий объем суспензии клеток, добавлен в периферической крови.
- Добавить 500 для 500 000 клеток в 5 мл периферической крови и смешивать их, инвертирование трубки.
- Выньте провод из отсека для хранения, удалите резиновую крышку, держа провод и промойте его в однократном ПБС.
- Проникать новый колпачок трубки с не функциональной частью устройства с помощью иглой шприца (20 Г), таким образом, что функциональная часть полностью погружен в шипами крови когда крышку обратно на трубы и трубки помещается на наклонной роликовый смеситель.
Примечание: Тройной винтовой функциональная часть провода должны быть покрыты суспензию клеток на протяжении зарядки. - Инкубировать трубку на наклонена Роликовый Смеситель на 5 об/мин за 30 мин на RT.
- Промойте провод 3 раза в однократном ПБС и хранить его в темноте в 15 мл, содержащих ПБС до визуального осмотра.
Примечание: Функциональная часть провода всегда должно быть погружен во избежание вреда клетки.
- Зарядка провод с низким объемом клеточных суспензий (альтернативный метод для зарядки: 2.1. Зарядка проволока, с использованием большого количества клеточных суспензий)
- Ресуспензируйте маркированных клеток в 1 000 000 клеток/мл в 1 x PBS.
- Исправьте 150 мм одноразовые стеклянные пипетки Пастера горизонтально на стойке.
- Удалить провод из отсека для хранения, но сохранить желтый резиновый колпачок, держа провод.
- Место провода в пипетку, таким образом, что функционализированных часть расположена в наконечник пипетки Пастера, не касаясь стекла.
Примечание: Наконечник провода не должны придерживаться из кончика пипетки Пастера. Избегайте, подключив задней части кончика пипетки Пастера с резиновый колпачок, держа провод. Если прикреплены туго, клеточных суспензий не может загружаться с другой стороны в наконечник пипетки. - Загрузите 15 мкл суспензии клеток в наконечник пипетки Пастера, охватывающих функционализированных часть провода.
- Инкубируйте проволока для 10 минут вручную четвертьоборотный наконечник пипетки собрал провод/Пастер каждую минуту.
- Отсоедините провод от кончика пипетки Пастера, промойте его в 5 мл ПБС и хранить его в темноте в 2-6 ° C в 15 мл, содержащих ПБС до визуального осмотра.
Примечание: Функциональная часть всегда должно быть погружен в однократном ПБС, чтобы избежать вреда клетки.
3. Подсчет клеток на проводе
Примечание: Всегда держите функциональной частью проволоки, погруженной в ПБС, чтобы избежать вреда клетки.
- Использование пера смазка нарисовать прямоугольник области на слайде стекла и 500 мкл ПБС.
- Согнуть в нефункциональные части провода и поместите его на слайде стекла, таким образом, что функциональная часть погружается в однократном ПБС.
Примечание: Установите область прямоугольника и объем ПБС покрыть полностью функциональная часть провода. Используйте двусторонний скотч для монтирования в нефункциональные части провода на слайде. - Осмотрите обе стороны провода для перечисления захваченных клетки (Рисунок 2B и 2F).
Примечание: Наличие клеток определяется с помощью микроскопа флуоресценции оснащены фильтрами для DAPI и FITC. Обе стороны провода могут быть проверены и количество клеток либо начисленных (для номеров высокого клеток) или подсчет (только возможно, если низкое количество клеток прикреплены к проводу). Этот шаг можно пропустить, если перечисление клеток не является необходимым. - После сканирования, поместите провод обратно в 15 мл, содержащих ПБС (см. Примечание 2.3.6. и раздел 3.), хранить его провод в темноте.
Примечание: Большинство нефункциональные части провода можно вырезать (включая изгиб) и удалены плавности хранения.
4. отряд и восстановления клеток-мишеней
Примечание: Отряд клеток должно быть сделано в течение 4 ч после изоляции.
- Распустить 4 мг релиз компонента буфера (таблица материалов и реагентов) мл ПБС и фильтровать решение через 0,2 мкм стерильным фильтр для получения готовых к использованию буфера.
Примечание: Полимер проволоки состоит из гидрогеля, который функционализированных с анти EpCAM антител, позволяя привязку к EpCAM представляющих клеток-мишеней. Релиз буфер содержит кислородно углеродный протеолитических ферментов, способных раскалывание гидрогеля. Протеолитического расщепления приводит к деградации полимера и, таким образом, отряд захваченных клеток. - Предварительно теплой освобождения буфера при 37 ° C за 5 мин.
- Добавление 1,6 мл освобождения буфера для заполнения трубки реакции 1,5 мл.
Примечание: Трубы, предназначенные для 1.5 мл реакционных объемов позволяют приложению 1.6 mL, которая необходима для погружаемой функциональная часть провода. - Инкубируйте функциональная часть провода в буфере выпуска при 37 ° C (водяная баня), за 20 мин использовать резиновый колпачок, поставляется с проволокой вместо крышку трубки исправить провод в 1,5 мл трубки, чтобы избежать загрязнения во время инкубации в водяной бане.
- Проволока/трубки Ассамблеи передать шейкер в RT и 500 об/мин, 15 мин.
Примечание: Шейкер имеет орбиты 1,5 мм. - Поместите провод/трубки сборки в центрифуге и спина на 300 x g за 10 мин.
- Отсоедините провод из трубки, закройте крышку и центрифуги трубку снова 300 x g за 10 мин.
Примечание: Проволока может храниться в однократном ПБС в 2-6 ° C в темноте для клеток подсчета оценить отряд эффективности/проверка для клеток, оставшихся на проволоку. - Чтобы уменьшить объем суспензии клеток, удалить все, кроме 100 мкл (микроманипуляции) или в качестве альтернативы 300 мкл (цитокамер и последующей лазерной microdissection) супернатант и немедленно приступить к одной ячейки выборки.
5. одной ячейки выборки
- Микроманипуляции
Примечание: Отдельные клетки будут добавлены к 2 мкл клетки хозяина смеси лизис позволяя WGA. Подготовка Мастер микс соответствии количество клеток обрабатываться, расчет дополнительных томов для потери вследствие закупорить и место Мастер микс лизис клеток на льду.- Подготовка клетки лизис Мастер микс (компоненты комплекта WGA, таблица материалов и реагентов) согласно протоколу, изложенные Czyż et al18. Вкратце, смешать 2.0 мкл буфера реакции, 1.3 мкл octylphenoxypolyethoxyethanol (10% раствора), 1.3 мкл 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) фенил-Полиэтиленгликоль (10% раствора), 2.6 мкл раствора протеиназы K и 12,8 мкл РНКазы/DNase свободной воды для получения Мастер смесь для 10 образцов (общий объем 20 мкл).
Примечание: Для более образцов, увеличить объемы соответственно. Состав смеси мастер лизис клеток отличается от той, которая используется в альтернативной процедуры использования лазерного microdissection образцов (см. 5.2).. - Использование пера смазка для рисования области проведения суспензию клеток на месте. Отрегулируйте площади и объема, если плотность клеток является слишком высокой (т.е. Марк большую площадь на стеклянное скольжение, нагрузки 1 x PBS и Алиготе суспензию клеток).
- Пипетка весь окрашенных клеток подвеска (полученные на шаге 4.8.) на стеклянное скольжение.
- Передать микроскоп оснащен микроманипулятор стеклянное скольжение. Пусть клетки соглашаться на 5 мин (Рисунок 2D и 2 H).
- Подготовьте 0.2 мл ПЦР пробирок загружен с 2.0 мкл мастер лизис клеток смеси (см. шаг 5.1.1.) и хранить его на льду.
- Собирать единичных клеток в 1 мкл ПБС, используя микроманипулятор и передачи клетки в трубу, содержащие смесь мастер лизис клеток.
Примечание: Для передачи micromanipulated клеток в буфер lysis клетки место капилляра непосредственно в 2 мкл раствора лизис и извлечь до тех пор, пока пузырьки можно увидеть. - Кратко вращаться вниз образца на 2000 x g для 3 s с помощью рабочего стола отцентрифугировать собрать все жидкости в нижней части трубки. Поместите образцы на льду.
- Непосредственно перейти к одноклеточных WGA (см. раздел 6. и Czyż и др. 19).
- Подготовка клетки лизис Мастер микс (компоненты комплекта WGA, таблица материалов и реагентов) согласно протоколу, изложенные Czyż et al18. Вкратце, смешать 2.0 мкл буфера реакции, 1.3 мкл octylphenoxypolyethoxyethanol (10% раствора), 1.3 мкл 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) фенил-Полиэтиленгликоль (10% раствора), 2.6 мкл раствора протеиназы K и 12,8 мкл РНКазы/DNase свободной воды для получения Мастер смесь для 10 образцов (общий объем 20 мкл).
- Лазерная microdissection (метод альтернативного одной ячейки выборки: 5.1. Микроманипуляции)
Примечание: Состав мастер смеси, используемые в настоящем разделе отличается от той, которая используется в разделе 5.1 для микроманипуляции. Отдельные ячейки будут добавлены к 4,5 мкл лизис клеток мастер смеси (компоненты комплекта WGA, таблица материалов и реагентов) для WGA.- Подготовьте смесь мастер лизис клеток согласно Czyż et al. 19 , смешивая 5.0 мкл буфера реакции, 1.3 мкл octylphenoxypolyethoxyethanol (10% раствора), 1.3 мкл 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) фенил-Полиэтиленгликоль (10% раствора), отв., 2.6 мкл раствора протеиназы K и 34.8 мкл РНКазы / DNase свободной воды для получения мастер смесь для 10 образцов (общий объем 45 мкл). Поместите смесь мастер на льду.
Примечание: Для более образцов, увеличить объемы соответственно. - УФ лечить мембраны покрытием слайды подходит для лазерной microdissection. Таким образом слайды в ДНК крест компоновщика устройства и подвергать высоким УФ для около 10 мин.
- Соберите слайд мембраны покрытием в cytocentrifuge и cytospin всю ячейку подвеска на 300 x g за 5 мин.
Примечание: При использовании системы в жидкости, где клетки являются cytocentrifuged на слайд в растворе, удалить супернатант после цитокамер и применять сухой спина на 1140 x g за 1 мин. - Непосредственно перейти к лазерной microdissection или пусть cytospins воздушно-сухой ночлег и замораживание образцов при-20 ° C для длительного хранения.
- Пипетка 4.5 мкл лизис клеток мастер смесь в Кап 0.2 мл ПЦР-пробирку и урожай единичных клеток с помощью лазерной microdissection.
- Извлечь ПЦР-пробирку из лазерный микроскоп microdissection и закрыть трубку. Собрать все жидкости в нижней части трубки, короткие спин и поместите образец на льду.
- Перейти с одной ячейкой WGA или хранить отдельные образцы-80 ° c до 1 месяца перед дальнейшей обработкой.
- Подготовьте смесь мастер лизис клеток согласно Czyż et al. 19 , смешивая 5.0 мкл буфера реакции, 1.3 мкл octylphenoxypolyethoxyethanol (10% раствора), 1.3 мкл 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) фенил-Полиэтиленгликоль (10% раствора), отв., 2.6 мкл раствора протеиназы K и 34.8 мкл РНКазы / DNase свободной воды для получения мастер смесь для 10 образцов (общий объем 45 мкл). Поместите смесь мастер на льду.
6. адаптер компоновщик основе весь геном усиления 18,19
Примечание: Убедитесь, что все необходимые мастер смеси (компоненты комплекта WGA, таблица материалов и реагентов) подготовлены и хранятся на льду, готов к использованию. Мастер миксы включают ДНК пищеварение смесь 1 для micromanipulated образцы (см. 5.1) (содержащие 2.0 мкл буфера реакции, 2.0 мкл Mseя энзима ограничения и 16,0 мкл РНКазы/DNase свободной воды) или ДНК пищеварение смешать 2 для лазерной microdissection (см. 5.2). образцы (содержащие 2,5 мкл Mseя энзима ограничения и 2,5 мкл РНКазы/DNase свободной воды), предварительно отжига главный микс (содержащие 5.0 мкл буфера реакции, 5.0 мкл каждого из preannealing ПЦР адаптеры и 15,0 мкл РНКазы/DNase свободной воды), лигирование Главный микс (содержащие 30.0 мкл предварительно обожженных ПЦР адаптеры, 10,0 мкл аденозинтрифосфата раствор и 10,0 мкл T4 лигаза решения) и основного PCR мастер mix (содержащий 30.0 мкл буфера PCR, 20,0 мкл раствора 10 мм deoxynucleotide микс, 10,0 мкл полимеразы смеси и 340.0 мкл РНКазы/DNase свободной воды). Все тома даны для подготовки 10 образцов. Корректировать количество образцов.
- Лизис клеток место micromanipulated/лазерная microdissection образцов в тепловая велосипедист и запустите одноклеточных лизис по инкубации клеток при 42 ° C по 45 мин, 65 ° C для 30 мин и 80 ° C в течение 10 мин.
Примечание: Используйте тепловая велосипедист с подогревом крышкой. Лизис клеток может быть сделано O/N за 10-15 мин. В этом случае пропустите шаг инкубации на 65 ° C. - Запуск предварительно отжига ПЦР адаптеров. Таким образом, инкубировать предварительного отжига мастер смесь в тепловой циклователь на 65 ° C в течение 1 мин, следуют далее 49 циклов, 1 мин каждая, с постепенно снижение температуры на 1 ° C/цикл. После 50 циклов (при 15 ° C) Инкубируйте мастер смесь на 15 ° C до дальнейшего использования.
Примечание: Этот шаг необходим для создания асимметричных адаптеры для перевязки (см. шаг 6.6.) с одной ячейкой ДНК подвергается Mseя ограничение дайджест. - После лизиса клеток, спина вниз лизированных образцов g 2000 x 3 s, чтобы собрать все жидкости в нижней части и поместить его на льду.
- Для фрагмента ДНК, 2 мкл ДНК пищеварение смесь 1 для каждого образца лизированных micromanipulated или 0.5 мкл ДНК пищеварения смешать 2 образец лазерного microdissection и запустить ограничение дайджест. Используйте тепловая велосипедист с подогревом крышкой при 37 ° C за 5 мин, последовал шаг инактивации энзима ограничения при 65 ° C за 5 мин.
Примечание: Пищеварение при 37 ° C может быть продлен до 3 ч. Это единственный шаг протокол, различающихся между образцы, полученные из микроманипуляции и образцы, полученные из лазерной microdissection. - Спин вниз образцов собрать все жидкости в нижней части и поместить его на льду.
- Для безлигатурные ограничение переваривается ДНК и предварительно обожженных адаптеры, 5.0 мкл лигирование мастер смесь для каждого переваривается образцов ДНК и перевязать в тепловой циклователь на 15 ° C в течение 1 ч.
Примечание: Этот шаг может быть продлен до 12 ч или выполняется O/N. - Спин вниз образцов собрать все жидкости в нижней части и поместить его на льду.
- Для WGA мкл 40.0 первичных мастер смеси ПЦР для каждого из продуктов перешнуровки и запустить WGA в тепловая велосипедист с подогревом крышкой как следующим образом: первый, Проинкубируйте образцы на 68 ° C на 3 мин. Во-вторых, цикл для 15 раз в 94 ° C 40 s, 57 ° C за 30 s и 68 ° C в течение 1 мин 30 s + 1 s/цикл. Затем добавьте 9 циклов в 94 ° C 40 s, 57 ° C + 1 ° C/цикл за 30 сек, 68 ° C в течение 1 мин 45 s + 1 s/цикл. После этого цикл для 23 раз в 94 ° C 40 s, 65 ° C за 30 сек, 68 ° C в течение 1 мин 53 s + 1 s/цикл. Наконец выполнить окончательное расширение на 68 ° C на 3 мин 40 с и холод образцов до 4 ° C.
- Спин вниз образцы для сбора всех жидкости на дне и проверить качество ДНК или хранить образцы при-20 ° C или ° C-80 для длительного хранения.
7. контроль за качеством продукции WGA
Примечание: Проверьте качество продукции WGA, основанный на диапазон и количество продуктов амплификации ДНК мазок после запуска 4plex КК-ПЦР 5. Запустите WGA аликвоты и соответствующие образцы QC-ПЦР на 1,0% агарозном геле для оценки.
- Подготовка 100 мкм акций решения всех праймеров, используется для контроля качества 4plex ПЦР (Таблица 1). Мкл 8 каждого праймера для 136.0 мкл воды ПЦР класса для создания 200 мкл грунтовка пула. Вихревой решение для 3 s, спина его вниз на 2000 x g для 3 s и Алиготе 20 мкл для хранения при температуре-20 ° C.
- Использовать стандартные наборы PCR подготовить образец мультиплексной ПЦР смешать содержащих 6.0 мкл 2 x PCR компонентов (кроме грунтовки), 4,5 мкл ПЦР класс воды и 0,5 мкл грунтовка пула.
- 1.0 мкл WGA продукции, спина его вниз и выполнения ПЦР на 94 ° C на 2 мин после 35 циклов за 1 мин, грунтовка, отжиг на 56 ° C за 1 мин и выдвижение праймера на 72 ° C в течение 1 мин 30 s и окончательное расширение шаг денатурации на 94 ° C в 72 ° C для 7 min. Охладите до 4 ° C, спина его вниз и образцы на льду для анализа геля тот же день или при-20 ° C для последующего анализа.
Примечание: Охлаждение в тепловая велосипедист может выполняться на 12 ° C для увеличения долговечности элементов Пельтье. - Анализируйте WGA продуктов (полученные от 6.8.) и соответствующих 4plex КК-ПЦР на гель агарозы5.
Representative Results
Клетки после того, как CFSE и нуклеиновых пятнать может быть оценена с помощью микроскопа иммунофлюоресценции оснащены фильтрами для DAPI и FITC. Ядра имеют с яркой изображение в канале DAPI тогда цитоплазме клеток Показать единообразной маркировки с CFSE с гетерогенными интенсивности между клеток (Рисунок 2а и 2е). Подобные формы и интенсивности окрашивания ожидается от клеток, придает провода (Рисунок 2B и 2F), а также отсоединяется от проводов и восстановлены на слайде (Рисунок 2D и 2 H).
Высокая ячейка плотности (например > 1 000 000 клеток/мл) может привести к полный охват провода с клетками при зарядке провода. Однако, ниже плотности клеток, изменения в скорости вращения во время инкубации и использование различных клеточных линий влияют на эффективность изоляции и должны испытываться отдельно. Когда провода инкубировали с 5 мл HT-29 клеток в 100 000 клеток / мл, как описано в разделе 2.1., среднее 254 ± 103 клеток (n = 5) были захвачены на провода. С той же эксперимент с использованием LNCaP клеток, среднее 440 ± 319 клеток (n = 5) за провод был получен.
Представляя клеток HT-29 500, 5 000 и 50 000 на фоне 5 мл периферической крови для проводов (согласно протоколу раздел 2.2.) привело к поимка 75 ± 18 клеток, 25 ± 9 клеток и 47 ± 57 клетки (n = 3, каждый), соответственно. Если провод предъявлено 15 мкл суспензии клеток (1 000 000 клеток/мл) согласно протоколу в разделе 2.3., до 1000 (HT-29) клетки могут прикрепить к проводу.
Ячейки эффективности отряда, варьировались от 81% в клетках HT-29 (54,9% - 93,2%, и n = 5) до 81% (диапазон 63.51-92,87%, n = 6) и 91% (диапазон 84,7% - 95,3%, n = 6) в LNCaP и VCaP клеток, соответственно. Аналогично, восстановление отдельных клеток отличается между клеточных линий: среднее 28% клеток отдельностоящий HT-29 были найдены в цитокамер. В то время как ставка возмещения расходов на LNCaP был ниже, чем на 10%, среднее восстановление клеток VCaP составил 55%.
Примерно 75% одиночных клеток подвергается WGA доходность высококачественных WGA продуктов: это 1) мазка WGA продуктов, начиная от 0,1 до > 1 КБ (Рисунок 4, верхней панели) и 2) три или четыре полосы в 4plex качества управления ПЦР (рис. 4, Нижняя панель) . WGA продукты могут использоваться для 1) массива CGH профилирования критериям качества для одной ячейки массива CGH профили 6,7 и 2) целевых NGS после повторного усиления WGA 7.
Рисунок 1: рабочий процесс для изоляции и восстановления клеток-мишеней для анализа одноклеточных. (A) клетки культивировали в 90% confluency и (B) собирают для получения одной ячейки подвеска. После окрашивания с CFSE и нуклеиновой природы пятна, (C) функционализированных провод инкубировали при наличии клеток в объеме 5 мл с помощью реакции трубы или в низкой громкости с помощью кончика пипетки Пастера. Последний позволяет применение клеток подвеска томов как низко как 15 мкл. (D) клетки должны быть отделены в течение 4 ч после зарядки. Таким образом провода помещается в 1,5 мл реакции заполнены с выпуска буфера. После инкубации 15 мин на рокер и 10 мин центрифугирования провод удаляется и суспензии клеток центрифугируют в Пелле клетки. (E) восстановленные клетки либо передан на стеклянное скольжение для одной ячейки микроманипуляции (вверху) или cytocentrifuged на слайд мембраны покрытием и направлены лазерные microdissection (внизу). (F) наконец, собранные одной клетки усиливаются с помощью весь геном амплификации (WGA). WGA продукты совместимы с массива CGH и целевых NGS течению анализа. EpCAM epitope: зеленый круг на поверхности клетки. Функционализированных проволока: устройство, серый тройной цилиндрические провода. Полимерные: фиолетовый линии. Анти-EpCAM антитела: оранжевый. Освободить буфер активность: красная стрелка. Смазка маркер провести суспензию клеток на месте: темно синий эллипс. Восстановленные суспензию клеток: светло-голубой. Капиллярные для микроманипуляции: черные линии. Увеличение: Восстановленный клетки собирают микроманипуляции, cytospin на покрытых мембраной слайд содержащие восстановленные клетки (серый заполненный эллипс). Увеличение: Восстановленный клеток, лазерная microdissected (серый Кольцевая линия: мембраны мембраны слайда, служа основой для лазерной microdissection), объективной с лазерным лучом (синяя линия приближается мембраны слайд снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация маркированных клеток. (A, E) Клетки перед зарядкой: клетки обозначены с CFSE и counterstained с ДНК, интеркалирующие краситель, показаны интенсивности сигнала диапазон CFSE (зеленый). (B,F) Помечены клетки, снятые на проволоку. (C,G) Провод после процедуры клетки отряд. (D,H) Клетки отсоединяется от провода и извлечены с помощью цитокамер на слайд. CFSE: FITC канал (зеленый). ДНК пятно: DAPI канал (голубой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: проволока и хранения отсек. (A) отсеков провода. (B) деталь функционализированных части. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: контроль качества продукции WGA, полученные из клеток одного micromanipulated. Верхняя панель: WGA продукты, полученные из одной клетки обычно результат в ДНК мазки, начиная от 0,2 КБ > 1.0 КБ с пика интенсивности около 0,5 КБ. Образцы номер 1, 7 и 13 (обозначается звездочками) Показать субоптимальные или нет ДНК мазки. Нижняя панель: WGA продукты являются достаточно высокого качества, если 4plex ПЦР дает три или четыре из четырех продуктов ПЦР (на 100, 200, 300 и 400 bp). Образцы 1, 7, 10 и 13 Показать меньше трех полос и будут исключены из дальнейшего анализа. Лейн M содержит 100 bp лестница и звездочки показывают примеры недостаточного качества продукции WGA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Грунтовка последовательность | ПРИМЕЧАНИЕ |
| 5 ′ ГЦГ ОСО ata tga ttc cac cc-3′ | 100 bp вперед грунт |
| 5 ′ КТК КТГ ГАА Гат ggt Гат gg-3′ | 100 bp обратный грунт |
| 5 ′ общ tgg СМЖЛ кляп gct agc-3′ | 200 bp вперед грунт |
| 5 ′ ttt ТГК ggt gga aat gtc ct-3′ | 200 bp обратный грунт |
| 5 ′ общ tga gac att ctt gct gg-3′ | 300 bp вперед грунт |
| акт 5 ′ tcc aac cag tca ГКГ tc-3′ | 300 bp обратный грунт |
| 5 ′ aca gtc кошка gcc УВД акт gc-3′ | 400 bp вперед грунт |
| 5 ′ gct tga УГА АГТ ggt cgt tg-3′ | 400 bp обратный грунт |
Таблица 1: Грунтовка последовательности для контроля качества 4plex PCR
Discussion
Описывается протокол направлен на извлечение клеток из функционализированных проволоки (упоминаемый как устройство) для ex vivo одноклеточных геномного анализа. Мы протестировали три EpCAM положительных клеток линии (HT-29, LNCaP и VCaP), но в принципе, этот метод может применяться к любой линии клеток, выражая EpCAM. Целевой EpCAM положительных клеток могут быть представлены на устройство как чисто клеток подвеска (см. 2.1.) или смешанные в избыток фон ячеек (например. периферической крови, смотрите 2.2.). В то время как особенно последний может использоваться для тестирования возможности изоляции в условиях редких клеток, тонкой настройки количество клеток, придает провода может быть сделано с использованием описанных малообъемных подхода (см. 2.3.). Как различия между клеточных линий должны быть предположенным, подходящую ячейку значения плотности для зарядки провода, вращение скорость также, как время инкубации должны быть проверены эмпирически, оценивая количество вложенных клеток с помощью микроскопа иммунофлюоресценции.
Для геномной нисходящие приложения на уровне одной ячейки WGA не требуется. WGA методом выбора могут различаться в разных лабораториях, и, в принципе, наш метод открыты для всех методов, чем может обработать образцы, полученные из микроманипуляции или лазерной microdissection. В этом протоколе мы используем метод, основанный на ферментативно фрагментированных ДНК из-за лучшую производительность по сравнению с тепло фрагментации основе WGA7. Необязательный, одной клетки могут направляться изотермический WGA позволяя последующим ДНК профилирования20,21.
Описывается протокол направлен на восстановление нетронутым клеток после придается новое поколение функционализированных провода для геномного анализа одной ячейки. Первое поколение функционализированных провода, которые также представляют собой устройства CE-утверждены только в естественных условиях обогащения на рынке пока, были использованы для перечисления ЦОК в метастазами раковых больных. Предыдущие публикации и наших собственных данных предложить технику изоляции в естественных условиях , быть более чувствительными по сравнению с текущей технологии золотой стандарт2. Таким образом оснащение этого в естественных условиях изоляции технику с функцией восстановления как понял в устройстве позволяет сочетать высокую КТК восстановления с квалификации на уровне одной ячейки.
Однако устройство не очищается для применения в пациенты, таким образом, клинические данные отсутствуют. Ex vivo приложений (т.е. изоляция CTCs из периферической крови после выборки) не рекомендуется, поскольку технология адаптирована к настройкам в локтевого напрасно, например низкий диаметр напрасно (увеличивая вероятность прямой контакт между CTCs и ловить антител) и время длительного хранения (30 мин., позволяя 2-3 Л крови пройти провод). Однако как об этом говорится в разделе 2.2. клетки-мишени также может быть изолирован от смешанных образцов7.
Текущее ограничение метода является неэффективным восстановление нефиксированных клеток после отсоединения от провода. Это, однако, может улучшить клетки фиксации шаг до лечения отряд.
Таким образом этот протокол является первым шагом к комбинированного использования в естественных условиях изоляции технику с восстановления клеток генетически характеризующих отдельные клетки. Необходимы дальнейшие усилия для решения оптимизации восстановления клеток и оформления для его применения в пациенты1,2. Однако персонализированной медицины для лечения решений мониторинга и терапии выходит перечисление ЦОК. Таким образом этот метод является первым шагом к геномной КТК квалификации на уровне отдельной ячейки.
Приложения к одной ячейки транскриптом анализ кажется возможным, как нетронутыми клетки сжаты. Однако он остается быть оценены ли процедуры восстановления имеет влияние на целостность РНК (например пересылка восстановить отдельные ячейки для прямого лизис следуют RT-ПЦР22). Если успешно, характеристика одиночных клеток (например , ЦОК) можно перемещать на уровень транскриптом, позволяя более подробного анализа. В этой связи, РНК seq использование смарт seq2 обеспечивает ценный инструмент для РНК течению анализа единичных клеток как preamplified cDNA (полученный в ходе подготовки библиотеки РНК seq) могут быть подвергнуты количественного PCR. Это позволит комбинированных целевой и скрининг-анализа единичных клеток восстановленные22,23.
Текущий функционализированных провода основаны на антитела анти EpCAM, который является широко используемым эпителиальных маркера для позитивного выбора CTCs24. Как несколько ЦОК, возможно помощью эпителиальных маркеров, например cytokeratins или EpCAM25, добавив антитела например HER2/новый будет увеличить шанс КТК изоляции. Несколько антител на основе обогащения стратегии были разработаны и рассмотрены Феррейра и др. в 2016 году26. Смесь антител, иммобилизованных на провод может быть будущего совершенствования технологии привело к изоляции более высокий номер и дополнительные подтипы ЦОК.
Он является обязательным для всех шагов, связанных с провода, обработка держать функциональной частью проволоки, погруженной в растворе для того, чтобы сохранить его функциональность. Мы рекомендуем разместить провода в ПБС во время оценки (микроскоп; например. шаги 3.1. -3.3.) и хранения. Для того, чтобы избежать неправильного окрашивания, мы рекомендуем с помощью свежезаваренным подготовлен окрашивание раствора в шагах 1.2.1. и 1.2.2. Слабо окрашенных клеток препятствуют клеток подсчета на проволоку и может привести к недооценке прилагаемый клеток.
Это необходимо, чтобы избежать, подключив пипетку Pasteur с резинового колпачка при вставке провод в пипетку Pasteur для последующей загрузкой суспензию клеток (шаг 2.3.4.). Резиновый колпачок используется для хранения провода на месте, так что функциональная часть находится внутри кончиком пипетки Пастера. Если крышка слишком твердо прилагается к задней части пипетки Пастера, Загрузка суспензию клеток не возможна. В этом случае облегчить крышку таким образом, что воздух, который смещается в суспензию клеток загруженных может оставить пипеткой.
Гибка проволоки имеет решающее значение для ее ориентации во время подсчета шагов 3.2 ячейки. и 3.3. Подключите провода при помощи клейкой ленты, таким образом, что приходит нефункциональные конец провода лечь на одну сторону. После сканирования всей длины функциональной части, провод откатывается 180°, так другая половина функциональных провода могут быть отсканированы. Этот шаг важен для первоначальных экспериментов, чтобы оценить количество клеток на проволоку. После того, как вычисляется количество ячеек для определенной линии клеток и процедуры, процедура может повторяться без подсчета клеток (например. только проверка на наличие клеток или опуская этот шаг). Тщательно закупорить важно избежать потери клеток при уменьшении объема супернатант в шаге 4.8. Убедитесь, что дозирование осуществляется плавно не вызывая турбулентности в гранулы.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Австрийский фонд науки (FWF), проект нет. Я 1220-B19 (чтобы Постскриптум) в рамках ERANET проекта в трансляционной рак исследований (TRANSCAN) «Циркуляционной опухолевых клеток как биомаркер для минимальной остаточной болезни рака простаты (КТК-скан)». Аспирант S.C. прошел обучение в рамках Докторской программы молекулярной медицины медицинского университета в Граце. Авторы с благодарностью признаем Нина Schlögl, Даниэль Kummer, Gabi Wendt, Клаудия чудак, Джулия Шульц и Johanna Schiller для их экспертной технической помощи. Авторы благодарят Георг Peinhaupt за поддержку графического дизайна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
