Summary
매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.
Abstract
혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작+ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다+ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.
Introduction
일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포1의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-32등 효과적 이다. TPO 확산 MKs2의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.
Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 1011 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 109/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는 vivo에서 견적3, 그리고이 에겐 CD34를 사용 하 여 여러 문화 조건 보다 낮은+ MK와 혈소판 생산에서 체 외에서개선 하기 위해 조 혈 조상 세포. CD34의 초기 소스+ 세포 MK 차별화 사용 했다 인간 주변 혈액4. 다른 셀 소스 등이 골5,6, 배아 줄기 세포/유도 만능 줄기 세포 (ESC/iPSC)7, 탯 줄 혈액 (UCB)8,9,10 . 인간의 골 CD34+ 11 와 마우스 리니지 부정적인 골 수 세포5 생산 MK와 혈소판 시험관; 인간의 골의 가용성의 부족 CD34의 근원으로 그것의 사용을 제한 하는 그럼에도 불구 하 고,+ 세포. 대조적으로, ESC, iPSC 생체 외에서 혈소판 생산을 위한 세포의 무제한 소스를 나타냅니다. 이 세포에서 혈소판 생산 murine OP9 셀 등 오랜 문화 피더 세포를 필요합니다. 급지대 무료 조건에서 파생 된 혈소판 기능 덜12나타납니다. iPSC 파생 혈소판 때문에 그들은 큰 규모로 확장 될 수 있다 임상 설정에 사용 될 가능성이 있다. 이 프로세스에서는 녹음 방송 요인과 장기 세포 문화13lentiviral 중재 변환 합니다.
UCB는 CD34의 액세스할 수 있는 소스+ 세포에 쉽게 사용할 수 있는 설정 연구. TPO 혼자 코드의 차별화를 홍보할 수 있는 혈액 유래 CD34+ 세포와이 생겨나게 혈 청 보충 또는 급지대 셀과 공동 문화에 대 한 필요 없이 매우 순수 하 고, 성숙한 MKs. 다른 cytokines SCF UCB CD34에서 차별화를 저하 될 수 있습니다와 같은+ 세포, Flt 3 ligand 그리고 IL-11 미 숙 없으며14의 생산을 촉진 하는 동안. 이 프로토콜에 설명 합니다 매우 순수한 MK 문화 코드 혈액 CD34에서에서+ 의 생산 세럼 무료 조건에서 세포.
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Protocol
이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.
참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.
1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의+ 세포
- 살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.
- (혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.
- 두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프 구 분리 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 합니다.
참고: 다른 레이어를 혼합 하지 마십시오 튜브의 하단에 천천히 미디어 분배. - 휴식 및 가속 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1200 × g에서 튜브를 원심.
- 단 세포 (각 관에서 약 5-10 mL) 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 들어 있는 튜브의 중앙 레이어를 전송 합니다. SB 각 관 50 mL의 총 볼륨을 추가 합니다.
- 실시간 삭제에서 10 분 동안 400 × g에서 원심은 상쾌한.
- Resuspend 셀 펠 릿 하고있다 결합의 5-10 mL에 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 정지 세포와 볼륨 50 mL SB와 함께.
- 수 셀 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 또는 자동 세포 카운터 ( 재료의 표참조). CD34의 비율을 확인 하려면+ 세포 샘플, resuspend 2.5 × 105 셀 SB와 얼룩의 100 µ L에 4 ° c.에 15-30 분에 대 한 안티-CD34-PE 항 체의 10 µ L을 추가 하 여 Cytometry (그림 1A) 분석.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리기 튜브 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 단 세포가이 단계에서 동결 수 있습니다. - 108 셀 당 SB의 300 µ L 셀 resuspend FcR 인간 IgG의 100 µ L를 추가 (차단 시 약, 재료의 표참조) 및 100 µ L 108 셀 당 CD34 자석 구슬의. 부드럽게 혼합 하 고 30-40 분 동안 4 ° C에서 품 어.
참고: 단일 셀 서 스 펜 션은 필수 (필요한 경우 통과 셀 30 µ m 필터 시 약을 추가 하기 전에). 또는 그이 하 108 셀에 대 한 여기에 설명 된 시 볼륨을 사용 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 시 약 (SB, 솔루션, 그리고 CD34 자석 구슬 차단)를 따라 확장할. - LS 분리 열 인큐베이션 기간 동안 준비 하 여 마그네틱 홀더에서 LS 열을 배치 하 고 유출 하고있다 삭제의 3 mL로 세척.
참고: LS 분리 열 최대 2 × 108 총 셀으로 로드할 수 있습니다. 작고 큰 열 사용할 수 있습니다. - 5-10 mL SB의 셀 혼합물에 추가 하 고 400 × g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
- Resuspend 1.5 ml SB의 세포 및 세포 현 탁 액 (1.5 mL) LS 열에 로드 합니다. 레이블이 없는 셀 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)에 포함 된을 통해 흐름을 수집 합니다. 액체 드레인과 1.5 mL SB의 열을 씻어 보자.
- (3 mL)를 통해 수집 된 흐름 열에 다시 로드 하 고 동일한 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)을 통해 흐름을 수집. 3 번 3 mL SB와 LS 열 세척.
참고: 필요한 경우 셀 부정적인 분수 (12 mL)에 얼룩이 질 수 있다 안티 CD34 항 체 확인 CD34의 캡처로+ LS 열에 의해 세포. - 마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 2 mL SB의 새로운 15 mL 튜브에 주사기 플런저를 천천히 세포를 플러시.
- 다시 열에 자석 분리기 및 로드 셀의 2 mL에 다시 열을 놓습니다. 통해 흐름을 수집 하 고 2 mL SB로 씻어. 이것은 부정적인 분수 #2 (4 mL) 이다.
- 자석 분리기에서 LS 열을 제거 하 고는 CD34 수집 주사기 플런저와 꾸준히 고 단단히 하고있다 플러시 세포의 2 개 mL를 추가+ 셀 분수. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 400 × g에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 폐기는 상쾌한. CD34에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀 resuspend+ 셀 (SFM, 재료의 표참조).
참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 셀 수 있는 동결 액체 질소에이 단계에서.
2. 순도 확인 격리 된 CD34의+ 세포
- 10 µ L 안티-CD34-PE 항 체와 20 µ L 안티-CD45-PerCP 항 체 4 ° C (사용 별도 튜브 isotype 컨트롤)에서 15 분에 대 한 긍정적인 분수에서 2 × 104 셀을 얼룩 (그림 1B).
- 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 SB의 200 µ L 펠 릿 Resuspend.
- 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 파편 (그림 1B)을 제외 하도록 라이브 셀 인구 게이트. PE 및 PerCP isotype 컨트롤 (그림 1B)를 사용 하 여 PE 및 PerCP 긍정적인 인구에 대 한 게이트를 설정 하 고 CD34의 비율 결정+/CD45+ 세포.
3. megakaryocyte 차별화
- 씨앗 5 × 105 셀/mL CD34+ 12-잘 접시에 잘 당 50 ng/mL 재조합 인간 thrombopoietin (rhTPO)와 보충 SFM의 2 mL에 세포. 37 ° C, 5% CO2 습도 분위기에서 세포를 품 어. 셀 confluent 경우 분석을 위해 필요한 전에 세포를 수확 하 고 신선한 미디어와 rhTPO 여러 우물으로 분할.
참고: 두 개 또는 3 개의 우물 특별히 다른 시간 지점 (예를 들어, 7, 9, 10 일)에서 차별화를 모니터링 하는 준비 되어야 한다. - 다른 우물에 셀을 방해 하지 않고 차별화를 모니터링을 마련해 우물에서 세포를 수확.
- 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 세포와 10 µ L 안티-GPIX/CD42a-알 렉 사 Fluor 647 항 체 100 µ L. 마지막 볼륨에서 컨트롤 설정 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 튜브. 4 ° c.에 15 30 분 동안 품 어
- 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다.
- 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 분리기 Resuspend 100에서 펠 릿 SB 1000 x g 30 s. 공기 건조, 메탄올에 담그고 여 슬라이드에서 5 분 수정 셀에 유리 슬라이드에 스핀의 µ L 추가 20 µ L DAPI 포함 된 미디어를 탑재 ( 재료의 표참조) 는 coverslip로 커버 하 고 형광 현미경 (그림 2A)를 사용 하 여 시각화.
- 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 세척 하 고 10 분 동안 400 × g에서 원심, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend 하 고 반대로 마우스 IgG-알 렉 사 594-토끼 IgG-알 렉 사 488 (1: 100)을 추가. 실 온에서 30 분 동안 incubate, 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 워시, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend와 CD42b APC 안티의 20 µ L을 추가. 3.6.1 단계에서 설명한 대로 유리 슬라이드에 세포를 스핀 그리고 3.6.1 단계에서 설명한 대로 현미경 시각화에 대 한 샘플을 준비 합니다.
- SB의 1 mL와 함께 한 번 세척 하 고 당뇨 시트르산 버퍼 (1.25 m m 나트륨 구 연산 염, 염화 나트륨 2.5 m m, 3.5 m m 포도 당) 포함 20 µ g/ml propidium 요오드 화물 및 0.05%의 300 µ L에서 펠 릿 resuspend 트리톤 X 100. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
- RNase 20 µ g/mL의 최종 농도에 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 30000 50000 CD41 FITC+ 인구 (그림 2C)의 이벤트를 수집 하 여 cytometry 여 propidium 요오드 화물의 강도 결정 합니다.
4. proplatelet 계산, 혈소판 열거, 및 혈소판 활성화
- 8 또는 감 별 법 및 종자의 9 일에 1 × 104 셀/잘 50 ng/mL rhTPO와 보충 하는 신선한 SFM의 200 µ L에 48-잘 접시에서 (3.1 단계)에서 세포를 수확. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 문화 공동2.
참고: 정량 목적 3 중 웰 스 씨. 이 낮은 밀도 시각화를 위한 필요 하며 문화의 2 일 후 나타나는 시작 proplatelet-베어링의 mk. Proplatelets 일반적으로 계산 합니다. 피크 일 4와 5 사이입니다. - 10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 가벼운 현미경에 전체 잘에서 proplatelet 베어링 MK의 수를 계산 합니다.
참고: 온수 (37 ° C) 현미경 단계가 바람직합니다, 이후 proplatelet 확장의 수축 하면 오랜된 시간 동안 실내 온도에 세포를 유지. Proplatelets MK 시체에서 긴 확장으로 관찰 된다. 각 MK 여러 proplatelet 돌출 할 수 있습니다. Proplatelets 개발는 MK의 몸 크기가 감소 합니다. - 세포를 수확 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심. 3.3 및 3.4 단계에 설명 된 대로 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체, 세포를 얼룩. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율을 계산: pbMK (%) = [(Proplatelet 베어링 MKs/잘) / (총 CD41+ 세포 / 잘)] x 100
- 문화 매체에 발표 하는 혈소판을 계산, 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다.
- 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체 4 ° c.에 20-30 분으로 얼룩 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 컨트롤 튜브를 설정 합니다.
- SB의 150 µ L 구슬 세 50 µ L를 추가 합니다.
- 흐름 cytometric 분석을 위해 로그 스케일 FSC 그리고 SSC를 설정 합니다. 4.4.1 게이팅 혈소판 (그림 3A)에 대 한 설정 섹션에 설명 된 대로 사용 하 여 정상적인 인간의 혈액 혈소판 혈소판이 풍부한 혈장에서 CD41 FITC와 스테인드.
- 구슬 cytometry에 의해 계산 스테인드 혈소판 분석. 구슬 SSC 점도 (그림 3A) 대 FSC를 사용 하 여 계산의 1000 이벤트를 수집 합니다. CD41 FITC 긍정적인 이벤트 (그림 3B) 수식을 사용 하 여에 따라 혈소판의 수를 계산.
µ L 당 혈소판 = [(CD41 FITC 긍정적인 이벤트의 번호)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/볼륨 샘플)]
- 혈소판 활성화를 분석 하려면 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 200 x g에서 Tyrode의 버퍼 (137 mM NaCl, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl2, 1.8 m CaCl2, 0.2 m m 나2HPO4m, 12 mM NaHCO3, 5.5 m m D-포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.
- 상쾌한 그리고 혈소판 크기의 입자를 작은 10 분 800 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.
- 상쾌한 삭제 하 고 Tyrode의 버퍼의 100 µ L에서 resuspend. 20 µ M. 최종 농도 20 µ L PAC1 FITC 항 체와 아데노신 diphosphate (ADP)의 추가 FITC 긍정적인 이벤트의 비율을 확인 하려면 cytometry로 20 분 분석에 대 한 실 온에서 품 어. 사용 신선한 인간 혈소판 긍정적인 컨트롤 (그림 3C)와 같은 방식으로 처리.
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Representative Results
이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34의 비율+ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.315 (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당6 . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의+ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다+ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41+ 및 CD42a+ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 수준의+ 및 CD42a+ 두 배 긍정적인 세포 (90 ~ 99%) 10와 차별화 (그림 1C)의 12 일 사이 관찰 됩니다. 관찰 하는 변화에 따라 달라 집니다 주로 코드 혈액 소스는 CD34의 순도+/CD45+ 세포 단계 1.17에서에서 격리. 입력된 CD34 당 5-10에서 10 일 범위에 성숙한 MK의 수확량은+ 셀. 성숙한 MK (CD41+/CD42b+) 형광에서 관찰 현미경 그림 2A에 표시 됩니다. 교양된 MK 큰, 보통 multinucleated 셀 (그림 2A, 화살촉)로 나타납니다. MK의 세분화 된 콘텐츠는 vWf (녹색) 및 CD62p (p selectin, 빨간색) 얼룩 (그림 2B)에 의해 결정 되었다. 교양된 MKs에서 관찰 ploidy 분포는 그림 2C에 표시 됩니다.
Proplatelets는 길고, 파란색 섬유 또는 필 라 멘 트 MK 시체에서 확장 하는. Proplatelets 몇 백 마이크로미터 긴16 고 지점과 팽창된 지역 포함. Proplatelet 베어링 MK 특성은 2D 그림에에서 나와 있습니다. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율 1.3 ± 0.17% 이었다.
혈소판 분석 하 고 프로토콜에 설명 된 대로 계산 될 수 있습니다. 그림 3B에서 같이, 대부분 혈소판 표면에 뜨는 세포 배양에서의 주변 혈액 혈소판 혈소판 마커 CD41에 대 한 긍정적인 (그림 3B) 분석 게이트 내에서을. 19에서 문화에서 생산 mk. 혈소판 당 42 혈소판이 메서드 범위에서 혈소판 항복 ADP 활성화 관련 PAC1 단일 클론 항 체 (그림 3C)의 증가 된 바인딩에 의해 결정 등 혈소판 촉진제에 의해 활성화 될 수 있다 .
그림 1: Flow cytometry 플롯 CD34의+ 세포 격리 및 문화에서 MK 차별화. (A) 단 세포 (왼쪽된 패널에 표시 된 문이) 인간 탯 줄 혈액 (단계 1.8)에서 정화는 CD34의 비율을 결정 하기 위해 안티-CD34-PE 항 체로 얼룩진 했다+ 세포 샘플 (1.3%, 오른쪽 패널). (B) 분리 후 긍정적인 분수 (1.17 단계) 안티-CD34-PE 및 안티 CD45 PerCP 항 체와 스테인드 했다. 풍부한 CD34+ 인구 (98.1%, 오른쪽 패널, 상단 오른쪽 사분면) 그림에 표시 됩니다. MK의 (C) Phenotypic 분석에서 차별화 생체 외에서 CD34 + 세포에서 7 일 또는 11 일 안티-CD41 및 안티-CD42a 항 체와 얼룩 했다. 성숙한 MK는 두 CD41에 대 한 긍정적인+ 및 CD42a+ (상단 오른쪽 사분면). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: MK 얼룩, ploidy 및 생체 외에서proplatelet 형성. (A) 안티-CD41-PE와 CD42b APC 항 체로 얼룩진 하루 11 MK의 형광 이미지. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 노란색 화살표는 안티 CD62p (빨간색)와 안티-CD42b-APC (마젠타) 항 체 다 핵 MKs. 눈금 막대, 30 µ m. (B) 형광 이미지 vWf (녹색), 안티로 얼룩진 하루 14 MK의를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 눈금 막대, 15 µ m (C) 대표 제어 전략 CD41 ploidy 분포를 보여 주는+ 이벤트. 그래프 (하단 패널) ploidy 클래스의 관찰 된 분포를 보여 (n = 4), 오차 막대, sd. (D) proplatelet 베어링 MK의 특성 형태 표시 됩니다. MK 몸 화살표로 표시 됩니다. MK (proplatelets)에서 연장 긴 세포질 프로세스는 화살촉으로 표시 됩니다. 하나 또는 두 개의 MK는 이러한 proplatelet 확장을 생산 하 고 있는지 여부를 보기의 일부 지역/분야에 명확 하지 수 있습니다. 이 거꾸로 한 현미경, 10 X 목표와 함께 찍은 한 proplatelet 베어링 mk. 이미지 계산 한다. 스케일 바, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 혈소판의 생산 생체 외에서 혈소판 활성화. 혈소판이 풍부한 혈장에서 (A) 인간의 혈소판 분석 게이트 앞으로 옆 분산형 (왼쪽된 패널)에 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하는 데 사용 했다. 오른쪽 패널 MK 문화에서 셀을 표시합니다. 혈소판 생산 생체 외에서 인간 혈소판에 대 한 정의 분석 게이트에서 관찰 된다. 셀과 세 구슬 그림에 표시 됩니다. Plt, 혈소판 (B) 혈소판 생산 체 외에 안티-CD41 항 체 물 했다 혈소판이 풍부한 혈장에서 인간 혈소판 분석 게이트 측 분산형 및 앞으로 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하 고 CD41 FITC 게이트 내 프로필을 비교 사용 되었다. C-FITC FITC isotype 제어 (C) 혈소판 활성화 혈소판이 풍부한 혈장에서 20 µ M. 인간 혈소판의 최종 농도에 ADP에 의해 치료를 다음과 같은 제어 (위 패널)로 사용 되었다. 문화에서 생산 하는 혈소판은 낮은 패널에 표시 됩니다. 항 체는 혈소판 활성화를 나타냅니다 PAC1의 바인딩. C FITC, FITC isotype 컨트롤 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.
다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. + 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화14감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41+ CD42a+ 두 배 긍정적인 세포) 다른 계보에서 오염 없이. MK 형성에 대 한 문화 기간은 10 ~ 12 일 stromal 지원 또는 급지대 셀에 대 한 필요 없이입니다. 이 호의 더 큰 문화 기간 (20 일 이상)17,18필요로 하는 다른 방법으로 비교 합니다. 현재 프로토콜에서 혈소판 수확량은 19-42 혈소판 입력된 CD34 당 420 혈소판 또는 MK 당+ 셀. 낮은 혈소판에서 대부분 프로토콜 결과18,19를 생성합니다.
수확량은 다른 방법에 상대적으로 높은, CD34 셀의 큰 소스 치료 사용에 대 한 혈소판의 충분 한 숫자를 생산 하기 위해 필요 합니다. 코드 혈액 MK 낮은 속도로 성숙, 일반적으로 작은 (낮은 ploidy 클래스의) 그리고 혈소판 생산 능력20감소. 그럼에도 불구 하 고, 신선한 UCB 일반적으로 더 접근 가능한 리소스 이며이 연구원에 대 한 상당한 우위를 나타냅니다. 또한 MK 및 치료 목표와 혈소판의 높은 수율을 생산할 수 있는 다른 방법이 설명된13,17있었다.
가변성을 고려의 몇몇 근원이 있다: A)의 코드 혈액 단위 품질. 24 시간 이내 수집만 코드 혈액 CD34의 원본으로 사용 해야 합니다+ 세포. 혈전을 포함 하는 코드 혈액 단위 또한 삭제 한다. CD34의 비율 B)+ 단 셀 분수 (1.8 단계) 세포:+ 미만 0.3 %CD34 단 셀 분수를 사용 하 여 셀 발생할 수 있습니다 상대적으로 낮은 순도 CD34의 낮은 수율+ 세포. 이 세포는 MK 차별화에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것만 중력 힘에 의해 액체 드레인 수 있도록 필수적 이다 (예를 들어, 1.13, 1.14, 1.16 단계). 열 차단, 경우 자석에서 열을 제거, 새로운 튜브로 부드럽게 주사기 플런저와 함께 세포를 밀어 새로운 equilibrated 열에 다시 로드 하는 것이 좋습니다.
다양 한 조건에는 혈소판 수 그리고 기능에 영향을. 혈소판 외부 및 내부 출혈로 이어질 수 있는 혈소판 숫자에 표시 된 감소를 의미 합니다. 자동-면역 조건 면역 혈소판 (ITP) 등 약물 유발 혈소판 (DITP) 혈소판21,22의 잘 알려진 원인이 있습니다. 반성 루 푸 스, 류 마티스 관절염 등 다른 면역 질환은 혈소판에 해로운 효과 가질 수도 있습니다. 비 면역 혈소판의 원인에는 암 치료, 심한 외상, 감염, 골 수 실패, 그리고 수술 포함 됩니다. 화학 요법을 받고 또는 줄기 세포가 식을 받은 환자에서 혈소판의 높은 활용도 인해 혈소판 수혈 지난 수 십년 동안 꾸준히 증가 했다. MK와 혈소판 연구 의심할 여 지 없이 임상 응용 프로그램에 대 한 대규모 혈소판 생산의 개발에 도움이 됩니다. 체 외에서 생산 기능 혈소판의 혈소판 부족을 방지 하 고 내 화 환자에 혈소판 수혈을 허용 것 이라고. MK 차별화 및 혈소판 생산에서 체 외에 는 모두 병 적인 조건 및 혈소판 형성을 이끌어 내는 생리 적인 메커니즘의 이해와 연구에 대 한 중요 한 도구.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 (그랜트 1012409 제너 시스에 링크 된 프로젝트) 호주 보건 및 의료 연구 위원회의 지원을 인정 한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
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