Summary
이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.
Abstract
드문 대상 셀 대상 세포의 표면 단백질에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 비 대상 셀의 높은 배경 으로부터 격리 될 수 있습니다. 최근에 개발 된 방법 안티 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 순환 종양 세포 (CTCs)1의 비보에 격리에 대 한 항 체와 기능성된 의료 와이어를 사용 합니다. 비 전이성 전립선 암에 일치 하는 환자 코 호트 vivo에서 절연 기술 CTCs CTC 열거형의 현재 황금 표준에 비해 높은 CTC 카운트에 대 긍정적인 환자의 높은 백분율에서 결과 나타났다. 으로 셀은 현재 의료 기기에서 복구할 수 없습니다, (장치 라고도 함)는 새로운 기능성된 와이어 제조 되었다 캡처 및 셀의 후속 분리 효소 처리에 의해. 셀 장치, 현미경에 시각 및 효소 처리를 사용 하 여 분리를 첨부할 수 있습니다. 복구 된 세포 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 이며 레이저 서 또는 micromanipulation 개별적으로 수확. 단일 셀 샘플 검사 및 대상별 접근을 포함 하 여 여러 다운스트림 분석을 허용 하는 단일 셀 전체 게놈 증폭 다음 대상이 됩니다. 격리 및 복구의 절차 고품질 DNA 단일 세포에서 생성 하 고 후속 전체 게놈 증폭 (WGA)을 손상 하지 않습니다. 단일 셀의 증폭 된 DNA 검사에 전달 될 수 있습니다 또는 배열 비교 게놈 교 잡 (배열 CGH) 또는 시퀀싱 등 분석 대상. 장치 인공 드문 셀 샘플 (즉 500 아군 주변 혈액 5 mL에는 대상 셀)에서 ex vivo 격리를 수 있습니다. 슬라이드에 분리 된 세포의 복구 속도 광범위 사용 셀 라인에 걸쳐 세포의 분리 요금은 허용 (50-90%), 반면 (< 10-> 50%)와 몇 가지 더 주의가 필요 하다. 이 장치는 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다.
Introduction
최근, CellCollector DC01, 의료 와이어 기능성된 암 환자의 말 초 혈액에서 CTCs를 격리 하기 위한 안티 EpCAM 항 체와 CTC 열거형1,2,3의 조직적 스펙트럼에 추가 되었습니다. . 비 전이성 전립선 암에는 현재 진행 중인 연구,이 기능성된 와이어 CTC 양성 되도록 거의 두 배나 많은 환자를 보고 하 고 CellSearch, CTC 열거형3 황금 표준에 비해 CTC 양성 환자에서 높은 CTC 계산 . 이 격려 성능으로 인해 단일 세포 분석을 위한 기능성된 의료 와이어에서 셀의 격리, 바람직한 것 하지만 셀 분리 솔루션 (예: trypsin) 효소 치료도 아니다 아니 레이저 기정 그대로 셀 (데이터 표시 되지 않음)의 복구.
허용 하려면 캡처된 세포의 분리, 기능성된 와이어의 새로운 세대는 특정 폴리머로 갖춰 졌다. 이 폴리머는 와이어를 캡처 항 체를 연결 하는 그대로 셀 (CellCollector DC03 라고도 장치)의 분리를 허용 릴리스 버퍼 치료를 받기 쉽습니다. 암 셀 라인 셀 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 아군의 다양 한 농도에서 대상 셀의 격리를 허용 하는 새로운 기능성된 장치 / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 말 초 혈액, 각각.
편하게 하기 위해 셀의 시각적 탐지 장치 및 복구 후, 대상 암 세포는 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)와 회복 치료 전에 DNA 얼룩 셔 서 (즉. 충전 및 분리). 단일 세포의 DNA 품질에 대 한 치료의 효과는 품질 관리 PCR4,5, 배열 CGH6,7 에 의하여 WGA 후 이전 평가 했다 및 타겟 시퀀싱7 아무 차이 보여주는 셀 정지7에서 치료 비 셀 micromanipulated에 비해. 이 방법의 장점은 단일 셀 다운스트림 분석 (그림 1)에 대 한 세포의 복구와 희귀 대상 셀 사전 농축의 조합에 있다. 수집 장치 vivo에서 CE 표시 현재는 단일 셀 분자 특성2,8보다 CTCs의 열거에 대 한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, CTCs 가운데이 조사 하기 위해 보다 포괄적인 분석 개별 셀 수준 (즉, 타겟 시퀀싱 단일 셀 수준)에서 분석에 대 한 긴. 다른 셀 기반 방법 EpCAM 긍정적인 CTCs 및 후속 분자 유전 분석9,10dielectrophoresis에 따라 단일 셀 처리의 immunomagnetic 격리를 기반으로 합니다. CTCs의 분자 특성 임상 설정에서 그들의 유용한 구현 위한 중요 한 요구 이며 전이성 캐스케이드의 기초 연구에서 똑같이 중요 하다. 최소한의 기술 격리 절차11,12종양의 DNA 분석 수 CTCs에 평행선, 순환 종양 DNA (ctDNA) 매우 중요 되고있다. 셀 기반 접근 RNA13,14 및 단백질15 식 분석에 대 한 수는 상호 보완적인 기여 역할을 수 있습니다 및 또한 CTC 파생 셀 문화 또는 xenografts16, 17. 비록 낮은 셀 복구 및 환자에 사용에 대 한 허가 등 장애물을 해야, 캐치 및 릴리스 메서드 희귀 대상 셀의 특성으로 중요 한 다음 단계 걸립니다.
Protocol
모든 절차는 그라츠의 의학 대학 (12/13 전 25-240)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 급상승 실험에 대 한 말 초 혈액은 건강 한 개인에서 샘플링 했다.
참고:이 프로토콜은 HT-29 셀 (인간 결 장 암 세포 선) PBS 또는 HT-29 세포와 말 초 혈액의 인공적인 혼합물에서의 격리를 설명합니다. 같은 실험 두 추가 셀 라인 (LNCaP 및 VCaP, 대표 결과에 실험 데이터) 수행 하 고 이론적으로 EpCAM을 표현 하는 모든 셀 수행할 수 있습니다.
1입니다. 대상 셀의 준비
- 세포 배양 및 세포의 라벨
참고:이 프로토콜에서 셀 교양 75 ² 문화 플라스 크에. 적절히 조정 하십시오 시 약의 양을 다른 셀 문화 장치를 사용 하는 경우 (예: 25 ² 문화 요리, 6 잘 플레이트 등). 사용 하는 모든 액체는 미리 물 욕조에 37 ° C로 예 열. 그렇지 않으면 표시 되지 않습니다, 모든 프로토콜 단계 실 온 (RT)에서 수행 됩니다.- 맥 코이 5a 수정 매체 2 mM L-글루타민, 20 mM Hepes, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 1% 페니실린/스 보충에 문화 HT-29 셀.
- 셀 90% 합칠 때, 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS의 10 mL와 함께 셀.
- 세포를 수확 하는 셀에 셀 분리 솔루션 (테이블의 재료 및 시 약)의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에서 약 5 분에 대 한 셀을 품 어
참고: 분리 솔루션 포함 분해 및 PBS, 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 그리고 3 mg/L 페 놀 레드 x 1에 collagenolytic 효소. 이 하지 활성화 됩니다 후 37 ° c.에서 1 h로 최소 세포 분리 솔루션의 미리 데우는 시간을 줄일 최적의 세포 분리를 전체 셀 레이어 커버. - 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀의 분리를 확인 합니다.
- 모든 분리 된 세포의 세포 배양 매체 (동일 단계 1.1.1에서에서 사용 합니다.) 10 mL와 prefilled 50 mL 튜브에 전송 하 고 pipetting으로 세포를 resuspend.
- RT에서 수평 롤러 믹서에 나머지 세포 현 탁 액을 놓고 라벨 단계를 진행 합니다.
- 대상 셀의 셀 라벨 라이브
- 1 x PBS의 1 mL에 5 m m CFSE (디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 제공)의 희석 1 µ L 5 µ M 준비-사용 CFSE 라벨 솔루션을 37 ° C에서 미리 예 열.
참고: 최적의 착 결과 사용 하 여 갓된 솔루션. - 한 준비-사용 DNA 얼룩 솔루션 (테이블의 재료 및 시 약) 1 x PBS에 준비 하 고 빛 으로부터 보호 하는 2-6 ° C에서 그것을 저장.
참고: 최적의 착 결과 사용 하 여 갓된 솔루션. - 가로 롤러 믹서 (단계 1.1.6.)에서 세포와 펠 릿 10 분에 대 한 300 x g 에서 셀 제거는 상쾌한 고 resuspend 1 x PBS의 10 mL에 셀.
- 1 x PBS로 세포를 헹 구 고 500 µ L 준비-사용 CFSE 라벨 솔루션에서 셀 펠 릿 resuspend.
- 15 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어 고 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리 후 세포를 수집 합니다.
- 미리 데워 진된 세포 배양 매체의 1 mL에 이라는 셀 resuspend 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 재생성 세포 허용.
- 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 솔루션 얼룩 준비-사용 DNA의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- 작은 셀는 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 4 mL에 셀. 셀 밀도 hemocytometer를 사용 하 여 평가 하 고 ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터 (그림 2A 및 2E) 장착 된 형광 형광 현미경을 사용 하 여 라벨을 확인.
- 300 x g 3 분에 세포를 원심 하 고 섹션에 얼음에 주어진 각 실험에 필요한 세포 밀도 따라 셀 펠 릿 resuspend.
- 1 x PBS의 1 mL에 5 m m CFSE (디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 제공)의 희석 1 µ L 5 µ M 준비-사용 CFSE 라벨 솔루션을 37 ° C에서 미리 예 열.
2. 충전 와이어
참고: 셀 대상 셀/주변 혈액 spikings 밀리 리터 규모 또는 microliter 눈금에서 셀의 낮은 수를 제공 하 여 격리 수 있습니다. 반면 전 접근 허용 주변 혈액에서 드문 셀 상태를 흉내 낸, 후자 수 있습니다 프로토콜 최적화/테스트 목적을 위해 몇 가지 세포를 연결할 좋습니다.
- 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전
- 1 x PBS (휴대폰 문화 사용) 40 mL에 BSA의 0.8 g을 용 해 하 여 솔루션을 차단 2 %BSA 준비 합니다. 초기 vortexing 및 10-20 분에 대 한 수평 롤러 믹서에 RT에서 후속 인큐베이션 BSA를 분해.
- 린스 빈 EDTA 튜브/나트륨 덤플링 튜브 항 응 혈 약 잔류물을 제거 하 고 솔루션을 삭제 하려면 2 %BSA 2 mL와 함께. 30 분 동안 15 rpm에서 수평 롤러 믹서에 2 %BSA 5 mL와 RT에 외피에 의해 튜브 표면을 차단 하 고 솔루션을 삭제.
- 이라는 셀 (섹션 1.2.) 100 000 셀/mL의 농도 묽 게 하십시오 그리고 5 mL를 사용 하 여 와이어를 충전.
- 튜브를 이라는 세포 현 탁 액 (총에서 500 000 셀)의 5 mL를 추가 합니다. 세포 현 탁 액을 추가할 때 거품을 하지 마십시오.
- 와이어를 잡고 고무 캡으로 저장 격실에서 와이어를 제거 하 고 1 x PBS (그림 3)에 그것을 씻어.
- 주사기 바늘 (20 G)의 도움으로 EDTA 튜브 (단계 2.1.4.)의 고무 튜브 캡을 관통 하 고 놓으면 뚜껑은 튜브와 튜브에 다시 기울어진된 롤러 믹서에 기능적인 부분 세포 현 탁 액에 완전히 몰입 하는 와이어를 삽입.
참고: 와이어의 트리플 헬리컬 기능 부분 충전에 걸쳐 세포 현 탁 액으로 처리 되어야 합니다. - 와이어를 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 5 rpm에서 기울이면된 롤러 믹서에 튜브를 회전 합니다.
- 5 mL 1 x PBS와 와이어를 헹 구 고 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 2-6 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장.
참고: 와이어의 기능 부분 PBS 셀을 해치지 않으려면 항상 침수 해야 합니다.
- 말 초 혈액과 인공 혼합물에서 대상 셀을 분리 (대체 메서드를 충전: 2.1. 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전)
- 이라는 셀 (섹션 1.2.) 높은 세포 밀도와 세포 정지를 희석 (> 1000000 셀/mL), 그로 인하여 말 초 혈액에 추가 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 낮은 유지.
- 500 500 000 셀 주변 혈액 5 mL을 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 믹스.
- 저장 격실에서 철사를 제거, 와이어를 잡고 고무 캡을 제거 하 고 1 x PBS에 그것을 씻어.
- 새로운 튜브 캡 캡 튜브와 튜브에에 배치 되 기울이면된 롤러 믹서 기능 부분 아군된 피에 완전히 몰입 되도록 주사기 바늘 (20 G)를 사용 하 여 장치의 작동 하지 않는 부분으로 침투.
참고: 와이어의 트리플 헬리컬 기능 부분 충전에 걸쳐 세포 현 탁 액으로 처리 되어야 합니다. - 실시간에서 30 분 동안 5 rpm에서 기울이면된 롤러 믹서에 튜브를 품 어
- 1 x PBS에 와이어 3 번을 씻어 고 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 어둠 속에서 그것을 저장 합니다.
참고: 와이어의 기능 부분 항상 셀을 해치지 않으려면 침수 해야 합니다.
- 낮은 볼륨 세포 현 탁 액에서 와이어를 충전 (충전 메서드를 대체: 2.1. 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전)
- 1 x PBS에 1000000 셀/mL에서 이라는 셀 resuspend
- 선반에 가로 150 m m 일회용 유리 파스퇴르 피 펫을 수정 합니다.
- 저장 격실에서 와이어를 제거 하지만 노란색 고무 모자는 와이어를 잡고 유지.
- 그런 기능성된 부분 유리 안 만질 파스퇴르 피 펫의 끝에 위치 하 고 피펫으로에 와이어를 놓습니다.
참고: 와이어의 끝 파스퇴르 피 펫 팁에서 충실 하지 해야 합니다. 와이어를 잡고 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 팁의 끝부분을 연결 하지 마십시오. 꽉 연결 하는 경우 셀 정지 피 펫 팁으로 반대편에서 로드할 수 없습니다. - 와이어의 기능성된 부분을 덮고 파스퇴르 피 펫의 끝에 세포 현 탁 액의 15 µ L를 로드 합니다.
- 품 어 10 분 수동으로 쿼터-턴에 대 한 와이어 조립된 와이어/파스퇴르 피 펫 팁 모든 분.
- 파스퇴르 피 펫 팁에서 와이어를 제거 하 고 린스 1 x PBS의 5 mL에 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 2-6 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장.
참고: 기능 부분 1 x PBS 셀을 해치지 않으려면 항상 침수 해야 합니다.
3. 계산에 셀
참고: 항상 셀을 해치지 않으려면 1 x PBS에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속.
- 그리스 펜을 사용 하 여 유리 슬라이드에 사각형 영역을 그리기 및 1 x PBS의 500 µ L을 추가.
- 와이어의 작동 하지 않는 부분을 구 부를 기능적 부분 1 x PBS에 몰입 되도록 유리 슬라이드에 넣습니다.
참고: 사각형의 영역에 맞는 완전히 커버 와이어의 기능적인 부분을 1 x PBS의 볼륨. 양면 접착 테이프를 사용 하 여 슬라이드에는 와이어의 작동 하지 않는 부분을 탑재. - 시각적으로 캡처된 셀 (그림 2B 2 층)을 열거 하는 와이어의 양쪽 모두를 검사 합니다.
참고: 셀의 존재 DAPI와 FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 여 결정 됩니다. 와이어의 양쪽 모두를 검사할 수 있습니다 그리고 셀 수 또는 (높은 셀 번호)에 대 한 평가 (셀의 낮은 수는 와이어에 연결 된 경우에 가능) 계산. 셀의 열거형 필요 하지 않은 경우이 단계를 생략 수 있습니다. - 스캔 후, 다시 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 와이어를 배치 (2.3.6 참고. 및 3.), 어둠에 와이어를 저장.
참고: 와이어의 작동 하지 않는 일부의 대부분 (를 포함 하 여 벤드) 잘라 수 있으며 감속/가속 저장소 제거.
4. 분리 및 대상 셀의 복구
참고: 셀의 분리 한다 할 수 4 h 이내 격리 후.
- 1 x PBS의 mL 당 4 mg의 릴리스 버퍼 구성 요소 (테이블의 재료 및 시 약)을 녹이 고 솔루션 준비-사용 버퍼를 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.
참고: 와이어의 폴리머는 EpCAM 제시 대상 셀에 대 한 바인딩을 허용 하는 안티-EpCAM 항 체와 공업화는 히드로의 구성 됩니다. 릴리스 버퍼 탄소-산소 분해 효소는 히드로 고착의 수를 포함 합니다. 위하여 분열 결과 폴리머 저하, 따라서, 캡처된 셀의 분리. - 전 5 분 동안 37 ° C에서 릴리스 버퍼 따뜻한.
- 1.5 mL 반응 관을 채우기 위해 릴리스 버퍼의 1.6 mL를 추가 합니다.
참고: 튜브 1.5 mL 반응 볼륨에 대 한 설계는 와이어의 기능적인 부분을 물속에 필요한 1.6 mL의 응용 프로그램 수 있습니다. - 오염 물 욕조에 부 화 하는 동안을 피하기 위해 1.5 mL 튜브에는 와이어를 해결 하기 위해 튜브 캡 대신 와이어와 함께 제공 된 고무 캡을 사용 하는 20 분 37 ° C (물 탕)에 릴리스 버퍼에 와이어의 기능 일부를 품 어.
- 15 분에 대 한 RT와 500 rpm에서 통 하 와이어/튜브 어셈블리를 전송 합니다.
참고: 뿌리는 1.5 m m의 궤도. - 원심 분리기에 와이어/튜브 어셈블리를 놓고 10 분에 대 한 300 x g 에서 회전 합니다.
- 튜브에서 와이어를 제거 하 고 뚜껑을 닫고 10 분에 대 한 300 x g 에서 다시 튜브 원심.
참고: 와이어 저장할 수 있습니다 2-6 ° C에서 1 x PBS에 셀 계산 분리 효율/확인에 남아 있는 셀에 대 한 평가를 위해 어둠 속에서. - 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 줄이기 위해, 100 µ L (micromanipulation)를 제외한 모든 나는 상쾌한 또는 300 µ L (cytocentrifugation 및 후속 레이저 기정)를 제거 하 고 즉시 단일 셀 샘플링을 진행 합니다.
5. 단일 셀 샘플링
- Micromanipulation
참고: 단일 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 WGA 허용의 2 µ L에 추가 됩니다. 처리, pipetting 및 장소 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 얼음으로 인 한 손실에 대 한 추가 볼륨을 계산 하는 셀의 수에 따라 마스터 믹스를 준비 합니다.- 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소) Czyż 외18에 의해 제시 된 프로토콜에 따라 준비 합니다. 간단히, 혼합 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 2.0 µ L 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L 및 12.8 µ L를 물 RNase/DNase 무료 한 10 샘플 (총 볼륨 20 µ L)에 대 한 마스터 믹스.
참고: 더 많은 샘플에 대 한 증가 볼륨 따라. 세포 세포의 용 해 마스터 믹스의 구성 레이저 서 샘플 (5.2 참조)를 활용 하 여 대체 절차에서 사용 되는 것에서 차이가 있다. - 그리스 펜을 사용 하 여 장소에 세포 현 탁 액을 들고 영역을 그립니다. 셀 밀도 너무 높은 경우 지역 및 볼륨 조정 (즉. 유리 슬라이드에 더 큰 영역을 표시, PBS와 세포 현 탁 액의 약 수 x 1을 로드).
- 전체 스테인드 세포 현 탁 액 (단계 4.8에서에서 얻은) 유리 슬라이드에 플라스틱
- 유리 슬라이드는 micromanipulator 갖춘 현미경에 전송. 5 분 (그림 2D 와 2 H)에 정착 하는 셀을 하자.
- 준비 0.2 mL PCR 튜브 셀 세포 마스터의 2.0 µ L 로드 (단계 5.1.1 참조.)을 혼합 하 고 얼음에 저장 합니다.
- 1 x PBS는 micromanipulator를 사용 하 여의 1 µ L에 단일 셀을 수집 하 고 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스를 포함 하는 관으로 전송.
참고: micromanipulated 세포 세포 세포의 용 해 버퍼에 전송 하기 위한 모 세관 세포 솔루션의 2 µ L에 직접 놓고 꺼낼 때까지 거품을 볼 수 있다. - 짧게 스핀 2000 x g 3에서 샘플 다운 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하는 데스크톱 microfuge를 사용 하 여 s. 얼음에 샘플을 놓습니다.
- 단일 셀 WGA에 직접 진행 (참조 6. 및 Czyż 외. 19)입니다.
- 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소) Czyż 외18에 의해 제시 된 프로토콜에 따라 준비 합니다. 간단히, 혼합 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 2.0 µ L 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L 및 12.8 µ L를 물 RNase/DNase 무료 한 10 샘플 (총 볼륨 20 µ L)에 대 한 마스터 믹스.
- 서 레이저 (대체 단일 셀 샘플링 방법: 5.1. Micromanipulation)
참고:이 섹션에서 사용 되는 마스터 믹스의 구성 섹션 5.1에서에서 micromanipulation에 사용에서 다릅니다. 단일 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소)의 4.5 µ L에 WGA에 대 한 추가 됩니다.- Czyż 그 외 여러분 에 따르면 셀 세포 마스터 믹스를 준비 19 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 5.0 µ L를 혼합 하 여 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 거동, 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L, RNase의 34.8 µ L / 10 샘플 (총 볼륨 45 µ L)에 대 한 마스터 믹스를 DNase 무료 물. 얼음에 마스터 믹스를 놓습니다.
참고: 더 많은 샘플에 대 한 증가 볼륨 따라. - UV 치료 막 코팅 슬라이드 레이저 기정에 적합합니다. 따라서 슬라이드 교차 하는 링커 장치 DNA에 놓고 약 10 분에 대 한 높은 UV에 노출 합니다.
- Cytocentrifuge와 cytospin 300 x g 5 분에 전체 세포 현 탁 액 막 코팅 슬라이드 조립.
참고: 셀 cytocentrifuged 솔루션에서 슬라이드에 있는 액체에 시스템을 사용 하 여 때 cytocentrifugation 후는 상쾌한을 제거 하 고 1 분 동안 1140 x g 에서 드라이 스핀을 적용. - 서 레이저 또는 cytospins 하룻밤 건조 및 장기 저장을 위한-20 ° C에서 샘플을 동결 하자 직접 진행 합니다.
- 4.5 µ L 0.2 mL PCR 튜브의 캡에 세포 세포의 용 해 마스터 믹스의 플라스틱 그리고 레이저 기정에 의해 단일 세포를 수확.
- 레이저 서 현미경에서 PCR 튜브를 검색 하 고 튜브를 닫습니다. 짧은 회전 하 여 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하 고 얼음에 샘플을 놓습니다.
- 단일 셀 WGA 진행 하십시오 또는 추가 처리 전에 최대 1 개월-80 ° C에 격리 샘플을 저장.
- Czyż 그 외 여러분 에 따르면 셀 세포 마스터 믹스를 준비 19 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 5.0 µ L를 혼합 하 여 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 거동, 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L, RNase의 34.8 µ L / 10 샘플 (총 볼륨 45 µ L)에 대 한 마스터 믹스를 DNase 무료 물. 얼음에 마스터 믹스를 놓습니다.
6. 어댑터-링커 기반 전체 게놈 증폭 18,19
참고: 모든 필요한 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소)는 준비 하 고 사용할 준비 얼음에 저장 된 다는 것을 확인 하십시오. 마스터 믹스 포함 micromanipulated에 대 한 DNA 소화 믹스 1 (5.1 참조.) 샘플 (반응 버퍼의 2.0 µ L, Mse의 2.0 µ L을 포함 나 제한 효소, RNase/DNase 무료 물 16.0 µ L) 또는 2 레이저 서 혼합 DNA 소화 (5.2 참조). 샘플 ( Mse의 2.5 µ L을 포함 나 제한 효소, RNase/DNase 무료 물 2.5 µ L), 미리 어 닐 링 마스터 믹스 (반응 버퍼의 5.0 µ L, preannealing PCR 어댑터의 각 5.0 µ L 및 15.0 µ L RNase/DNase 무료 물 포함), 결 찰 마스터 믹스 (미리 단련된 PCR 어댑터, 10.0 µ L 아데노신 3 인산 염 해결책, 및 10.0 µ L T4 리가 솔루션의 30.0 µ L 포함) 및 기본 PCR 주인 혼합 (포함 30.0 µ L PCR 버퍼, 10 m m deoxynucleotide 믹스 솔루션의 20.0 µ L, 한 중 합 효소의 10.0 µ L의 혼합 고 RNase/DNase 무료 물 340.0 µ L). 모든 볼륨 10 샘플을 준비 하기 위한 제공 됩니다. 그에 따라 조정 샘플의 수를.
- 세포 세포의 용 해에 대 한 열 cycler에 micromanipulated/레이저 서 샘플을 놓고 45 분, 30 분 및 10 분 동안 80 ° C 65 ° C 42 ° C에서 세포를 배양 하 여 단일 세포 세포의 용 해를 실행 합니다.
참고: 온수 뚜껑 열 cycler를 사용 합니다. 세포 세포의 용 해는 10 ~ 15 h O/N 할 수 있습니다. 이 경우, 65 ° c.에 인큐베이션 단계를 생략 - 미리 어 닐 링 PCR 어댑터의 실행 합니다. 따라서, 1 분 뒤에 추가 49 주기, 1 분 각, 65 ° C에서 열 cycler에서 미리 어 닐 링 마스터 믹스를 품 어 점점 감소 하는 온도 1 ° c와 함께/사이클. (15 ° C)에서 50 사이클 후 추가 사용까지 15 ° C에서 마스터 믹스를 품 어.
참고:이 단계는 결 찰에 대 한 적합 한 비대칭 어댑터를 생성 하는 데 필요한 (단계 6.6 참조). 단일 세포 dna를 받게 Mse나 제한 다이제스트. - 세포 세포의 용 해, 후 스핀 2000 x g 3에서 lysed 샘플 다운 하단에 모든 액체를 수집 하 고 얼음에 배치 하는 s.
- DNA 조각, 각 lysed micromanipulated 샘플을 DNA 소화 믹스 1의 2 µ L를 추가 하거나 DNA 소화의 0.5 µ L 2 레이저 서 샘플에 혼합 하 고 제한 다이제스트를 실행 합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 제한 효소 비활성화 단계 뒤 5 분 동안 37 ° C에 온수 뚜껑 열 cycler를 사용 합니다.
참고: 소화 37 ° C에서 3 h 연장 될 수 있습니다. 이것은 micromanipulation에서 가져온 샘플 및 레이저 기정에서 얻은 샘플 사이의 서로 다른 유일한 프로토콜 단계 이다. - 하단에 모든 액체를 수집 하 여 얼음에 샘플 아래로 회전 합니다.
- Ligating 소화 제한 DNA와 미리 단련된 어댑터, 결 찰 마스터의 5.0 µ L을 추가 대 한 각 소화 DNA 샘플을 혼합 하 고 1 시간에 15 ° C에서 열 cycler에 선.
참고:이 단계 12 h에 확장 될 수 있습니다 또는 O/n. 실행 - 하단에 모든 액체를 수집 하 여 얼음에 샘플 아래로 회전 합니다.
- 결 찰 제품의 각 기본 PCR 마스터 믹스의 40.0 µ L WGA에 대 한 추가 다음과: 처음으로 온수 뚜껑 열 cycler에 WGA를 실행, 3 분 동안 68 ° C에서 샘플을 품 어. 둘째, 40에 대 한 94 ° C에서 15 번에 대 한 주기 s, 57 ° C 30에 대 한 s와 1 분 30 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 다음 40 94 ° C에서 9 주기를 추가 s, 57 ° C + 1 ° C/사이클 30 s, 1 분 45 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 그 후, 23 번 40 94 ° C에 대 한 주기 s, 65 ° C 30 s, 1 분 53 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 마지막으로, 3 분 40 s 68 ° C에서 최종 확장을 수행 하 고 진정 4 ° c 샘플
- 샘플 하단에 모든 액체를 수집 하 고 DNA 품질 확인 또는-20 ° C 또는 장기 저장을 위한-80 ° C에서 샘플 저장을 아래로 회전 합니다.
7입니다. WGA 제품의 품질 관리
참고: 4plex QC PCR 5를 실행 한 후 DNA 검사 및 증폭 제품의 수의 범위에 따라 WGA 제품의 품질을 확인 하십시오. 평가 대 한 1.0 %agarose 젤에 WGA aliquots 및 각 QC PCR 샘플을 실행 합니다.
- 모든 뇌관 4plex 품질 관리 PCR (표 1)에 대 한 사용의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 합니다. 뇌관 풀의 200 µ L를 생성 하기 위해 PCR 급 물 136.0 µ L를 모든 뇌관의 8 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 3에 대 한 솔루션 s 2000 x g 3 s와 약 수 20 µ L-20 ° c.에 저장에서 스핀 다운
- 멀티플렉스 PCR 마스터를 준비 하려면 사용 표준 PCR 키트 포함 6.0 µ L 2 x PCR (프라이 머)를 제외 하 고, 물이 PCR 급의 4.5 µ L 컴포넌트와 뇌관 풀의 0.5 µ L의 혼합.
- WGA 제품의 1.0 µ L을 추가, 스핀 다운 및 실행된 PCR 2 분 동안 94 ° C에서 1 분, 1 분, 1 분 30 s 72 ° C에 뇌관 연장 위한 56 ° C와 최종 확장 단계에 단련 하는 뇌관 94 ° C에서 변성의 35 주기 뒤 7 분을 위한 72 ° C에서 4 ° C에 진정, 스핀 다운 고 젤 분석 같은 날 또는 나중에 분석-20 ° C에서 얼음에 샘플을 놓습니다.
참고: Peltier 요소의 장 수를 증가에 12 ° C에서 수행할 수 있습니다 열 cycler에서 놀 아 요. - WGA (6.8에서 획득) 및 각각 4plex QC PCR 제품 agarose 젤5에 분석.
Representative Results
CFSE와 핵 얼룩 후 셀 DAPI FITC에 대 한 필터를 장착 하는 면역 형광 현미경을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 반면 셀의 세포질 이기종 간 세포 농도 (그림 2A 및 2E) CFSE와 균일 한 라벨 핵 DAPI 채널에 밝은 counterstain 제시. 비슷한 모양 및 강렬을 얼룩이 지 와이어 (그림 2B 와 2 층)에 연결 된 셀에서 예상으로 전선에서 분리 있으며 슬라이드 (그림 2D 및 2 H)에 복구.
높은 세포 밀도 (예 > 1000000 셀/mL) 전선을 충전 셀 와이어의 전체 범위에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 낮은 세포 밀도, 인큐베이션, 동안 회전 속도 변화 및 다른 세포를 사용 하 여 분리 효율에 영향을 별도로 테스트 하는 데 필요한. 때 전선을 했다 인 큐베이 팅 100 000에 HT-29 셀의 5 mL와 셀 / mL으로 섹션 2.1에서에서 설명., 254 ± 103 셀의 평균 (n = 5) 철사에 체포 되었다. 같은 실험 LNCaP 셀, 440 ± 319 셀의 평균을 사용 하 여 (n = 5) 와이어 당 획득 했다.
75 ± 18, 25 ± 9 셀 전지와 47 ± 57 셀의 캡처 귀착되 었 다 (에 따르면 프로토콜 섹션 2.2.) 전선 주변 혈액 5 mL의 배경에서 500, 5 000, 50 000 HT-29 세포 (n = 3, 각각), 각각. 와이어 15 µ L 섹션 2.3에서에서 프로토콜에 따라 세포 현 탁 액 (1000000 셀/mL)의 비용이 청구 됩니다 경우., 1 000 (HT-29)까지 셀 철사에 첨부할 수 있습니다.
HT-29 셀에 81%에서 배열 했다 분리 효율성 셀 (범위 54.9%-93.2%, 및 n = 5) 81% (범위 63.51-92.87%, n = 6) 91% (범위 84.7%-95.3%, n = 6) LNCaP 시내 VCaP 세포, 각각. 마찬가지로, 분리 된 세포의 복구 셀 라인 다릅니다: 분리 된 HT-29 셀의 28%의 평균 cytocentrifugation에 의해 재기 되었다. LNCaP에 대 한 회복 율 10% 미만인 반면, VCaP 셀에 대 한 평균 복구 율은 55%.
단일 셀의 약 75%에 WGA 수확량 고품질 WGA 제품 복종: 이것이 1) > 1 kb (그림 4, 맨 위 패널)와 2) 3 0.1에서 배열 하는 WGA 제품의 얼룩 또는 4 밴드 4plex 품질에서 제어 PCR (그림 4, 하단 패널) . WGA 제품에 대 한 1) 배열-CGH 다시 증폭 WGA 7후 단일 셀 배열 CGH 프로필 6,7 과 2) 타겟된 NGS에 대 한 품질 기준에 부합 하는 프로 파일링을 사용할 수 있습니다.
그림 1: 분리 하 고 복구 하는 단일 세포 분석에 대 한 대상 셀에 대 한 워크플로. (A) 세포 90 %confluency 교양 하 고 (B) 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 수확. 기능성된 와이어 CFSE와 핵 얼룩, (C) 얼룩 후를 incubated 5 mL 반응 관을 사용 하 여 볼륨 또는 낮은 볼륨 파스퇴르 피 펫 팁을 사용 하 여 셀의 존재. 후자의 수 있습니다 셀 서 스 펜 션의 응용 프로그램에 대 한 낮은로 15 µ L. (D) 셀 충전 후 4 시간 이내 분리할 필요가. 따라서, 와이어 릴리스 버퍼 가득 1.5 mL 반응 관에 배치 됩니다. 15 분 보육 로커에 10 분 원심, 후 철사를 제거 하 고 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 centrifuged. (E) 복구 세포는 중 단일 셀 micromanipulation (맨 위) 또는 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 유리 슬라이드에 전송 하 고 서 (아래)를 레이저로 전달. (F) 마지막으로, 수확된 단일 셀은 전체 게놈 증폭 (WGA)에 의해 증폭 됩니다. WGA 제품 배열 CGH 및 타겟된 NGS 다운스트림 분석과 호환 됩니다. EpCAM epitope: 세포 표면에 녹색 원. 와이어 기능성: 장치, 회색 트리플-나선형 와이어. 폴리머: 보라색 라인입니다. 안티-EpCAM 항 체: 오렌지. 버퍼 활동 발표: 빨간 화살표. 장소에 세포 현 탁 액을 그리스 마커: 다크 블루 타원. 세포 현 탁 액을 복구: 밝은 파란색. Micromanipulation에 대 한 모 세관: 블랙 라인. 확대: 복구 된 셀 micromanipulation에 의해 수확에 막 덮여 cytospin 슬라이드 포함 복구 세포 (회색 채워진된 타원). 확대: microdissected 레이저 복구 된 셀 되 (원형 선 회색: 막 슬라이드 레이저 서 위한 등뼈로 봉사에서 막), 레이저 빔 (파란색 선 막 슬라이드를 아래에서 접근)으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시각화 이라는 셀. (A, E) 충전 하기 전에 셀: 셀 CFSE와 표시 및 dna 염료 CFSE의 범위 (녹색) 신호 강도 보여주는 intercalating counterstained. (B,F) 통신 중에 캡처한 이라는 셀. (C,G) 휴대-분리 절차 후 와이어. (D,H) 셀은 와이어에서 분리 하 고 슬라이드에 cytocentrifugation에 의해 발견. CFSE: FITC 채널 (녹색)입니다. DNA 얼룩: DAPI 채널 (파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 와이어 및 스토리지 구획. 와이어의 (A) 구획. (B) 기능성된 부품의 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 단일 micromanipulated 세포에서 얻은 WGA 제품의 품질 관리. 상단 패널: 단일 세포에서 얻은 WGA 제품 일반적으로 DNA에 결과 얼룩 피크 강도 약 0.5 k b에 0.2 kb에서 > 1.0 kb에 이르기까지. 샘플 번호 1, 7, 13 차선 표시 (별표 표시) 또는 아무 DNA 얼룩. 하단 패널: WGA 제품은 충분 한 품질의 4plex PCR 수익률 3 또는 4 4 PCR 제품의 경우 (100, 200, 300, 그리고 400에 bp). 예제 1, 7, 10, 및 13 3 밴드를 표시 하 고 추가 분석에서 제외 될 것 이다. 레인 M 100 bp 사다리를 포함 하 고 별표 부족 WGA 제품 품질의 샘플을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 순서 | 참고 |
| 5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3 | 100 bp 앞으로 뇌관 |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 | 100 bp 역 뇌관 |
| 5 ' agg tgg agc gct agc-3 ' 개 그 | 200 bp 앞으로 뇌관 |
| 5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 | 200 bp 역 뇌관 |
| 5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3 | 300 bp 앞으로 뇌관 |
| 5 ' tcc 법 aac cag tca gcg tc-3 | 300 bp 역 뇌관 |
| 5 '-aca gtc 고양이 gcc atc 법 gc-3 | 400 bp 앞으로 뇌관 |
| 5 ' gct tga caa agt ggt cgt 안내-3 | 400 bp 역 뇌관 |
표 1: 4plex 품질 관리 PCR 뇌관 순서
Discussion
설명된 프로토콜은 단일 셀 비보 전 게놈 분석을 위한 기능성된 와이어 (장치 라고도 함)에서 셀을 검색 목표로 합니다. 우리 테스트 3 EpCAM 양성 세포 선 (HT-29, LNCaP, 및 VCaP), 하지만 원칙적으로이 방법은 EpCAM 표현 모든 셀 라인에 적용할 수 있습니다. EpCAM 긍정적인 대상 셀 순수 셀 서 스 펜 션 장치를 발표 될 수 있다 (2.1 참조) 또는 배경 셀의 흑자에 혼합 (예. 주변 혈액, 2.2 참조.). 특히 후자의 격리 용량 드문 셀 조건에서 테스트를 사용할 수 있습니다, 반면 와이어에 연결 된 셀의 수의 미세 조정 할 수 있습니다 설명된 낮은 볼륨을 사용 하 여 접근 (2.3 참조.). 로 셀 라인 간의 차이 예상 될 것 이다, 와이어, 회전을 충전을 위한 적당 한 셀 밀도 속도 뿐만 아니라 보육 시간 면역 형광 현미경을 사용 하 여 연결 된 셀의 수를 계산 하 여 경험을 테스트 될 필요가.
단일 셀 수준 WGA에서 게놈 다운스트림 응용 프로그램에 대 한이 필요 합니다. WGA 방법의 선택 실험실 사이 다를 수 있습니다 그리고, 원칙적으로, 우리의 메서드는 micromanipulation 또는 레이저 기정에서 얻은 샘플을 처리할 수 있는 보다 모든 방법에 열려. 이 프로토콜 열-조각화 기반 WGA7에 비해 더 나은 성능으로 인해 효소 조각난된 DNA 기반 방법을 사용 하 여. 옵션, 단일 셀 수 있도록 후속 DNA 프로 파일링20,21등온선 WGA에 전달할 수 있습니다.
설명된 프로토콜 게놈 단일 세포 분석을 위한 기능성된 와이어의 새로운 세대에 연결 되 고 후 그대로 세포 회복을 목표로 합니다. 또한 지금까지 시장에서 vivo에서 만 CE 승인 농축 장치, 대표 기능성된 와이어의 첫 번째 세대 열거 하는 CTCs 전이 암 환자에서 사용 되었다. 이전 게시 하 고 우리 자신의 데이터 현재 골드 표준 기술2에 비해 더 민감한 vivo에서 의 절연 기술을 제안 합니다. 따라서, 장치에서 실현이 비보에 격리 기술을 복구 기능을 갖춘 단일 세포 수준에서 묘사와 높은 CTC 복구를 결합 수 있습니다.
그러나, 장치에 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다, 그리고 따라서, 임상 데이터는 사용할 수 없습니다. Ex vivo 응용 프로그램 (즉, 샘플링 후 CTCs 주변 혈액에서 분리) 기술은 이다 cubital 헛된, 예를 들어 낮은 직경 헛된 (증가의 확률의 현재 설정에 적응에 권장 하지 않습니다 CTCs과 잡기 항 체 사이 접촉을 직접) 및 긴 보유 시간 (30 분, 와이어를 통과 하는 혈액의 2-3 L을 허용). 그러나,에 개요 섹션 2.2로. 대상 셀 혼합된 샘플7으로부터 격리 될 수 있습니다.
방법의 현재 한계는 전선에서 분리 후 고정 되지 않은 셀의 비효율적인 회복 이다. 그러나 이것,, 분리 처리 이전 셀 고정 단계에 의해 향상 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜은 유전자 단일 셀을 특성화에 대 한 사용은 vivo에서 격리 기법 셀 복구를 향한 첫 번째 단계입니다. 셀 복구 및 환자1,2에서 응용 프로그램에 대 한 허가의 최적화를 해결 하기 위해 더욱 노력 해야 합니다. 그러나, 치료 모니터링 및 치료 결정에 대 한 맞춤된 의학 CTCs 열거 벗어납니다. 따라서,이 메서드는 단일 세포 수준에서 게놈 CTC 특성화 향한 첫 번째 단계.
단일 셀 transcriptome 분석으로 응용 프로그램 것으로 그대로 세포 수확 가능. 그러나, 그것은 회복 절차 (예: 실시간 정량22뒤 직접 세포에 복구 된 단일 셀을 전달) RNA 무결성에 영향을가지고 있는지 평가 하 남아 있다. 성공 하면, 단일 셀 (예: CTCs)의 특성화 transcriptome 수준, 더 자세한 분석을 허용 하 이동 수 있습니다. 이 점에서 RNA-seq로 양이 많은 PCR에 (RNA-seq 라이브러리 준비 하는 동안 얻은) preamplified cDNA를 대상이 될 수 있는 단일 세포의 RNA 다운스트림 분석을 위한 유용한 도구를 제공 스마트 seq2를 사용 하 여. 이 결합된 대상 및 단일 복구 된 셀22,23의 심사 기반 분석을 허용할 것 이다.
현재 기능성된 와이어 CTCs24의 긍정적인 선택에 대 한 널리 상피 마커는 안티 EpCAM 항 체를 기반으로 합니다. 여러 CTCs 수도 cytokeratins 등 EpCAM25downregulate 상피 마커, HER2/새 등 항 체를 추가 CTC 절연의 기회를 증가할 것입니다. 여러 가지 항 체 농축 전략 개발 되었고 페 레이 외의 검토를 기반으로 합니다. 201626에. 와이어에 움직일 항 체의 혼합물 더 높은 숫자의 격리 및 추가 하위 CTCs의 기술의 미래 향상 될 수 있습니다.
그것은 그것의 기능을 유지 하기 위해 솔루션에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속 처리 하는 와이어를 포함 하는 모든 단계에 대 한 필수입니다. 평가 (현미경; 중 1 x PBS에 와이어를 배치 하는 것이 좋습니다. 예. 3.1 단계. -3.3.) 그리고 저장입니다. 부적절 한 얼룩을 피하기 위해 갓을 사용 하 여 단계 1.2.1 얼룩 솔루션을 준비 하는 것이 좋습니다. 1.2.2 하 고입니다. 약하게 스테인드 셀 셀에 계산을 방해 하 고 연결 된 셀의 과소를 이어질 수 있습니다.
그것은 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 파스퇴르 피펫으로 세포 현 탁 액 (단계 2.3.4.)의 후속 로드에 와이어를 삽입할 때 연결 하지 않도록 해야 합니다. 고무 캡 기능 부분 파스퇴르 피 펫의 끝 안에 위치 하 고 자리에는 와이어를 잡고 하는 데 사용 됩니다. 뚜껑 파스퇴르 피 펫의 후면에 너무 단단히 연결, 세포 현 탁 액의 로드 불가능 합니다. 이 경우에 로드 셀 서 스 펜 션에 의해 전치 되는 공기는 피 펫을 남길 수 있습니다 뚜껑을 쉽게.
와이어 벤딩 하는 것은 단계 3.2에서 셀 동안 그것의 방향에 대 한 중요 합니다. 그리고 3.3입니다. 와이어 철사의 비 기능 끝 한쪽에 거짓말을 제공 되도록 접착 테이프를 사용 하 여 탑재 합니다. 스캔 후 기능 부품의 전체 길이, 와이어는 압 연 180 ° 그래서 기능 와이어의 나머지 절반을 검색할 수 있습니다. 이 단계는 초기 실험에는 셀의 수를 평가 하는 것이 중요. 일단 특정 셀 라인 및 절차에 대 한 셀의 수 계산 절차 셀 계산 없이 반복 될 수 있다 (예.만 셀의 존재에 대 한 검사 또는이 단계 생략). 주의 pipetting 손실을 방지 하기 위해 셀 단계 4.8에서에서 상쾌한의 볼륨을 감소 때 결정적 이다. 펠 릿에 소란 없이 원활 하 게 이루어집니다 pipetting 다는 것을 확인 하십시오.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF), 프로젝트 아니오 투자 되었다. 난 ERANET 프로젝트에서 변환 암 연구 (TRANSCAN) "으로 전립선 암 (CTC-스캔)에 있는 최소 잔여 질병 바이오 마커 순환 종양 세포"의 일환으로 (추 신)을 1220 B19. 박사 학위 후보자 사우스 캐롤라이나 의료 그라츠 대학교의 박사 학위 프로그램 분자 의학의 프레임 내에서 훈련 되었다. 저자는 기꺼이 그들의 전문 기술 지원에 대 한 니 나 Schlögl, 다니엘 Kummer, Gabi Wendt, 클 라우 디 아 Chudak, 줄리아 슐츠, 그리고 요한 나 쉴러 인정합니다. 저자는 게오르그 Peinhaupt 그래픽 디자인 지원 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
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- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
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