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Immunology and Infection

मानव गर्भनाल रक्त व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं से Megakaryocyte विभेद और प्लेटलेट गठन

Published: December 27, 2017 doi: 10.3791/56420
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

Summary

megakaryocytes की एक अत्यंत शुद्ध जनसंख्या गर्भनाल रक्त व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । CD34+ कक्ष अलगाव और megakaryocyte विभेद के लिए एक विधि यहां बताई गई है ।

Abstract

प्लेटलेट उत्पादन thrombopoiesis के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में अस्थि मज्जा में मुख्य रूप से होता है । thrombopoiesis के दौरान, टेम जनक कोशिकाओं megakaryocytes बुलाया प्लेटलेट पुरोगामी, जो टर्मिनल लंबे cytoplasmic प्रक्रियाओं से प्लेटलेट्स जारी करने के लिए अंतर करने के लिए अलग प्लेटलेट्स कहा जाता है । Megakaryocytes दुर्लभ अस्थि मज्जा तक ही सीमित कोशिकाओं रहे है और इसलिए प्रयोगशाला उपयोग के लिए पर्याप्त संख्या में फसल के लिए मुश्किल है । मानव megakaryocytes के कुशल उत्पादन के लिए उपयुक्त परिस्थितियों के तहत संवर्धन CD34+ कोशिकाओं द्वारा इन विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त के नमूनों से छंटाई चुंबकीय कोशिका द्वारा CD34+ कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है । सीरम मुक्त शर्तों के तहत अत्यधिक शुद्ध, परिपक्व megakaryocytes उत्पादन के लिए आवश्यक कदम बताए गए हैं । megakaryocyte विभेदन और प्लेटलेट के निर्माण के निर्धारण और प्लेटलेट उत्पादन के phenotypic विश्लेषण के विवरण भी प्रदान की जाती हैं । एंटी प्लेटलेट एंटीबॉडी या thrombopoietin mimetics के रूप में megakaryocyte विभेद और/या प्लेटलेट गठन, प्रभाव है कि प्रभाव, जैविक समारोह की जांच करने के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है ।

Introduction

प्राथमिक मानव megakaryocytes (एमके) नियमित रूप से प्रयोगशाला के उपयोग के लिए पर्याप्त संख्या का अलगाव अस्थि मज्जा है, जहां वे nucleated कोशिकाओं के ~ ०.०१% के लिए खाते में उनके कम आवृत्ति के कारण व्यवहार्य नहीं है1। एक सुविधाजनक विकल्प है पूर्व vivo विस्तार और विशिष्ट विकास कारकों की उपस्थिति में टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के भेदभाव । स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ, सी-किट ligand) और interleukin (il)-3 और आईएल-11 सहित साइटोकिंस की एक संख्या संस्कृति प्रणालियों में नियोजित किया गया है MKs उत्पादन । Thrombopoietin (टीपीओ) megakaryocytic संस्कृतियों के लिए सबसे प्रभावी विकास और भेदभाव कारक है और अकेले या अन्य साइटोकिंस, जैसे एससीएफ और IL-32के साथ प्रभावी है । टीपीओ स्टेम सेल आबादी पर कार्य करने के लिए दोनों प्रसार और MKs की परिपक्वता में परिणाम कर सकते है2।

एमके प्लेटलेट्स बुलाया cytoplasmic दखलंदाजी से प्लेटलेट्स का उत्पादन और, vivo में, लगभग 1 x 1011 प्लेटलेट्स १५० के प्लेटलेट काउंट्स को बनाए रखने के लिए दैनिक गठन कर रहे हैं-४०० x 109/L. प्लेटलेट उत्पादन इन विट्रो में १००० करने के लिए है - vivo में अनुमान3की तुलना में कम गुना, और इस विट्रो मेंएमके और प्लेटलेट उत्पादन में सुधार करने के लिए CD34+ टेम जनक कोशिकाओं का उपयोग कर कई संस्कृति की स्थिति को जन्म दिया है. CD34+ एमके भेदभाव के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं के प्रारंभिक स्रोत मानव परिधीय रक्त4था । अंय सेल सूत्रों की अस्थि मज्जा5,6शामिल हैं, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं/प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (ESC/iPSC)7, और गर्भनाल रक्त (यूसीबी)8,9,10 . मानव अस्थि मज्जा CD34+ 11 और माउस वंश नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं5 उत्पादन एमके और प्लेटलेट्स इन विट्रो में; फिर भी, मानव अस्थि मज्जा की उपलब्धता की कमी CD34+ कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में इसके उपयोग की सीमा. इसके विपरीत, ESC और iPSC इन विट्रो प्लेटलेट उत्पादन के लिए कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन कोशिकाओं से प्लेटलेट उत्पादन murine OP9 कोशिकाओं और लंबे समय तक संस्कृति अवधि के रूप में फीडर कोशिकाओं की आवश्यकता है । फीडर में ली गई प्लेटलेट्स-मुक्त स्थितियां कम कार्यात्मक12दिखाई देती हैं । iPSC-व्युत्पन्न प्लेटलेट्स नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग के होने की संभावना है क्योंकि वे एक बड़े पैमाने पर विस्तारित किया जा सकता है । इस प्रक्रिया में प्रतिलेखन कारकों और दीर्घकालिक सेल संस्कृति13के lentiviral-मध्यस्थता transduction की आवश्यकता है ।

यूसीबी CD34+ कोशिकाओं है कि आसानी से अनुसंधान सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सुलभ स्रोत है । अकेले टीपीओ गर्भनाल रक्त-व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने और इस सीरम पूरकता या सह फीडर कोशिकाओं के साथ संस्कृति के लिए आवश्यकता के बिना अत्यधिक शुद्ध, परिपक्व MKs को जंम देता है । अंय साइटोकिंस जैसे एससीएफ यूसीबी CD34+ कोशिकाओं से भेदभाव को कम कर सकते हैं, जबकि Flt-3 ligand और आईएल-11 अपरिपक्व megakaryocytes14के उत्पादन को बढ़ावा देते हैं । इस प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त CD34+ सीरम मुक्त स्थितियों में कोशिकाओं से अत्यधिक शुद्ध एमके संस्कृतियों के उत्पादन का वर्णन ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल दक्षिण पूर्वी सिडनी मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित और ंयू साउथ वेल्स ' मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदन किया गया । गर्भनाल रक्त स्वस्थ दाताओं से प्राप्त सिडनी गर्भनाल रक्त बैंक (सिडनी, एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) द्वारा प्रदान की गई थी । इस कार्यविधि के लिए लगभग १०० मिलीलीटर के खंड का उपयोग किया गया ।

नोट: रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं । ७०% इथेनॉल के साथ गर्भनाल रक्त बैग के बाहरी प्रदूषित । इस प्रक्रिया के लिए बाँझ उपकरणों (कैंची, चिमटी) का प्रयोग करें ।

1. गर्भनाल रक्त कोशिका तैयारी और CD34 के अलगाव+ कोशिकाओं

  1. तैयार बाँझ जुदाई बफर (SB) फास्फेट के साथ (पंजाबियों) खारा, पीएच ७.२ पर, और ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और 2 मिमी EDTA युक्त.
  2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में SB के 10 मिलीलीटर बांटना (रक्त की 10 मिलीलीटर प्रति एक ट्यूब की आवश्यकता है) । एक G18 कुंद सुई का उपयोग कर एक 10 मिलीलीटर सिरिंज पर घुड़सवार, बैग से खून की 10 मिलीलीटर आकर्षित और ५० मिलीलीटर SB की 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में बांटना ।
  3. लिम्फोसाइट जुदाई मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) पतला रक्त युक्त ट्यूब के नीचे करने के लिए, दो परतों का निर्माण.
    नोट: मीडिया अलग परतों मिश्रण से बचने के लिए ट्यूब के तल पर धीरे से बांटना.
  4. १,२०० × जी पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक (आरटी) कोई तोड़ नहीं और कोई त्वरण के साथ ।
  5. mononuclear कोशिकाओं युक्त ट्यूब के केंद्र के पास परत हस्तांतरण (प्रत्येक ट्यूब से लगभग 5-10 मिलीलीटर) एक नया ५० मिलीलीटर एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर ट्यूब में । ५० मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए SB जोड़ें ।
  6. supernatant पर 10 मिनट के लिए ४०० × जी में केंद्रापसारक ।
  7. सेल छर्रों ध्यान से एक पाश्चर पिपेट के साथ reसस्पेंड sb की 5-10 मिलीलीटर में । निलंबित कोशिकाओं का मिश्रण है और sb के साथ ५० मिलीलीटर के लिए मात्रा लाने के लिए ।
  8. Trypan नीले दाग और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ( सामग्री की तालिकादेखें). नमूना में CD34+ कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, SB के १०० µ एल में २.५ × 105 कोशिकाओं को पुनः निलंबित और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए विरोधी CD34-पीई एंटीबॉडी के 10 µ एल जोड़कर दाग । प्रवाह cytometry (चित्र 1a) द्वारा विश्लेषण ।
  9. ४०० × जी में 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant छोड़ें ।
    नोट: यदि आवश्यक नहीं तुरंत, mononuclear कोशिकाओं को इस स्तर पर जमे हुए किया जा सकता है ।
  10. 108 कोशिकाओं प्रति SB के ३०० µ एल में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित । FcR मानव आईजीजी के १०० µ एल जोड़ें (एजेंट अवरुद्ध, सामग्री की तालिकादेखें) और 108 कोशिकाओं के प्रति CD34 चुंबकीय मोतियों की १०० µ एल । धीरे मिश्रण और 30-40 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    नोट: एक एकल कक्ष निलंबन की आवश्यकता है (यदि आवश्यक हो, हालांकि एक 30 µm फ़िल्टर एजेंट जोड़ने से पहले पास कक्षों) । 108 कक्षों या उससे कम के लिए यहां वर्णित रिएजेंट वॉल्यूंस का उपयोग करें । 10 से अधिक8 कोशिकाओं के लिए, एजेंट (SB, ब्लॉकिंग समाधान, और CD34 चुंबकीय मोतियों) तदनुसार स्केल ।
  11. एक चुंबकीय धारक में एलएस कॉलम रखकर और SB के 3 मिलीलीटर के साथ धोने से गर्मी की अवधि के दौरान रास जुदाई कॉलम तैयार करें । प्रवाह को त्यागें ।
    नोट: LS जुदाई कॉलम अप करने के लिए 2 × 108 कुल कोशिकाओं के साथ लोड किया जा सकता है । छोटे और बड़े स्तंभ उपलब्ध हैं ।
  12. सेल मिश्रण करने के लिए SB की 5-10 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  13. एसबी की १.५ मिलीलीटर में कक्षों को पुनः निलंबित करें और LS स्तंभ पर कक्ष निलंबन (१.५ mL) लोड करे । 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब (ऋणात्मक अंश #1) में अनलेबल्ड कक्षों वाले प्रवाह को एकत्रित करें । तरल नाली चलो और SB के १.५ मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लो ।
  14. एकत्र प्रवाह के माध्यम से (3 मिलीलीटर) वापस कॉलम में लोड और प्रवाह के माध्यम से एक ही 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में इकट्ठा (नकारात्मक अंश #1) । LS स्तंभ 3 बार SB की 3 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो नकारात्मक अंश (12 एमएल) में कक्षों को एंटी-CD34 एंटीबॉडी के साथ LS स्तंभ द्वारा CD34+ कक्षों के कैप्चर का पता लगाने के लिए दाग लगाया जा सकता है ।
  15. चुंबकीय विभाजक से कॉलम निकालें और धीरे एक सिरिंज के साथ एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब में सवार के साथ फ्लश कोशिकाओं SB के 2 मिलीलीटर ।
  16. स्तंभ वापस चुंबकीय विभाजक पर रखें और स्तंभ में वापस कक्षों की 2 मिलीलीटर लोड करें । के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा और 2 मिलीलीटर SB के साथ धो लो । यह ऋणात्मक अंश #2 (4 मिलीलीटर) है ।
  17. चुंबकीय विभाजक से LS स्तंभ निकालें और SB. फ्लश कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर तेजी से और मजबूती से एक सिरिंज सवार के साथ CD34+ सेल अंश इकट्ठा करने के लिए जोड़ें । trypan नीले दाग और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४०० × जी में सकारात्मक अंश के साथ ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । CD34+ कोशिकाओं (SFM, सामग्री की तालिकादेखें) के लिए सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    नोट: यदि आवश्यक नहीं तुरंत, कोशिकाओं को इस स्तर पर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है ।

२. पृथक CD34+ कोशिकाओं की शुद्धता जाँच

  1. दाग 2 x 104 कोशिकाओं के साथ सकारात्मक अंश से 10 µ एल एंटी-CD34-पीई एंटीबॉडी और 20 µ एल विरोधी CD45-PerCP एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए (isotype नियंत्रण के लिए एक अलग ट्यूब का उपयोग करें) (चित्र 1b) ।
  2. धोने के लिए SB की 1 मिलीलीटर जोड़ें । SB के २०० µ एल में 10 मिनट. reसस्पेंड गोली के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक ।
  3. मलबे को बाहर करने के लिए फ्लो cytometric विश्लेषण और गेट लाइव सेल जनसंख्या प्रदर्शन (चित्र 1b) । पीई और PerCP isotype नियंत्रण (चित्र 1b) का उपयोग कर पीई और PerCP सकारात्मक आबादी के लिए गेट सेट और CD34+/CD45+ कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं ।

३. Megakaryocyte विभेद

  1. बीज 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल CD34+ कोशिकाओं SFM के 2 मिलीलीटर में ५० एनजी/एमएल संयोजक मानव thrombopoietin (rhTPO) प्रति अच्छी तरह से एक 12 में अच्छी तरह से थाली के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस, एक humidified वातावरण में 5% सह2 पर कोशिकाओं की मशीन । यदि कोशिकाओं से पहले वे विश्लेषण के लिए आवश्यक है धाराप्रवाह हैं, फसल कोशिकाओं और ताजा मीडिया और rhTPO के साथ कई कुओं में विभाजित ।
    नोट: दो या तीन कुओं विशेष रूप से अलग समय अंक पर भेदभाव की निगरानी के लिए तैयार किया जाना चाहिए (उदा., दिन 7, 9, और 10) ।
  2. कुओं से फसल की कोशिकाओं को अंय कुओं में परेशान कोशिकाओं के बिना भेदभाव की निगरानी के लिए अलग सेट ।
  3. दाग कोशिकाओं को 20 µ l anti-GPIIb/CD41-FITC एंटीबॉडी और 10 µ l anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor ६४७ एंटीबॉडी के अंतिम खंड में १०० µ l. संबंधित isotype नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग कर एक नियंत्रण ट्यूब सेट । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. धोने के लिए SB की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
10 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक छोड़ो supernatant और २०० में गोली reसस्पेंड-३०० SB के µ एल । प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण ।
  • प्रत्येक fluorophore के लिए, FITC और Alexa आटा ६४७ सकारात्मक आबादी के लिए गेटिंग सेट करने के लिए isotype नियंत्रण का विश्लेषण । CD41+/CD42a+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं है, जो परिपक्व एमके (चित्रा 1C) का प्रतिनिधित्व का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए सना हुआ सेल नमूने का विश्लेषण ।
  • सेल सतह मार्करों दाग कोशिकाओं के सूक्ष्म दृश्य के लिए ३.३ में वर्णित के रूप में ।
    1. धोने के लिए SB की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक । SB के १०० µ एल में गोली और स्पिन के लिए १,००० x g पर एक ग्लास स्लाइड पर 5 मिनट के लिए स्थगित । स्लाइड पर फिक्स कोशिकाओं के लिए मेथनॉल में डूबा द्वारा 30 एस हवा सूखी, बढ़ते DAPI युक्त मीडिया के 20 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) , एक coverslip के साथ कवर, और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 2a) का उपयोग कर कल्पना ।
  • intracellular एंटीजन के दृश्य के लिए, पंजाब में कोशिकाओं reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए paraformaldehyde (1% अंतिम एकाग्रता) के साथ तय । कोशिकाओं को permeabilize करने के लिए, ट्राइटन-x १०० (०.१%) और 15 min. reवॉश सेल के लिए 2 मिलीलीटर पंजाबियों/0.1% ट्राइटन-x १०० के साथ जोड़ें । पंजाब के १०० µ एल में reसस्पैंड/0.1% ट्राइटन-X १००, विरोधी vWf और विरोधी CD62p एंटीबॉडी जोड़ें (1:200 कमजोर पड़ने) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    1. 2 मिलीलीटर पंजाबियों/0.1% ट्राइटन-X १०० के साथ धो और 10 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक, एक ही बफर के १०० µ एल में reसस्पेंड, और विरोधी माउस आईजीजी-alexa ५९४ और विरोधी खरगोश आईजीजी-alexa ४८८ (1:100) जोड़ें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन, 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ धो/0.1% ट्राइटन-X १००, एक ही बफर के १०० µ एल में reसस्पेंड, और विरोधी CD42b के 20 µ एल जोड़ने-APC । फिर चरण 3.6.1 में वर्णित के रूप में कांच स्लाइड पर कोशिकाओं स्पिन और कदम 3.6.1 में वर्णित के रूप में सूक्ष्म दृश्य के लिए नमूने तैयार करते हैं ।
  • ploidy निर्धारण के लिए, 12 दिनों में फसल कोशिकाओं या भेदभाव के 13 । धोने के लिए SB की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक और दाग 20 µ l विरोधी GPIIb/CD41-FITC एंटीबॉडी के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०० µ एल मशीन के एक अंतिम मात्रा में ।
    1. SB के 1 मिलीलीटर और hypotonic साइट्रेट बफर (१.२५ mm सोडियम साइट्रेट, २.५ mm सोडियम क्लोराइड, ३.५ mm डेक्सट्रोज) 20 µ जी/एमएल propidium आयोडाइड और ०.०५% ट्राइटन-X १०० युक्त के µ एल में गोली reसस्पेंड के साथ एक बार धो लो । 4 ° c प्रकाश से सुरक्षित पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    2. प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20 µ g/एमएल और मशीन के अंतिम एकाग्रता के लिए RNase जोड़ें । CD41-FITC+ जनसंख्या (चित्रा 2c) की ३०,००० से ५०,००० की घटनाओं को एकत्रित करके प्रवाह cytometry द्वारा propidium आयोडाइड की तीव्रता निर्धारित करना.

    • 4. प्लेटलेट काउंटिंग, प्लेटलेट गणन, और प्लेटलेट सक्रियण

    1. हार्वेस्ट सेल (३.१ कदम से) 8 दिनों में या 1 पर भेदभाव और बीज के 9 × 104 कोशिकाओं में ४८-अच्छी तरह से २०० में प्लेटों ताजा SFM के साथ पूरक के ५० एनजी/एमएल rhTPO । ३७ ° c, 5% CO 2 पर 5 दिनों के लिए संस्कृति।
      नोट: quantitation प्रयोजनों के लिए, तपसिल में बीज कुओं । यह कम घनत्व दृश्य और प्लेटलेट असर मनोज की गिनती के लिए आवश्यक है । आमतौर पर प्लेटलेट्स संस्कृति के 2 दिनों के बाद प्रदर्शित होने लगते हैं । पीक 4 और 5 दिनों के बीच है ।
    2. 10x या 20X उद्देश्यों का उपयोग कर एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप पर पूरी तरह से में प्लेटलेट असर मनोज की संख्या गिनती.
      नोट: एक गरम (३७ ° c) माइक्रोस्कोप चरण बेहतर है, विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को रखने के बाद से प्लेटलेट एक्सटेंशन के संकोच का कारण बनता है । मनोज के शरीर से लंबे समय तक एक्सटेंशन के रूप में प्लेटलेट्स मनाया जाता है । प्रत्येक मनोज में कई प्लेटलेट की दखलंदाजी हो सकती है । जैसे-जैसे प्लेटलेट्स का विकास होता है, मनोज का शरीर आकार में कम हो जाता है ।
    3. फसल कोशिकाओं और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४०० x g पर केंद्रापसारक । ३.३ और ३.४ चरणों में वर्णित के रूप में 20 µ एल विरोधी मानव CD41-FITC एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग । प्लेटलेट के प्रतिशत की गणना-असर एमके (pbMK): pbMK (%) = [(प्लेटलेट-असर MKs/well)/(कुल CD41+ कक्ष/well)] x १००
    4. संस्कृति माध्यम में जारी प्लेटलेट्स गिनती करने के लिए, धीरे से एक पाश्चर पिपेट के साथ कोशिकाओं को मिश्रण और 14 या संस्कृति के 15 दिनों में १०० µ एल इकट्ठा ।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए 20 µ एल एंटी-ह्यूमन CD41-FITC एंटीबॉडी के साथ दाग । संबंधित isotype नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग कर एक नियंत्रण ट्यूब सेट करें ।
      2. जोड़ें १५० µ SB के एल और ५० गिनती मोतियों की µ एल ।
      3. फ्लो cytometric विश्लेषण के लिए, FSC और एसएससी लॉग स्केल करने के लिए सेट करें । प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा से CD41-FITC के दाग से सामान्य मानव रक्त प्लेटलेट्स का उपयोग करें जैसा कि खंड निमा में वर्णित गेटिंग के लिए (चित्रा 3/
      4. प्रवाह cytometry द्वारा गिनती मोतियों के साथ दाग प्लेटलेट्स का विश्लेषण । FSC बनाम एसएससी तितर बितर भूखंड (चित्रा 3ए) का उपयोग कर गिनती मोतियों की १,००० घटनाओं को इकट्ठा । सूत्र का उपयोग करके CD41-FITC पॉजिटिव इवेंट (चित्र) के आधार पर प्लेटलेट्स की संख्या की गणना करें:
        प्लेटलेट्स प्रति µ एल = [(CD41 की संख्या-FITC सकारात्मक घटनाओं)/1000 मोती)] x [(मोतियों की संख्या ५० µ एल में)/sample मात्रा)]
    5. प्लेटलेट सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए, धीरे से एक पाश्चर पिपेट के साथ कोशिकाओं को मिश्रण और 14 या संस्कृति के 15 दिनों में १०० µ एल इकट्ठा । Tyrode के बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें (१३७ mM NaCl, २.७ मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, १.८ मिमी CaCl2, ०.२ मिमी ना2HPO4, 12 मिमी NaHCO3, ५.५ मिमी डी-ग्लूकोज, पीएच ६.५) और गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए २०० एक्स जी पर केंद्रापसारक ।
      1. supernatant लीजिए और प्लेटलेट के आकार के कणों के लिए 10 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
      2. supernatant छोड़ें और Tyrode के बफ़र के १०० µ l में पुनर्निलंबित करें । PAC1 के 20 µ एल जोड़ें-FITC एंटीबॉडी और adenosine diphosphate (ADP) 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 µ m. के लिए गर्मी की एक अंतिम एकाग्रता के प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण करने के लिए FITC सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं । एक सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 3सी) के रूप में एक ही तरीके से इलाज ताजा मानव प्लेटलेट्स का उपयोग करें ।

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    Representative Results

    इस प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त-व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं से अत्यधिक शुद्ध एमके संस्कृतियों की तैयारी की अनुमति देता है । गर्भनाल रक्त में CD34+ कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग १.३%15 (आंकड़ा 1a) और mononuclear कोशिकाओं की कुल संख्या (चरण १.८) से पर्वतमाला ९०-३०० x 106 प्रति यूसीबी इकाई है । ९० से ९९% (चित्रा 1b) के अलगाव पर्वतमाला के बाद CD34 +/CD45 + कोशिकाओं की शुद्धता । एमके (CD41+ कोशिकाओं के रूप में परिभाषित) सीरम मुक्त CD34+ सेल संस्कृतियों में rhTPO की उपस्थिति में जल्दी मनाया जाता है । 7 दिन पर, परिपक्व एमके का प्रतिशत (CD41+ और CD42a+ कोशिकाओं) आमतौर पर 30-40%(चित्रा 1C) है । CD41 के उच्चतम स्तर+ और CD42a+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं (९०-९९%) 10 और 12 विभेदक (चित्रा 1C) के बीच मनाया जाता है । परिवर्तनशीलता मनाया मुख्य रूप से गर्भनाल रक्त स्रोत पर और CD34 की शुद्धता पर निर्भर करता है+/CD45+ १.१७ चरण में अलग कोशिकाओं । दिन पर परिपक्व मनोज की उपज 10 5-10 प्रति इनपुटCD34 + सेल से पर्वतमाला । परिपक्व एमके (CD41+/CD42b+) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया आंकड़ा 2aमें दिखाया गया है । कल्चरल एमके बड़े, आमतौर पर multinucleated कक्ष (चित्र 2a, ऐरोहेड) के रूप में दिखाई देते हैं । एमके दानेदार सामग्री vWf (हरी) और CD62p (पी-selectin, लाल) धुंधला (चित्रा बीएम) द्वारा निर्धारित किया गया था । कल्चरल MKs में मनाया ploidy वितरण चित्र 2cमें दिखाया गया है ।

    प्लेटलेट्स लंबे, मनके फाइबर या रेशा है कि मनोज शरीर से विस्तार कर रहे हैं । प्लेटलेट्स कई सौ micrometers लंबे16 हो सकते हैं और इसमें शाखाएं और विवृत्त क्षेत्र होते हैं । एक विशेषता प्लेटलेट असर मनोज चित्रा 2dमें सचित्र है । प्लेटलेट-असर एमके (pbMK) का प्रतिशत १.३ ± ०.१७% था ।

    प्लेटलेट्स का विश्लेषण और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में गिना जा सकता है । के रूप में चित्र बीमें दिखाया गया है, कोशिका संस्कृति में सबसे प्लेटलेट्स परिधीय रक्त प्लेटलेट्स के विश्लेषणात्मक गेट के भीतर गिर supernatant और प्लेटलेट मार्कर CD41 (चित्र बी) के लिए सकारात्मक हैं. इस विधि से प्लेटलेट्स की उपज 19 से ४२ प्लेटलेट्स प्रति एमके होती है । संस्कृति में उत्पादित प्लेटलेट्स को प्लेटलेट एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय किया जा सकता है जैसे कि ADP द्वारा निर्धारित सक्रियण-विशिष्ट PAC1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (चित्र 3सी) .

    Figure 1
    चित्रा 1: CD34+ सेल अलगाव और संस्कृति में एमके भेदभाव के cytometry भूखंड प्रवाह । (एक) Mononuclear कोशिकाओं (बाएँ पैनल में दिखाया गया है के रूप में gated) मानव गर्भनाल रक्त (चरण १.८) से शुद्ध विरोधी CD34-पीई एंटीबॉडी के नमूने में CD34+ कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए दाग थे (१.३%, सही पैनल). (ख) पृथक्करण के बाद, सकारात्मक अंश (चरण १.१७) को एंटी-CD34-पे और एंटी-CD45 PerCP एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया. समृद्ध CD34+ जनसंख्या चित्रा में संकेत दिया है (९८.१%, सही पैनल, ऊपरी सही वृत्त का चक्र). (ग) CD34 + कोशिकाओं से 7 दिनों या 11 दिनों के लिए इन विट्रो में एमके विभेदित Phenotypic विश्लेषण विरोधी CD41 और विरोधी CD42a एंटीबॉडी के साथ दाग थे । परिपक्व मनोज दोनों CD41+ और CD42a+ (ऊपरी सही वृत्त का चक्र) के लिए सकारात्मक हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: एमके धुंधला, ploidy और इन विट्रो मेंप्लेटलेट गठन । (एक) दिन 11 एमके के फ्लोरोसेंट छवियां विरोधी CD41-पीई और CD42b-APC एंटीबॉडी के साथ दाग । नाभिक DAPI से सना थे । पीली ऐरोहेड मल्टी न्यूक्लियर MKs को इंगित करती है । स्केल बार, 30 µm (ख) दिन की फ्लोरोसेंट छवियां 14 एमके विरोधी vWf (हरा), विरोधी CD62p (लाल) और विरोधी CD42b-APC (रानी) एंटीबॉडी के साथ दाग । नाभिक DAPI से सना थे । स्केल बार, 15 µm (ग) प्रतिनिधि गेटिंग CD41+ घटनाओं के ploidy वितरण दिखा रणनीति । ग्राफ (कम पैनल) ploidy वर्गों के मनाया वितरण से पता चलता है (n = 4), त्रुटि सलाखों, एसडी. (घ) प्लेटलेट-असर एमके की विशेषता आकृति विज्ञान दिखाया गया है । मनोज के शरीर में तीर का संकेत है । मनोज (प्लेटलेट्स) से फैली लंबी cytoplasmic प्रक्रियाओं को ऐरोहेड द्वारा दर्शाया गया है । यह कुछ क्षेत्रों में अस्पष्ट हो सकता है/एक या दो एमके इन प्लेटलेट एक्सटेंशन का निर्माण कर रहे हैं या नहीं । यह एक प्लेटलेट असर मनोज के रूप में गिना जाना चाहिए । एक औंधा माइक्रोस्कोप, 10x उद्देश्य के साथ लिया छवियों । स्केल बार, ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्रा 3: इन विट्रो और प्लेटलेट सक्रियण में उत्पादित प्लेटलेट्स की बहुतायत । (क) प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा से मानव प्लेटलेट्स आगे और साइड स्कैटर (बाएँ पैनल) के लिए लॉग स्केल का उपयोग विश्लेषणात्मक गेट सेट करने के लिए इस्तेमाल किया गया. सही पैनल एमके संस्कृतियों से कोशिकाओं को दर्शाता है । इन विट्रो में उत्पादित प्लेटलेट्स मानव प्लेटलेट्स के लिए परिभाषित विश्लेषणात्मक गेट में मनाया जाता है । कक्ष और गिनती मोतियों की संख्या में संकेत कर रहे हैं । Plt, प्लेटलेट्स (बी) प्लेटलेट्स इन विट्रो में उत्पादित एंटी-CD41 एंटीबॉडी के साथ दाग थे । प्लेटलेट से मानव प्लेटलेट्स अमीर प्लाज्मा आगे और साइड स्कैटर के लिए लॉग स्केल का उपयोग कर विश्लेषणात्मक फाटक सेट करने के लिए और CD41-FITC गेट के भीतर प्रोफ़ाइल की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । c-FITC, FITC isotype नियंत्रण (c) प्लेटलेट सक्रियण निंन उपचार के लिए ADP द्वारा 20 µ एम के अंतिम एकाग्रता प्लेटलेट से युक्त प्लाज्मा मानव प्लेटलेट्स नियंत्रण (ऊपरी पैनलों) के रूप में इस्तेमाल किया गया । संस्कृति में उत्पादित प्लेटलेट्स निचले पैनलों में दिखाए जाते हैं । PAC1 एंटीबॉडी के बंधन प्लेटलेट सक्रियण इंगित करता है । सी-FITC, FITC isotype नियंत्रण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    यहां वर्णित प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त से संस्कृति में मनोज और प्लेटलेट्स के लगातार उत्पादन के लिए उपयुक्त है । इन कोशिकाओं को एमके प्रसार, भेदभाव, प्लेटलेट गठन, और प्लेटलेट उत्पादन पर दवाओं या जैविक गतिविधियों के प्रभाव के रूप में विभिन्न प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    साहित्य में विभिन्न प्रकार के कल्चरल मीडिया और cytokine युग्म प्रस्तुत किए गए हैं । स्टेम सेल फैक्टर, Flt-3 ligand, आईएल-3, और आईएल-6 जैसे साइटोकिंस के अलावा CD34+ सेल प्रसार का समर्थन करता है । हालांकि, इस विस्तार संस्कृति14में कम एमके शुद्धता में परिणाम है । यहां प्रस्तुत विधि, सीरम मुक्त मीडिया और अकेले rhTPO का उपयोग कर, जनक कोशिकाओं के महत्वपूर्ण विस्तार की अनुमति नहीं है, लेकिन unilineage megakaryocytic प्रसार और अंतर और एमके के लगातार उत्पादन परमिट (९०-९९% CD41+ CD42a+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं अंय वंश से संक्रमण के बिना) । एमके गठन के लिए संस्कृति अवधि stromal या फीडर कोशिकाओं के समर्थन के लिए आवश्यकता के बिना 10 से 12 दिनों के लिए है । यह अंय तरीकों कि बड़ा संस्कृति अवधि (20 दिन)17,18की आवश्यकता के साथ अनुकूल तुलना करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल से प्लेटलेट यील्ड 19-42 प्लेटलेट्स प्रति एमके या ४२० प्लेटलेट्स प्रति इनपुटCD34 + सेल है । अधिकांश प्रोटोकॉल कम प्लेटलेट पैदावार18,19में परिणाम ।

    हालांकि उपज उच्च अन्य तरीकों के सापेक्ष है, CD34 कोशिकाओं के बड़े स्रोतों चिकित्सकीय उपयोग के लिए प्लेटलेट्स की पर्याप्त संख्या का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हैं । गर्भनाल रक्त एमके एक कम दर पर परिपक्व, आम तौर पर (कम ploidy वर्गों के) छोटे हैं, और प्लेटलेट उत्पादन क्षमता20कम है । फिर भी, ताजा यूसीबी आम तौर पर एक और अधिक सुलभ संसाधन है और यह शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है । चिकित्सकीय उद्देश्य के साथ एमके और प्लेटलेट्स की अधिक पैदावार का उत्पादन कर सकते हैं कि अन्य तरीकों को भी13,17बताया गया है.

    वहां परिवर्तनशीलता के कुछ स्रोतों पर विचार कर रहे हैं: एक) गर्भनाल रक्त इकाई की गुणवत्ता । केवल गर्भनाल रक्त 24 एच के भीतर एकत्र CD34+ कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । गर्भनाल रक्त के थक्के युक्त इकाइयों को भी छोड़ दिया जाना चाहिए । B) mononuclear कक्ष भिंन में CD34+ कक्षों का प्रतिशत (चरण १.८): ०.३% से कम CD34+ कक्षों के साथ mononuclear कक्ष अंशों का उपयोग करना अपेक्षाकृत कम शुद्धता CD34+ कक्षों की कम पैदावार में परिणाम दे सकता है । एमके विभेद के लिए इन कोशिकाओं की सिफारिश नहीं कर रहे हैं । यह केवल गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा तरल नाली जाने के लिए आवश्यक है (उदा., चरण १.१३, १.१४, १.१६) । कॉलम रुकावट के मामले में, यह चुंबक से कॉलम हटाने की सिफारिश की है, एक नई ट्यूब में सिरिंज सवार के साथ धीरे से कोशिकाओं को धक्का, और एक नया equilibrated स्तंभ पर पुनः लोड ।

    शर्तों के एक नंबर प्लेटलेट संख्या और समारोह को प्रभावित । थ्रोम्बोसाइटोपेनिया प्लेटलेट संख्या में एक चिह्नित गिरावट को संदर्भित करता है कि बाहरी और आंतरिक रक्तस्राव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रतिरक्षा थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (आईटीपी) और दवा प्रेरित थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (DITP) के रूप में ऑटो प्रतिरक्षा शर्तों थ्रोम्बोसाइटोपेनिया21,22के कारण अच्छी तरह से जाना जाता है । इस तरह के प्रणालीगत एक प्रकार वृक्ष और रुमेटी गठिया के रूप में अंय प्रतिरक्षा रोग भी प्लेटलेट्स पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है । थ्रोम्बोसाइटोपेनिया के गैर प्रतिरक्षा कारणों कैंसर के उपचार, गंभीर आघात, संक्रमण, अस्थि मज्जा विफलता, और शल्य चिकित्सा शामिल हैं । कीमोथेरेपी के दौर से गुजर या स्टेम सेल प्रत्यारोपण प्राप्त रोगियों द्वारा प्लेटलेट्स के उच्च उपयोग के कारण, प्लेटलेट चढ़ाए तेजी से पिछले दशकों में वृद्धि हुई है । एमके और प्लेटलेट अनुसंधान निस्संदेह नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर प्लेटलेट उत्पादन के विकास में सहायता करेगा । कार्यात्मक प्लेटलेट्स का उत्पादन किया इन विट्रो की उपलब्धता प्लेटलेट की कमी को रोकने और दुर्दम्य रोगियों में प्लेटलेट चढ़ाए अनुमति देते हैं । एमके भेदभाव और इन विट्रो में प्लेटलेट उत्पादन अध्ययन और दोनों रोग स्थितियों और शारीरिक तंत्र है कि प्लेटलेट के गठन के लिए नेतृत्व की समझ के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    लेखक ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान १०१२४०९ BHC से जुड़े) के समर्थन को स्वीकार करते हैं ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cell Culture Reagents
    Recombinant Human TPO Miltenyi Biotec 130-094-013
    StemSpan SFEM II Stem Cell Technologies 9605 Serum-free media for CD34+ cells
    Name Company Catalog Number Comments
    CD34 Isolation Reagents
    CD34 MicroBead kit ultrapure Miltenyi Biotec 130-100-453 This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).
    Lymphoprep Alere Technologies 1114545 Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)
    Sterile separation buffer (SB) Miltenyi Biotec 130-091-221 This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.
    Name Company Catalog Number Comments
    Flow Cytometry and Cell Staining Reagents
    PE Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences 340669 Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.
    PerCP mouse anti-human CD45 BD Biosciences 347464 1:10 dilution
    PerCP isotype control BD Biosciences 349044 1:10 dilution
    FITC Mouse anti-Human CD41a BD Biosciences 340929 Final antibody concentration 1:5 dilution.
    APC Mouse anti-Human CD42b BD Biosciences 551061 This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.
    Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a AbD Serotec MCA1227A647T Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.
    Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control AbD Serotec MCA928A647 Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody
    Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal Abcam AB6994 1:200 dilution
    V450 mouse anti-humna CD41a BD Biosciences 58425 1: 20 dilution
    V450 isotype control BD Biosciences 580373 1:20 dilution
    PAC1-FITC antibody BD Biosciences 340507 1:10 dilution
    Anti CD62p mouse monoclonal Abcam AB6632 1:200 dilution
    Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG Invitrogen A11008 1:100 dilution
    Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG Invitrogen A11020 1:100 dilution
    Ig Isotype Control cocktail-C BD Biosciences 558659 Isotype control antibody
    Propidium iodide Sigma Aldrich P4864
    CountBright Absolute Counting Beads Molecular Probes, Invitrogen C36950 Counting beads
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials
    LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Smaller and larger columns are also commercially available
    MidiMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-302
    MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
    Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile In Vitro technologies 352063
    Glass slides Menzel-Glaser J3800AMNZ
    Mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Inverted microscope Leica DMIRB inverted microscope
    Fluorescent microscope Zeiss Vert.A1
    Cell analyser BD Biosciences FACS Canto II
    Cytospin centrifuge ThermoScientific Cytospin 4
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Cell analyser software BD Biosciences FACS Diva Software
    Single cell analysis software Tree Star FlowJo
    Fluorescent microscope software Zeiss Zen 2 blue edition

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    References

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    इम्यूनोलॉजी अंक १३० प्लेटलेट प्लेटलेट megakaryocyte CD34 गर्भनाल रक्त thrombopoietin इन विट्रो विभेद
    मानव गर्भनाल रक्त व्युत्पंन CD34<sup>+</sup> कोशिकाओं से Megakaryocyte विभेद और प्लेटलेट गठन
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    Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H.… More

    Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. J. Vis. Exp. (130), e56420, doi:10.3791/56420 (2017).

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