Summary
Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.
Abstract
Nadir hedef hücreleri hedef hücre yüzey proteinleri ilişkin antikorlar özel kullanarak hedef olmayan hücre yüksek bir arka plan ayrılmış olabilir. Son zamanlarda gelişmiş bir yöntem tıbbi bir tel ile Anti-epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) antikorları tümör hücreleri (CTCs)1dolaşan vivo içinde yalıtım için functionalized kullanır. Hasta eşlemeli bir kohort sigara metastatik prostat Kanserinde vivo içinde yalıtım teknik CTCs yanı sıra geçerli altın standart CTC numaralandırma kıyasla daha yüksek CTC sayıları için pozitif hastalar daha yüksek bir yüzdesi sonuçlandı gösterdi. (Aygıtı olarak adlandırılır) yeni functionalized dinleme cihazı gibi hücreleri geçerli tıbbi cihazlardan kurtarılamaz, enzimatik tedavi ile yakalama ve hücre sonraki dekolmanı izin üretildi. Hücreleri mikroskop üzerinde görüntülenir ve enzimatik tedavi kullanarak müstakil aygıt eklemek için izin verilir. Kurtarılan hücre membran kaplı slaytlar üzerine cytocentrifuged vardır ve tek tek lazer mikrodiseksiyon veya Embriyolardan yoluyla hasat. Tek hücre örnekleri sonra eleme ve hedef özgü yaklaşımlar da dahil olmak üzere birden çok akış aşağı analiz izin tek hücreli tüm genom amplifikasyon tabi tutulmaktadır. İzolasyon ve kurtarma yordamı yüksek kalitede DNA tek hücreden verimleri ve sonraki tüm genom amplifikasyon (WGA) zarar değil. Tek bir hücrenin güçlendirilmiş DNA tarama için iletilebilir ve/veya analiz dizi karşılaştırmalı genom hibridizasyon (dizi-CGH) veya sıralama gibi hedef. Cihazın yapay nadir hücre örnekleri (5 mL periferik kan çiviliYani 500 hedef hücreleri) ex vivo izolasyon sağlar. Dekolmanı oranları hücre kabul edilebilir (50-%90) ise, geniş bir cep telefonda kullanılan bağımlı slayta müstakil hücreleri iyileşme oranı yayılan (< 10 - > % 50) ve biraz daha fazla dikkat gerekir. Bu aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez.
Introduction
Son zamanlarda, CellCollector DC01, kanser hastaları, periferik kandan CTCs izole için anti-EpCAM antikorlar ile functionalized bir tıbbi tel CTC numaralandırma1,2,3 metodik spektrum eklendi . Sigara metastatik prostat kanseri şu anda devam eden bir çalışmada, bu functionalized Tel neredeyse iki katı kadar hastalar CTC-pozitif raporları ve CTC-pozitif hastaların CellSearch, CTC numaralandırma3 altın standart kıyasla daha yüksek CTC sayar . Bu cesaret verici performans nedeniyle yalıtım functionalized tıbbi dinleme cihazı tek hücre analizi için hücre arzu olurdu ama ne hücre dekolmanı Çözümleri (örneğin tripsin) ile enzimatik tedavi ne lazer mikrodiseksiyon sağlar sağlam hücreleri (veri gösterilmez) kurtarma.
Yakalanan hücre dekolmanı izin vermek için yeni nesil functionalized teller belirli bir polimer ile donatılmıştı. Tel yakalama antikorları bağlayan bu polimer, duyarlı bir yayın arabellek tedavi dekolmanı sağlam hücre (CellCollector DC03 için aygıtı olarak da adlandırılır) izin olduğunu. Yeni functionalized aygıt, hedef hücre kanser hücre satır hücrelerini sığır serum albumin (BSA) çivili çeşitli konsantrasyonları yalıtım sağlar / fosfat tamponlu tuz (PBS) ve periferik kan, anılan sıraya göre.
Üstünde belgili tanımlık aygıt ve kurtarma sonra hücre görsel algılama kolaylaştırmak için hedef kanser hücrelerinin carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ve kurtarma tedavi öncesi bir DNA leke etiketli (i.e. şarj ve ayırma). Tek hücre DNA kalitesi üzerinde tedavi etkileri sonra WGA bir kalite kontrol PCR4,5aracılığıyla, dizi-CGH6,7 daha önce değerlendirildi ve sıralama7 fark gösterilen hedef tedavi olmayan hücreleri micromanipulated için hücre süspansiyonlar7karşılaştırıldığında. Bu yöntemin avantajı hücreleri tek hücre aşağı akım analizi (şekil 1) için kurtarma ve nadir hedef hücre ön zenginleştirme kombinasyonu yatıyor. Geçerli CE etiketli vivo koleksiyonu aygıtı genellikle CTCs numaralandırılmasına için değil tek hücreli moleküler karakterizasyonu2,8için kullanılır. Ancak, CTCs arasında heterojenite araştırmak için daha kapsamlı bir analiz analizi tek hücre düzeyinde (hedefYani sıralama tek hücre düzeyinde) için uzun. Diğer hücre tabanlı yöntemleri immunomagnetic yalıtım EpCAM pozitif CTCs ve daha sonraki moleküler genetik analiz9,10dielectrophoresis göre tek hücreli işleme, temel alır. CTCs moleküler karakterizasyonu bir klinik ortamda yararlı uygulamaları için önemli bir gereksinimdir ve metastatik cascade temel araştırmada aynı derecede önemlidir. DNA analizi ile en az teknik yalıtım yordamlar11,12tümör yükünün izin verdiği için CTCs paralel olarak büyük önem dolaşımdaki tümör DNA (ctDNA) haline gelmiştir. Hücre tabanlı yaklaşımlar tamamlayıcı bir katkı olarak hizmet verebilir, RNA13,14 ve protein15 ifade analizi için izin verdiği ve CTC için hücre kültürleri veya xenografts16, da elde 17. her ne kadar düşük hücre kurtarma ve hastalarda kullanım için izin gibi engeller hala aşılması gereken, yakalamak ve yöntem serbest nadir hedef hücrelerin karakterizasyonu doğru önemli bir sonraki adım alır.
Protocol
Tüm yordamları tıbbi Graz Üniversitesi (12/13 eski 25-240) Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Deneyler spiking için periferik kan sağlıklı bireyler örnek.
Not: Bu protokol HT-29 hücreleri (insan kolon kanseri hücre satırı) PBS veya yapay karışımları HT-29 hücreleri ve periferik kan yalıtım açıklar. Aynı deneyi iki ek hücre hatları (LNCaP ve VCaP, deneysel verilerin temsilcisi sonuçlarında) ile gerçekleştirilmiş ve teorik olarak EpCAM ifade tüm hücreleri ile gerçekleştirilebilir.
1. hedef hücrelerin hazırlanması
- Hücre kültürü ve hücrelerin etiketleme
Not: Bu protokol için 75 cm² kültür şişeler içinde hücreler kültürlü. Diğer hücre kültür cihazlar kullandıysanız lütfen reaktifler miktarda uygun şekilde ayarlayın (örneğin 25 cm² kültür yemekleri, 6-şey plakaları, vb). Kullanılan tüm sıvılar su banyosu içinde 37 ° c önceden ısındı. Eğer aksi belirtilmediği değil, tüm protokol adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir.- Kültür HT-29 McCoy'un 5a modifiye 2 mM L-glutamin, 20 mM Hepes, % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin %5 CO2 atmosferde 37 ° C'de ile takıma orta hücrelerde.
- Hücreleri % 90 birleşmesi olduğunuzda, orta kaldırmak ve 10 mL 1 x PBS hücrelerle durulayın.
- Hücre hasat için hücrelere hücre dekolmanı çözümü (tablo malzemeleri ve Kimyasalları) 2 mL ekleyin ve yaklaşık 5 dk 37 ° C'de için hücreleri kuluçkaya
Not: Dekolmanı çözüm proteolitik içerir ve 1 x PBS, 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 3 mg/L fenol red collagenolytic enzimler. Bu 37 ° C'de 1 saat sonra etkin değil olarak en düşük hücre dekolmanı çözüm öncesi ısınma süresini azaltmak Optimum hücre dekolmanı elde etmek için bütün hücre katmanı kapsar. - Dekolmanı ters bir mikroskop kullanarak hücre kontrol.
- 10 mL hücre kültür orta (aynı adım 1.1.1 kullanılır.) ile doldurulmuş bir 50 mL tüp her müstakil hücreleri aktarmak ve hücreleri pipetting tarafından resuspend.
- Yatay silindir Mikser RT, kalan hücre süspansiyon yerleştirin ve etiketleme adıma geçin.
- Hedef hücrelerin hücre etiketleme yaşamak
- 5 mm (Dimetil sülfoksit, DMSO sağlanan) CFSE 1 ml 1 x PBS seyreltik 1 µL 37 ° C 5 mikron kullanıma hazır CFSE etiketleme çözümü elde etmek için önceden ısıttı.
Not: en iyi boyama sonucu almak için taze hazırlanmış çözümler kullanın. - Kullanıma hazır DNA boyama çözeltilerine (tablo malzemeleri ve Kimyasalları) 1 x PBS hazırlamak ve 2-6 ° c ışıktan korunan saklayın.
Not: en iyi boyama sonucu almak için taze hazırlanmış çözümler kullanın. - 300 x g 10 dakika süreyle de hücre kaldırma yatay silindir Mikser (Adım 1.1.6.) hücrelerden ve Pelet süpernatant al ve 10 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend.
- 1 x PBS tekrar hücrelerle durulama ve hücre Pelet 500 µL kullanıma hazır CFSE etiketleme çözümü içinde resuspend.
- 15 dakika 37 ° C'de hücreler kuluçkaya ve Santrifüjü vasıl 300 x g 3 dk sonra hücreleri toplamak.
- Önceden ısıtılmış hücre kültür orta 1 mL etiketli hücreleri resuspend ve hücreler için 30 dk 37 ° C'de yeniden oluşturmak izin verir.
- Santrifüjü 300 x g 3 dk de tarafından hücreleri hasat ve hücre topakları kullanıma hazır DNA çözüm için 10 dk. 37 ° C'de boyama 1 ml resuspend.
- Hücreleri cips, süpernatant kaldırmak ve 4 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu değerlendirmek ve floresan mikroskop kullanarak Floresans etiketleme 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve floresein isothiocyanate ile donatılmış (FITC) filtreleri (şekil 2A ve 2E) için kontrol edin.
- Santrifüj kapasitesi 300 x g 3 dk de hücreleri ve hücre Pelet ilgili deneyde bir sonraki bölüm ve buz üzerinde yer verilen için gerekli hücre yoğunluğu göre resuspend.
- 5 mm (Dimetil sülfoksit, DMSO sağlanan) CFSE 1 ml 1 x PBS seyreltik 1 µL 37 ° C 5 mikron kullanıma hazır CFSE etiketleme çözümü elde etmek için önceden ısıttı.
2. şarj tel
Not: Hücreleri hedef hücre/periferik kan spikings mililitre ölçekte veya hücre microliter ölçekte düşük sayısı sağlayarak üzerinden ayrılmış olabilir. İse periferik kan hücre nadir durumda taklit için eski yaklaşım sağlar, ikinci protokol optimizasyon/test amacıyla kaç hücre eklemek için tercih edilen yolu olabilir.
- Hücre süspansiyonlar büyük miktarda kullanarak Tel şarj
- BSA 0.8 g 40 ml 1 x PBS (hücre kültür kullanım) çözülerek çözüm engelleme % 2 BSA hazırlayın. İlk vortexing ve 10-20 dk için yatay silindir Mikser üzerinde RT, sonraki kuluçka BSA geçiyoruz.
- Durulama boş EDTA tüpler/sodyum heparin tüpleri ile antikoagülan artıkları kaldırmak ve çözüm atmak için % 2 BSA 2 mL. 30 dk 15 dönüş/dak, bir yatay silindir Mikser üzerinde % 2 BSA ile 5 mL RT, kuluçka tarafından boru yüzey engellemek ve çözüm atın.
- Etiketli hücreleri (Bölüm 1.2.) yoğunluğunun 100 000 hücre/mL seyreltik ve 5 mL tel şarj etmek için kullanın.
- Etiketli hücre süspansiyon (Toplam 500 000 hücreleri) 5 mL tüp ekleyin. Kabarcıklar hücre süspansiyon eklerken kaçının.
- Tel tel tutan plastik kap yanı sıra saklama bölmesi kaldırmak ve 1 x PBS (şekil 3) durulayın.
- EDTA tüp (Adım 2.1.4.) kauçuk tüp kap bir şırınga iğnesi (20 G) yardımı ile nüfuz ve kapağı üzerinde hareket ettirildiğinde silindir karıştırıcı geri tüp ve tüp üzerinde yerleştirildiğinde hücre süspansiyon tam olarak işlevsel bölümü dalmış öyle ki kabloyu takın.
Not: Tel üçlü sarmallı fonksiyonel parçası boyunca şarj hücre süspansiyon ile örtülmelidir. - Bir eğik silindir Mikser tel takmak hücreleri izin vermek 30 dk için 5 devirde üzerine boruları döndürün.
- Tel 5 mL 1 x PBS ile durulayın ve 2-6 ° C'de karanlık kadar görsel muayene 1 x PBS içeren 15 mL tüp içinde saklayın.
Not: Tel fonksiyonel parçası her zaman PBS içinde hücrelerin zarar önlemek için ve sular altında olmalıdır.
- Yapay karışımları ile periferik kan hücrelerinden hedef izole (alternatif yöntem için şarj: 2.1. Hücre süspansiyonlar büyük miktarda kullanarak Tel şarj)
- Hücre süspansiyonlar yüksek hücre yoğunluğu ile elde etmek için etiketli hücreleri (Bölüm 1.2.) seyreltik (> 1 000 000 hücre/mL), böylece hücre süspansiyon periferik kan eklendi hacmi düşük tutmak.
- 500-500 000 hücreleri için 5 mL periferik kan ve onları tüp ters çevirme karıştırın.
- Tel saklama bölmesi kaldırmak, teli tutan lastik kapağını çıkarın ve 1 x PBS durulayın.
- Yeni bir tüp kap kap üzerinde hareket ettirildiğinde silindir karıştırıcı geri tüp ve tüp üzerinde yerleştirildiğinde çivili kanda tam olarak işlevsel bölümü dalmış öyle ki bir şırınga iğnesi (20 G) kullanarak aygıtı işlevsel olmayan parçası ile nüfuz.
Not: Tel üçlü sarmallı fonksiyonel parçası boyunca şarj hücre süspansiyon ile örtülmelidir. - 30 dk RT. az 5 devirde eğik silindir Mikser tüp kuluçkaya
- Tel 3 kez 1 x PBS durulayın ve 1 x PBS kadar görsel muayene içeren bir 15 mL tüp karanlıkta saklayın.
Not: Tel fonksiyonel parçası her zaman hücreleri zarar önlemek için ve sular altında olmalıdır.
- Düşük hacimli hücre süspansiyonlar tel şarj (alternatif yöntem için şarj: 2.1. Hücre süspansiyonlar büyük miktarda kullanarak Tel şarj)
- 1 000 000 hücre/mL 1 x PBS, etiketli hücreleri resuspend.
- 150 mm tek kullanımlık bardak Pasteur pipet yatay bir raf düzeltmek.
- Tel saklama bölmesi kaldırmak ancak teli tutan sarı plastik kap tutmak.
- Öyle ki functionalized bölümü cam değil müessir Pasteur pipet ucu içinde yer alan tel pipet yerleştirin.
Not: Tel ucu Pasteur pipet ucu dışarı sopa. Pasteur pipet ucu arka sonu teli tutan kauçuk kapaklı takmayı kaçının. Sıkı iliştirdiyseniz, hücre süspansiyonlar diğer taraftan pipet ucu yüklenemiyor. - Hücre süspansiyon 15 µL tel functionalized parçası kapsayan Pasteur pipet ucu yükleyin.
- 10 dk. el ile çeyrek dönüş için tel monte tel/Pasteur pipet ucu her dakika kuluçkaya.
- Tel Pasteur pipet uç--dan kaldırmak, 5 mL 1 x PBS durulayın ve 2-6 ° C'de karanlık kadar görsel muayene 1 x PBS içeren 15 mL tüp içinde saklayın.
Not: Fonksiyonel bölümü her zaman hücreleri zarar önlemek için 1 x PBS içinde ve sular altında olmalıdır.
3. tel Hücre sayımı
Not: Her zaman hücreleri zarar önlemek için 1 x PBS içinde sular altında tel fonksiyonel tutmam.
- Bir yağ kalem bir dikdörtgen alan bir cam slayt üzerinde çizmek ve 1 x PBS 500 µL eklemek için kullanın.
- Tel işlevsel olmayan parçası bend ve fonksiyonel Bölüm 1 x PBS dalmış öyle ki cam slayt üzerinde yerleştirin.
Not: dikdörtgenin alanı ve hacmi 1 x PBS tamamen işlevsel tel parçası kapak için uygun. İkiyüzlü bir yapışkan bant slayt üzerinde non-görev bölümü tel bağlamak için kullanın. - Yakalanan hücreleri (şekil 2B ve 2F) numaralandırmak için tel her iki tarafını kontrol edin.
Not: Hücrelerin varlığı DAPI ve FITC için filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak belirlenir. Tel her iki tarafını kontrol ve hücre sayısı değerlendirildi (yüksek hücre sayıları için) ya da (tek hücre düşük sayılar tel iliştirilmişse mümkün) sayılır. Numaralandırma hücre gerekli değilse bu adım-ebilmek var olmak Kaptan. - Taramadan sonra kabloyu geri 1 x PBS içeren 15 mL tüp içine yerleştirin (bkz: Not 2.3.6. ve Bölüm 3.), karanlıkta tel saklayın.
Not: Tel işlevsel olmayan parçası çoğu (viraj da dahil olmak üzere) kesilmiş olabilir ve kolaylaştırıcı depolama kaldırıldı.
4. dekolmanı ve hedef hücre kurtarma
Not: Dekolmanı hücrelerin içinde 4 h sonra izolasyon yapılacaktır.
- Yayın arabelleği bileşenin (tablo malzemeleri ve Kimyasalları) 4 mg 1 x PBS mL geçiyoruz ve çözüm kullanıma hazır arabellek elde etmek için 0.2 µm steril filtre ile filtre.
Not: Polimer tel EpCAM sunulması hedef hücrelere bağlamaya izin vererek anti-EpCAM antikorlar ile functionalized bir hidrojel oluşur. Çıkış arabelleği hidrojel bulandı yetenekli bir karbon-oksijen proteolitik enzim içerir. Proteolitik bölünme polimer bozulması ve dekolmanı yakalanan hücre, böylece, sonuçlanır. - Çıkış arabelleği 5 min için 37 ° C'de önceden ısıtmak.
- 1.5 mL tepki tüp doldurmak için çıkış arabelleği 1.6 mL ekleyin.
Not: 1,5 mL tepki birimleri için tasarlanmış tüpler 1.6 mL tel fonksiyonel parçası batış için gerekli olan uygulama sağlar. - 20 dk. kullanmak için tüp kap yerine tel ile birlikte gelen lastik kap su banyosunda kuluçka sırasında kirlenmesini önlemek için 1,5 mL tüp tel düzeltmek için tel çıkış arabelleği 37 ° C'de (su banyosu) fonksiyonel parçası kuluçkaya.
- RT ve 500 rpm bir shaker 15dk için tel/boru montaj aktarın.
Not: Shaker 1.5 mm bir yörünge vardır. - Tel/boru montaj bir santrifüje yerleştirin ve 300 x g 10 dk de sıralayacağız.
- Tel tüpü çıkarması, kapağı kapatın ve tekrar vasıl 300 x g 10 min için tüp santrifüj kapasitesi.
Not: Kablo 1 x PBS 2-6 ° c dekolmanı verimlilik/onay tel üzerinde kalan hücreleri için değerlendirmek için Hücre sayımı için karanlıkta depolanabilir. - Hücre süspansiyon hacmini azaltmak için 100 µL (Embriyolardan) dışındaki tüm ve süpernatant, alternatif olarak 300 µL (cytocentrifugation ve sonraki lazer mikrodiseksiyon) kaldırıp hemen tek hücreli örnekleme için devam.
5. tek hücreli örnekleme
- Embriyolardan
Not: Tek hücre hücre lizis ana mix WGA izin 2 µL için eklenir. İşleme, pipetting ve yer hücre lizis ana karışımı buz nedeniyle kaybı için ilave birimleri hesaplamak için hücre sayısına göre ana karışımı hazırlayın.- Hücre lizis ana mix (WGA seti, malzemeler tablo ve Kimyasallarıbileşenleri) Czyż ve ark18tarafından özetlenen protokolüne göre hazırlayın. Kısaca, reaksiyon arabellek, octylphenoxypolyethoxyethanol (% 10 luk çözelti) 1.3 µL, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) 1.3 µL 2.0 µL karışımı elde etmek için su fenil-polietilen glikol (% 10 luk çözelti), İndinavir K çözüm 2.6 µL ve 12.8 µL RNase/Dnaz-Alerjik bir 10 örnekleri (Toplam hacim 20 µL) için ana karışımı.
Not: daha fazla örnekler için buna göre birimler artırın. Hücre lizis ana mix bileşimi lazer mikrodiseksiyon örnekleri (bkz: 5.2.) kullanan alternatif yordamda kullanılan bir farklılık gösterir. - Hücre süspansiyon yerinde tutan bir çizmek için bir yağ kalem kullanın. Hücre yoğunluğu çok yüksek ise alan ve hacim ayarlamak (i.e. cam slayt üzerinde daha büyük bir alanı işaretlemek, 1 x PBS ve bir aliquot hücre süspansiyon yük).
- (4.8. adımda elde.) tüm lekeli hücre süspansiyon cam slayt üzerine pipette.
- Cam slayt bir micromanipulator ile donatılmış bir mikroskop aktarın. Hücreleri (şekil 2B ve 2 H) 5 min için yerleşmek izin.
- 0,2 mL PCR tüpleri hücre lizis master 2,0 µL ile yüklenen (bkz. Adım 5.1.1.) mix ve buz üzerinde depolamak hazırlayın.
- 1 x PBS micromanipulator kullanarak 1 µL Tek Kişilik hücrelerde toplamak ve hücreleri hücre lizis ana karışımı içeren bir tüpün içine aktarın.
Not: Micromanipulated hücreleri hücre lizis ara belleğe aktarılması için kılcal doğrudan lizis çözüm 2 µL yerleştirin ve kabarcıklar görülebilir kadar dışarı atmak. - Kısaca spin aşağı 2000 x g 3 için de örnek s tüm sıvı tüp alt toplamak için bir masaüstü microfuge kullanarak. Örnekleri Buza koyun.
- Doğrudan tek hücreli WGA için devam (bkz: 6. ve Czyż vd. 19).
- Hücre lizis ana mix (WGA seti, malzemeler tablo ve Kimyasallarıbileşenleri) Czyż ve ark18tarafından özetlenen protokolüne göre hazırlayın. Kısaca, reaksiyon arabellek, octylphenoxypolyethoxyethanol (% 10 luk çözelti) 1.3 µL, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) 1.3 µL 2.0 µL karışımı elde etmek için su fenil-polietilen glikol (% 10 luk çözelti), İndinavir K çözüm 2.6 µL ve 12.8 µL RNase/Dnaz-Alerjik bir 10 örnekleri (Toplam hacim 20 µL) için ana karışımı.
- Mikrodiseksiyon lazer (alternatif tek hücreli örnekleme yöntemi: 5.1. Embriyolardan)
Not: Bu bölümde kullanılan ana mix kompozisyon bölümünde 5.1 Embriyolardan için kullanılan bir farklılık gösterir. Tek hücre hücre lizis ana mix (WGA seti, malzemeler tablo ve Kimyasallarıbileşenleri) 4,5 µL-ecek var olmak mülhak için WGA.- Czyż ve ark. göre hücre lizis ana karışımı hazırlayın reaksiyon arabellek, octylphenoxypolyethoxyethanol (% 10 luk çözelti) 1.3 µL, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) 1.3 µL 5.0 µL karıştırma tarafından 19 fenil-polietilen glikol (% 10 luk çözelti), solunum, İndinavir K çözüm 2.6 µL ve RNase 34.8 µL / Dnaz ücretsiz su 10 örnekleri (Toplam hacim 45 µL) için ana bir karışım elde etmek için. Ana mix Buza koyun.
Not: daha fazla örnekler için buna göre birimler artırın. - UV-tedavi membran kaplı slaytlar lazer mikrodiseksiyon için uygun. Bu nedenle, bir DNA bağlayıcı aygıt çapraz slaytları yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika için en yüksek UV bulaşmasına neden.
- Bir cytocentrifuge ve cytospin 300 x g 5 min için de tüm hücre süspansiyon membran kaplı slayt bir araya getirin.
Not: bir sıvı sistem hücreleri cytocentrifuged çözümünde slayda nerede kullanırken süpernatant cytocentrifugation sonra çıkarın ve kuru spin 1140 x g 1 dk. için de geçerlidir. - Doğrudan mikrodiseksiyon lazer ya da bir gecede kurumasına ve örnekleri uzun süreli depolama için-20 ° C'de dondurmak cytospins izin vermek için devam edin.
- Hücre lizis ana karışımı bir 0.2 mL PCR tüp kap içine 4,5 µL pipet ve lazer mikrodiseksiyon aracılığıyla tek hücre hasat.
- PCR tüp lazer mikrodiseksiyon mikroskop--dan almak ve tüp kapatın. Kısa-spin tarafından tüm sıvı tüp alt toplamak ve örnek Buza koyun.
- Tek hücreli WGA ile devam etmek ya da daha fazla işleme önce 1 ay için izole örnekleri-80 ° C'de depolamak.
- Czyż ve ark. göre hücre lizis ana karışımı hazırlayın reaksiyon arabellek, octylphenoxypolyethoxyethanol (% 10 luk çözelti) 1.3 µL, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) 1.3 µL 5.0 µL karıştırma tarafından 19 fenil-polietilen glikol (% 10 luk çözelti), solunum, İndinavir K çözüm 2.6 µL ve RNase 34.8 µL / Dnaz ücretsiz su 10 örnekleri (Toplam hacim 45 µL) için ana bir karışım elde etmek için. Ana mix Buza koyun.
6. adaptör-bağlayıcı tüm genom amplifikasyon 18,19 dayalı
Not: tüm gerekli ana karışımları (WGA seti, malzemeler tablo ve Kimyasallarıbileşenleri) hazırlanan ve buz üzerinde kullanıma hazır saklı emin olun. Ana karışımları dahil micromanipulated DNA sindirim mix 1 (bkz: 5.1.) örnekleri (2.0 µL tepki arabelleği, Mse2.0 µL içeren ben restriksiyon enzimi ve su RNase/Dnaz-Alerjik 16.0 µL) veya 2 için lazer mikrodiseksiyon mix DNA sindirim (5.2 bkz.) örnekleri (in Mse2.5 µL içeren ben restriksiyon enzimi ve RNase/Dnaz-ücretsiz su 2.5 µL), ön tavlama ana mix (5.0 µL tepki arabelleği, preannealing PCR bağdaştırıcıdan her biri, 5.0 µL ve 15,0 µL RNase/Dnaz-ücretsiz su içeren), tüp ligasyonu mix master mix (30.0 µL önceden tavlanmış PCR bağdaştırıcıları, 10,0 µL adenozin trifosfat çözüm ve 10.0 µL T4 ligaz çözüm içeren) ve birincil PCR ana (içeren 30,0 µL PCR arabellek, 10 mM deoxynucleotide mix çözüm 20,0 µL, bir polimeraz 10.0 µL Mix ve su RNase/Dnaz-Alerjik 340.0 µL). Tüm birimleri 10 örnekleri hazırlamak için verilir. Buna göre ayarlamak için örnek sayısına.
- Hücre lizis için micromanipulated/lazer mikrodiseksiyon örnekleri bir termal cycler yerleştirin ve tek hücre lizis hücre 42 ° C için 45 dk, 30 dk ve 10 dk 80 ° C 65 ° C, kuluçka tarafından çalıştırın.
Not: bir termal cycler ısıtmalı bir kapak ile kullanın. Hücre lizis O/N 10-15 h için yapılabilir. Bu durumda, 65 ° C'de kuluçka adımı atlarsanız - PCR adaptörler ön tavlama çalıştırın. Bu nedenle, bir termal cycler 65 ° c için 1 dk daha fazla 49 döngüleri, 1 dk her, ardından ön tavlama ana karışımda kuluçkaya tarafından 1 ° C sıcaklık giderek azalan ile/döngüsü. (15 ° C'de) 50 döngüsünden sonra ana mix 15 ° c kadar daha fazla kullanılmasını kuluçkaya.
Not: Bu adım asimetrik bağdaştırıcıları için tüp ligasyonu uygun oluşturmak gereklidir (bkz. Adım 6.6.) tek hücre DNA'sını tabi Mseiçin ben kısıtlama Özet. - Hücre lizis sonra spin lysed örnekleri 2000 x g 3 için de aşağı s tüm sıvı alt toplamak ve Buza koyun.
- DNA parçası için her lysed micromanipulated örnek için DNA sindirim Mix 1 2 µL ekleyebilir veya DNA sindirim 0.5 µL 2 lazer mikrodiseksiyon örnek olarak mix ve kısıtlama Özet çalıştırın. Termal cycler 37 ° C'de ısıtılmış bir kapak ile 5 dk 65 ° C 5 min için bir restriksiyon enzimi inactivation adımdan ardından kullanın.
Not: Sindirim 37 ° C'de 3 h için uzatılabilir. Bu örnekleri Embriyolardan elde edilen ve lazer mikrodiseksiyon elde edilen örnekler arasında farklı tek iletişim kuralı adımdır. - Spin aşağı tüm sıvı alt toplamak ve Buza koyun örnekleri.
- Tüp ligasyonu ustanın 5.0 µL Ekle Kısıtlama sindirilmiş DNA ve önceden tavlanmış bağdaştırıcıları, birleştirilmesi (ligasyon) için sindirilir her DNA örneği mix ve 1 h için 15 ° c termal cycler içinde ligate.
Not: Bu adım 12 h için uzatılabilir veya O/N. gerçekleştirilen - Spin aşağı tüm sıvı alt toplamak ve Buza koyun örnekleri.
- WGA için birincil PCR ana Mix 40.0 µL her tüp ligasyonu ürünler ekleyin ve termal cycler aşağıdaki gibidir: ilk olarak ısıtmalı bir kapak ile WGA çalıştırmak, örnekleri için 3 dk. 68 ° C'de kuluçkaya. İkinci olarak, geçiş yapmak için 15 kez 94 ° C'de 40 s, 30 57 ° C s ve 68 ° C için 1 dk 30 s + 1 s/döngüsü. O zaman 40 94 ° C'de 9 döngüleri eklemek s, 57 ° C + 1 ° C/döngüsü için 30 s, 1 dk 45 s + 1 s/döngüsü için 68 ° C. Bundan sonra geçiş yapmak için 23 kere 94 ° C'de 40 s, 65 ° C 30 s, 1 dk. 53 s + 1 s/döngüsü için 68 ° C. Son olarak, bir son uzantısı 68 ° C'de 3 dk 40 sn için gerçekleştirmek ve örnekleri ile 4 ° c soğuk
- Spin aşağı tüm sıvı alt toplamak ve DNA kalite kontrol ya da örnekleri-20 ° C veya-80 ° C uzun süreli depolama için saklamak için örnekler.
7. kalite kontrol WGA ürünleri
Not: bir 4plex QC-PCR 5çalıştırdıktan sonra DNA yayma ve amplifikasyon ürün sayısı aralığına göre WGA ürün kalitesini kontrol edin. WGA aliquots ve ilgili QC-PCR örnekleri %1.0 özel jel değerlendirme için çalıştırın.
- 4plex kalite kontrol PCR (Tablo 1) için kullanılan tüm astar 100 µM hisse senedi çözümleri hazırlayın. Her astar 8 µL PCR-grade su 200 µL astar havuzu oluşturmak için 136.0 µL için ekleyin. Girdap 3 için çözüm s, 2000 x g depolama-20 ° C'de 3 s ve aliquot 20 µL için de aşağı spin
- Kullanım standart PCR Kitleri çok katmanlı bir PCR ana hazırla 2 x PCR bileşenleri (astar) hariç, 4,5 µL PCR-grade su ve astar havuzun 0.5 µL içeren 6.0 µL karıştırın.
- WGA ürünlerin 1.0 µL eklemek, aşağı spin ve çalışma PCR 2 min için 94 ° C'de 35 94 ° C'de denatürasyon devredir 1 dakika, 56 ° C için 1 dk ve astar uzantısı 72 ° c için 1 dk 30 sn ve son uzantısı adım tavlama astar ardından 7 dk. 72 ° C'de 4 ° C-sakin ol, aşağı spin ve örnekleri buz jel analiz aynı gün veya daha sonraki analizler için-20 ° C'de yerleştirin.
Not: termal cycler soğutma 12 ° C Peltier öğeleri uzun ömürlü artırmak için gerçekleştirilebilir. - (6.8 elde edilen.) WGA ürünler ve ilgili 4plex QC-PCR ürünleri özel jel5analiz.
Representative Results
Hücreleri CFSE ve nükleik boyama sonra DAPI ve FITC için filtre ile donatılmış bir ayirt mikroskop kullanarak değerlendirilebilir. Hücrelerin sitoplazma göstermek ise tek tip CFSE ile heterojen arası hücre yoğunluğu (şekil 2A ve 2E) ile etiketleme DAPI kanaldaki parlak bir counterstain ile çekirdekleri mevcut. Benzer şekil ve yoğunluklarda boyama tel (şekil 2B ve 2F) bağlı hücreler beklenen yanı sıra tel müstakil ve bir slayt (şekil 2B ve 2 H) kurtarıldı.
Yüksek hücre yoğunluğu (örneğin > 1 000 000 hücre/mL) Tel hücreleri ile toplam kapsama teller şarj ederken neden olabilir. Ancak, hücre yoğunluğu düşük, dönme hızı kuluçka sırasında değişiklikler ve farklı hücre hatları kullanımı yalıtım verimliliği etkileyen ve ayrı olarak test edilmesi gerekir. Ne zaman teller inkübe ile 5 mL 100 000, HT-29 hücrelerinin hücre / mL olarak açıklanan bölüm 2.1., 254 ± 103 hücrelerin ortalaması (n = 5) kabloları ele geçirildi. İle aynı deneme LNCaP hücreleri, 440 ± 319 hücrelerin ortalaması kullanarak (n = 5) Tel elde edildi.
5 mL periferik kan teller (göre Protokolü Bölüm 2.2.) için de bir arka plan 500, 5 000 ve 50 000 HT-29 hücrelerinde sunma sonuçlandı 75 ± 18 hücreleri, 25 ± 9 hücreleri ve 47 ± 57 hücre yakalama (n = 3, her), anılan sıraya göre. Tel ile hücre süspansiyon (1 000 000 hücre/mL) bölümünde 2.3 protokolüne göre 15 µL suçlanıyor., en fazla 1.000 kişi (HT-29) bir tel hücreleri ekleyebilirsiniz.
Hücre dekolmanı verimliliği HT-29 hücrelerdeki % 81'i arasında değişiyordu (aralığı %54.9 - %93.2 ve n = 5) için % 81'i (63.51-92.87 Aralık % %, n = 6) ve % 91 (84.7-95.3 Aralık % %, n = 6) içinde LNCaP ve VCaP hücreleri, sırasıyla. Benzer şekilde, kurtarma müstakil hücre hücre satır aralarını farklıdır: Müstakil HT-29 hücrelerinin % 28 ortalaması cytocentrifugation tarafından kurtarıldı. Kurtarma oranı için LNCaP %10 düşük iken VCaP hücrelerin ortalama iyileşme oranı % 55.
Tek hücre yaklaşık % 75'i tabi WGA verim yüksek kaliteli WGA ürünler için: Bu 1) smear WGA ürünleri > 1 kb (4 rakam, üst panel) ve 2) üç 0.1 değişen ya da dört şeritli 4plex kalite kontrol PCR (şekil 4, alt paneli) . WGA ürünler için 1) dizi-yeniden güçlendirme WGA 7' den sonra kalite ölçütlerine tek hücreli dizi-CGH profilleri 6,7 ile 2) hedeflenen NGS için profil oluşturma CGH kullanılabilir.
Şekil 1: iş akışı yalıtma ve hedef hücreleri tek hücre analizi için kurtarma. (A) % 90'ı confluency için hücreler kültürlü ve (B) bir tek hücre süspansiyon elde etmek için hasat. Functionalized tel CFSE ve nükleik leke, (C) ile boyama sonra hücre hacmi 5 mL tepki borular kullanarak veya bir Pasteur pipet ucu kullanarak düşük ses huzurunda inkübe. İkinci uygulanması hücre süspansiyon birimleri için en düşük 15 µL. şarj sonra içinde 4 h ayrılmış (D) hücreleri gerekir sağlar. Bu nedenle, tel ile yayın tampon dolu bir 1,5 mL tepki tüp yerleştirilir. Sonra 15 dk kuluçka bir rocker ve 10 dk aralıklarla tel kaldırılır ve hücre süspansiyon hücreleri cips için centrifuged. (E) kurtarılan hücreleri ya bir cam slayt tek hücreli Embriyolardan (üst) veya cytocentrifuged membran kaplı bir slayda aktarılır ve mikrodiseksiyon (alt) lazer iletilir. (F) son olarak, tüm genom amplifikasyon (WGA) aracılığıyla hasat tek hücreleri güçlendirilmiş. WGA ürünleri dizi-CGH ve hedeflenen NGS aşağı akım analizi ile uyumludur. EpCAM epitope: hücre yüzeyinde yeşil daire. Functionalized Tel: aygıt, gri üçlü sarmallı teller. Polimer: Mor çizgiler. Anti-EpCAM antikorlar: Turuncu. Yayın arabellek etkinlik: kırmızı ok. Hücre süspansiyon tutmak için yağ marker: koyu mavi elips. Kurtarılan hücre süspansiyon: açık mavi. Embriyolardan için kılcal: siyah çizgi. Büyütme: hasat Embriyolardan tarafından kurtarılan hücre membran kaplı üzerinde cytospin içeren kurtarılan hücreleri (gri dolu elips) kaydırın. Büyütme: microdissected lazer kurtarılan hücre olmak (gri dairesel çizgi: omurga için lazer mikrodiseksiyon olarak hizmet veren membran slayttan membran), lazer ışını (mavi çizgi membran slayt aşağıdan yaklaşıyor) ile nesnel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: etiketli hücreleri görselleştirme. (A, E) Şarj hücreleri: hücreler ile CFSE etiketli ve boya CFSE aralığı (yeşil) sinyal şiddeti gösterilen enterkalasyon bir DNA ile counterstained. (B,F) Etiketli hücreleri tel üzerinde ele geçirdi. (C,G) Hücre-dekolmanı işlemden sonra tel. (D,H) Hücreleri tel ilişkisi kesildi ve cytocentrifugation bir slayda tarafından kurtarıldı. CFSE: FITC kanal (yeşil). DNA leke: DAPI kanal (mavi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: tel ve depolama yuvası. (A) bölmeleri tel. (B) detay functionalized bölümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kalite kontrol WGA ürünlerin elde edilen tek micromanipulated hücrelerden. Üst panel: tek hücrelerinden elde edilen WGA ürünler genellikle DNA sonucu smear 0.2 kb > 1.0 kb ile 0.5 kb civarında en yüksek yoğunlukta ile arasında değişen. Smear örnekleri sayı 1, 7 ve 13 (yıldız ile belirtilir) suboptimal göstermek ya da DNA yok. Alt paneli: WGA ürünlerdir, yeterli kalitesini 4plex PCR üç veya dört dört PCR ürünlerinin belirtiyorsa (100, 200, 300 ve 400 bp). Örnekleri 1, 7, 10 ve 13 den az üç grup göstermek ve daha fazla analiz dışlanacak. Lane M 100 bp merdivenle içerir ve yıldız yetersiz WGA ürün kalitesi örnekleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Astar sıra | NOT |
| 5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ' | 100 bp ileri astar |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 ' | 100 bp ters astar |
| 5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 ' | 200 bp ileri astar |
| 5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 ' | 200 bp ters astar |
| 5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 ' | 300 bp ileri astar |
| 5 '-tcc Yasası aac cag tca gcg tc-3 ' | 300 bp ters astar |
| 5 '-aca gtc kedi gcc atc hareket gc-3 ' | 400 bp ileri astar |
| 5 '-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 ' | 400 bp ters astar |
Tablo 1: Astar dizileri 4plex kalite kontrol PCR
Discussion
Açıklanan Protokolü (aygıtı olarak adlandırılır) bir functionalized tel ex vivo tek hücreli genom analizi için hücreleri almak amaçlamaktadır. Biz üç EpCAM pozitif hücre hatları (HT-29, LNCaP ve VCaP) test, ama prensip olarak, bu yöntem EpCAM ifade herhangi bir hücre kültürünü uygulanabilir. EpCAM pozitif hedef hücreler için aygıtı saf hücre süspansiyon olarak sunulan (2.1 bkz.) veya karma bir fazlalık arka plan hücre içine (e.g. periferik kan, 2.2 bkz.). Özellikle ikinci yalıtım kapasiteleri nadir hücre koşullar altında test etmek için kullanılabilir, ancak, kabloya bağlı hücre sayısı ince ayar yapılabilir açıklanan düşük hacimli kullanarak yaklaşım (2.3 bkz.). Hücre hatları arasındaki farklar beklenen gibi Tel, rotasyon şarj etmek için uygun hücre yoğunluğu kuluçka süresi bir ayirt mikroskop kullanarak bağlı hücre sayısı değerlendirerek ampirik olarak test edilmesi gerektiği de hız.
Tek hücre düzeyinde WGA genomik aşağı akım uygulamaları için gereklidir. WGA yönteminin seçimi labs arasında farklı olabilir ve prensip olarak, bizim yöntem Embriyolardan veya lazer mikrodiseksiyon elde edilen örnekler işleyebileceğinden daha bütün yöntemler açıktır. Bu protokol için bir ısı-parçalanma temel WGA7kıyasla daha iyi bir performans nedeniyle enzimatik parçalanmış DNA esas alarak bir yöntemini kullanın. İsteğe bağlı, tek hücre izotermal WGA için sonraki DNA20,21profil oluşturma izin iletilebilir.
Açıklanan protokol functionalized teller yeni nesil genomik tek hücre analizi için bağlı sonra sağlam hücreleri kurtarma amaçlamaktadır. Aynı zamanda yalnızca CE onaylı vivo içinde zenginleştirme cihazlar piyasada defa temsil, functionalized teller ilk nesil metastas kanserli hastalarda CTCs numaralandırmak için kullanılmıştır. Önceki yayın ve kendi veri geçerli altın standart teknoloji2ile karşılaştırıldığında daha duyarlı olması için in vivo yalıtım tekniği öneririz. Böylece, belgili tanımlık aygıt içinde fark gibi bu vivo içinde yalıtım teknik bir kurtarma özelliği ile donatılması karakterizasyonu tek hücre düzeyinde yüksek CTC kurtarma birleştirme sağlar.
Ancak, aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez, böylece, klinik veri mevcut değildir. Ex vivo uygulamalar (Yani CTCs periferik kan örnekleme sonra izole) teknoloji boşuna (olasılığını artırma ile kübital boşuna, örneğin düşük çap mevcut ayarları adapte olduğu gibi tavsiye edilmez CTCs ve alıcı antikor arasındaki temas doğrudan) ve uzun tutma zamanı (30 dk, kan için 2-3 tel geçmek L izin). Ancak, Seviyelendirilmiş içinde bölüm olarak 2.2. hedef hücreleri de karma örnekleri7' den ayrılmış olabilir.
Bir geçerli yöntem sabitlenmemiş hücrelerin verimsiz kurtarma dekolmanı teller üzerinden sonra kısıtlamasıdır. Bu, ancak, dekolmanı tedavi öncesinde bir hücre fiksasyon adım tarafından geliştirilmiş.
Özet olarak, bu iletişim kuralı genetik olarak karakterize tek hücre için hücre kurtarma bir vivo içinde yalıtım tekniği kombine kullanımı ilk adımdır. Daha fazla çaba hücre kurtarma ve izin kendi uygulamasında hasta1,2için en iyi duruma getirme adresi gerekir. Ancak, tedavi izleme ve tedavi kararları için kişiselleştirilmiş tıp CTCs numaralandırma olduğunu. Böylece, bu yöntem genomik CTC karakterizasyonu tek hücre düzeyinde doğru bir ilk adımdır.
Sağlam hücre hasat gibi tek hücreli transcriptome analiz doğru uygulamalar mümkün gibi görünüyor. Ancak, bu kurtarma yordamı RNA bütünlüğü (doğrudan lizis RT-qPCR22tarafından takip kurtarılan tek hücrelere iletmeörneğin ) etkiler olup olmadığını tespit edilebilir kalır. Eğer başarılı olursa, tek hücreleri (örneğin CTCs) karakterizasyonu daha detaylı analizler izin transcriptome seviyeye kaymıştır. Bu konuda, RNA-seq akıllı-seq2 kullanarak değerli bir araç (RNA-seq Kütüphane hazırlık sırasında elde edilen) preamplified cDNA kantitatif PCR için tabi olarak kadar RNA tek hücreleri aşağı akım analizi için sağlar. Bu bir kombine hedef ve tarama tabanlı analiz tek kurtarılan hücreleri22,23sağlayacaktır.
Geçerli functionalized teller CTCs24pozitif seçim için yaygın olarak kullanılan bir epitel belirtecidir anti-EpCAM antikorlar temel alır. Birkaç CTCs cytokeratins veya EpCAM25gibi tümleyici epitel işaretleri kadar antikor gibi HER2/yeni ekleme CTC yalıtım şansını artırmak. Birkaç antikor stratejiler geliştirdi ve Ferreira ve arktarafından gözden zenginleştirme dayalı. 2016 yılında26. Bir tel üzerinde immobilize antikorlar karışımı daha yüksek bir sayı yalıtım ve ek alt türlerinden CTCs önde gelen teknoloji gelecekte bir gelişme olabilir.
Bu çözümde işlevselliğini korumak için su altında tel fonksiyonel tutmam için işleme tel içeren tüm adımları için zorunludur. Tel 1 x PBS değerlendirme sırasında (mikroskop; yerleştirmek için tavsiye e.g. 3.1 adımlar. -3.3.) ve depolama. Uygunsuz boyama önlemek için taze kullanılarak hazırlanan boyama çözüm adımları 1.2.1 öneririz. ve 1.2.2. Zayıf lekeli hücreleri cep tel üzerinde sayma engel ve ekli hücreleri küçümseme için yol açabilir.
Pasteur pipet kauçuk kapaklı tel Pasteur pipet sonraki yükleme hücre süspansiyon (Adım 2.3.4.) eklerken takmayı önlemek gereklidir. Kauçuk kapak böylece fonksiyonel bölümü Pasteur pipet ucu içinde yer alan Tel tutmak için kullanılır. Kap için Pasteur pipet arka çok sıkıca bağlıysa, hücre süspansiyon yüklenmesini mümkün değildir. Bu durumda, öyle ki dolu hücre süspansiyon tarafından zorla göç ettirilmiş havada pipet bırakabilirsiniz kap kolaylaştırmak.
Tel bükme yönünü sırasında adımları 3.2 sayma hücre için çok önemlidir. ve 3,3. Öyle ki bir yana yatmak tel işlevsel olmayan sonu geliyor yapışkan bant kullanarak Tel bağlayın. Fonksiyonel Bölümü'nün tüm uzunluğu taramadan sonra diğer yarısı fonksiyonel tel taranabilir böylece tel 180 ° döndürülür. Bu adım hücreleri tel üzerinde değerlendirmek İlk deneyler için önemlidir. Hücreleri belirli bir hücre kültürünü ve yordam için değerlendirilir sonra yordamı Hücre sayımı olmadan tekrar edilebilir (örn. sadece hücrelerin varlığı için kontrol veya bu adım atlama). Dikkatli pipetting süpernatant adım 4,8 hacmi azaltarak hücre kaybı önlemek çok önemlidir. Sorunsuz turbulences Pelet için neden olmadan yapılır pipetting emin olun.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada Avusturyalı Bilim Fonu (FWF tarafından), proje no finanse edildi. Ben 1220-B19 içinde translasyonel kanser araştırma (TRANSCAN) "Circulating tümör hücreleri biyomarker prostat kanseri (CTC-tarama) Minimal rezidüel hastalığı olarak" ERANET projenin parçası olarak (PS için). Doktora adayı S.C. doktora programı moleküler tıp tıbbi Graz Üniversitesi çerçevesinde eğitim gördü. Yazarlar uzman teknik yardım minnetle Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz ve Johanna Schiller kabul edersiniz. Yazarlar Georg Peinhaupt grafik tasarım destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
