Summary
来自大肠杆菌的非变性条件下用于过表达和纯化密码子优化的人顺式 -丙烯基转移酶的简单方案 大肠杆菌 ，以及酶活性测定法。该方案可以推广用于生产适合于机械研究的数量和质量的其它顺式异戊烯基转移酶蛋白质。
Abstract
丙二酰转移酶（PT）是一组通过多次缩合反应使用异戊烯基二磷酸酯（IPP）催化烯丙基二磷酸的链延长的酶。 DHDDS（脱氢二酰基二磷酸合成酶）是通过与异戊烯基二磷酸酯（IPP）的多次缩合催化法呢二磷酸（FPP，一种烯丙基二磷酸酯）催化链延长的真核长链顺式 -PT（从缩合反应形成顺式双键）。 DHDDS具有生物医学重要性，因为酶中的非保守突变（K42E）导致色素性视网膜炎 ，最终导致失明。因此，本协议是为了获得大量纯化的DHDDS而开发的，适用于机械研究。在这里，蛋白质融合的使用，优化的培养条件和密码子优化被用于允许功能活跃的人类DHDDS的过表达和纯化
Introduction
异戊二烯基转移是一组催化经由多个缩合反应1使用异戊烯二磷酸（IPP）2烯丙基二磷酸，的链延长酶。 Z型酶催化从缩合反应形成顺式双键，而E型酶催化反式双键形成3 。 顺式 -磷酸转移酶（ 顺式 -PT，Z型酶）根据其产物链长度经常分类为短链（C 15 ），中链（C 50-55 ）和长链（C 70-120 ） 4 。 DHDDS（脱氢二酰基二磷酸合成酶）是一种真核长链顺式 -PT，它通过与异戊烯基二磷酸（IPP） 1的多次缩合催化法呢基二磷酸（FPP，烯丙基二磷酸）的链延长，5，6。这导致脱氢二酰基二磷酸盐的形成，C 55-100多聚丙烯酰二磷酸酯作为焦磷酸二酰基焦磷酸酯的前体，参与N-连接蛋白糖基化的糖基载体分子1 。其中德系犹太人，在DHDDS导致常染色体隐性色素性视网膜炎7,8的错义非保守突变（K42E）。因此，本方案是为了获得适用于机械研究的纯化DHDDS而开发的。
大肠杆菌被认为是重要蛋白质表达最方便和最具成本效益的宿主，因此也是最常用的宿主。然而，当试图在大肠杆菌中异源过表达蛋白质时，应该考虑蛋白质特异性的考虑。获得正确的折叠，活动来自大肠杆菌的重组蛋白质不是由于不同蛋白质的不同特性而简单的。已经开发了许多方法来克服这些障碍。在这里，蛋白质融合的使用，优化的培养条件和密码子优化被用于允许功能活跃的人DHDDS在大肠杆菌中的过表达和纯化。值得注意的是，以前尝试过度表达酵母顺式 -PT而没有蛋白质融合，因为即使在洗涤剂12的存在下也完全不溶，因此不成功。所述方案简单，经济有效，节省时间，并允许获得适合机械研究的DHDDS制剂。鉴于不同物种中顺式 -PT的同源性，我们建议该方案也可以应用于其他真核的顺式 -PT。
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Protocol
1。克隆顺式 -PT在大肠杆菌中过表达
- 获得pET-32b表达载体，设计用于与109aa硫氧还蛋白（TRX）蛋白17融合的蛋白质序列的克隆和高水平表达，以及全长顺式 -PT的大肠杆菌密码子优化的18编码序列。
- 照顾到具有TEV蛋白酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶）切割位点（ENLYFQ / G，其中，“/”表示切割点）9，随后通过短的柔性接头（SGSGSG，以增强切割位点可访问）的顺式的上游-PT序列（ 图 1A ）。另外，添加合适的5'和3'限制性位点进行克隆。
- 克隆合成的DNA构建体导入利用标准连接技术10所述的pET-32b的载体。
2。 Overexpre人DHDDS在大肠杆菌中的表达
- 转化大肠杆菌 T7根据制造商的说明书用TRX-融合DHDDS构建体表达感受态细胞。
- 在氨苄青霉素选择条件（200 mg / L）下，按照制造商的说明在LB-琼脂上培养转化的细胞。
- 将选择的菌落接种到250mL烧瓶中的100mL LB培养基中，培养基用100mg / L氨苄青霉素，并在37℃下恒温摇动200rpm培养过夜。
- 将80mL培养物接种到两个5L烧瓶（每个烧瓶40mL）中，每个含有1.5L 2x YT培养基（16g / L胰蛋白胨，10g / L酵母提取物，5g / L NaCl），100mg / L氨苄青霉素。
- 孵育培养物在37℃，以180rpm恒定振荡直到达到OD 600nm 处 = 0.5。
- 将温度降至16℃，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导细胞。精读在相同条件下孵育16-20小时进行蛋白质表达。
- 通过离心（10,000× g ，10分钟）收获细胞。
注意：协议可以暂停在这里;细胞沉淀物应保持在-80℃直至纯化。
3。人类DHDDS的纯化
- 将细胞重悬于缓冲液A（25mM Tris-HCl，pH7.5,150mM NaCl，0.1％Triton X-100,10mMβ-巯基乙醇），1μg/ mL DNA酶I和蛋白酶抑制剂混合物中。
- 使用玻璃 - 特氟龙均质器均化细胞。
- 使用微流化器或相当于12,000 - 15,000 psi 11的电池破坏电池。
- 在4℃下以40,000xg离心细胞裂解物45分钟。回收含有可溶性级分的上清液。
- 将上清液加载到10 - 10 mL固定化钴固定化金属亲和层析（Co 2+ -IMAC） 12柱上mM咪唑，然后用缓冲液A和10mM咪唑充分洗涤以减少非特异性蛋白质结合。
- 用补充有250mM咪唑的缓冲液A洗脱过表达的蛋白质。
- 用缓冲液A平衡的53 mL制备型脱盐柱除去咪唑。
- 将6xHis标记的TEV蛋白酶（每50mg蛋白质1mg TEV蛋白酶）加入洗脱的蛋白质中以在4℃下将其6xHis标记的TRX融合蛋白去除过夜。
- 将切割的蛋白质加载到Co 2+ -IMAC柱上，用补充有5mM咪唑的缓冲液A平衡以除去切割的6x His标记的TRX融合蛋白和TEV蛋白酶。
- 收集流通并浓缩至3-4 mL，使用30 kDa分子量截留离心过滤器。
- 将浓缩的蛋白质加载到用缓冲液A平衡的superdex-200大小排阻色谱柱上，以进行最终纯化。蛋白质作为二聚体（〜76 kDa）洗脱。 通过比较洗脱曲线与色谱柱校准曲线来选择相关级分。
- 使用SDS-PAGE评估制剂的纯度。
- 确定下游实验所需的蛋白质浓度和纯化的浓缩蛋白质在液氮中的闪蒸等分试样，并储存在-80°C直到使用。
4。分析尺寸排阻色谱法（SEC）
- 为了确保蛋白质耐受冻融循环的能力，解冻冷冻蛋白质的一部分，并以21,000 x g离心10分钟以除去不溶性聚集体。收集上清液。
- 使用超高效液相色谱系统13将蛋白质加载到用25mM Tris-HCl，pH 7.5,150mM NaCl，0.02％Triton X-100,10mMβ-巯基乙醇预平衡的superdex-200分析柱上， 14 。
- 监测色氨酸荧光scance（ λex = 280nm， λem = 350nm）以检测蛋白质的洗脱洗脱曲线。确保具有有效的分子量评估校准曲线 - 这些曲线可通过 SEC色谱柱制造商获得。
5。酶动力学-与时间相关的活动15，16，17
- 为了确保纯化的蛋白质的活性，混合纯化的DHDDS的5μM的10μMFPP和50μM14 C-IPP以引发在缓冲液A中的反应用0.5mM的MgCl 2，在22 - 30℃。
注意：精确的反应条件可能随着不同于DHDDS的顺式 -PT的制备而变化。此外，DHDDS的活性也取决于温度和[Mg 2+ ]。
注意： 14 C-IPP是放射性的，应根据当地的辐射安全规定使用。 通过加入补充20mM EDTA的15μL缓冲液A（终浓度为10mM EDTA）立即骤冷反应，在0,2,4和6小时从反应中取出15μL样品。 - 加入1mL H 2 O饱和的1-丁醇并充分涡旋以提取反应产物。
注意：可以在此处停止协议，并保留样品供以后读取。 - 向样品中加入闪烁混合物，并使用闪烁计数器，定量包含14 C的丁醇相中的反应产物，以及反应混合物的放射性为15μL，代表总放射性。
- 减去从每个时间点使用0小时样本测量的背景读数，并计算使用的14 C-IPP的百分比。
- 在每个时间点计算14 C-IPP净值，计算从总共14个使用的百分比14 C-IPP合并增加。
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Representative Results
这里使用的构造和纯化过程的一般概述如图1所示。在每个纯化步骤获得的样品如图2所示。该SDS-PAGE分析显示DHDDS的逐步纯化，得到高度纯化的产物。 图3显示了纯化酶的分析SEC的结果，显示蛋白质仅被观察为同二聚体。 图4显示代表性的时间依赖性活性测定。 14 C-IPP掺入明显上升超过6小时，验证纯化酶是否功能。
图1： 人DHDDS克隆和纯化 。 （
图2： 人DHDDS的纯化 。人DHDDS亲和纯化步骤的SDS-PAGE分析。泳道1，分子量标记（kDa）;泳道2，粗提物;泳道3，Co 2+ -IMAC流通。箭头表示TRX-DHDDS融合蛋白;泳道4，Co 2+ -IMAC洗脱液;泳道5，孵育过夜后的蛋白质-TEV蛋白酶混合物;泳道6，经TEV切割后的Co 2+ -IMAC流通;泳道7，TEV切割后的Co 2+ -IMAC洗脱液;泳道8，纯化人DHDDS（标记）由箭头所示）按照尺寸排阻色谱法。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3： 纯化人DHDDS的分析SEC。如方案中所述监测色氨酸荧光。根据该柱的校准曲线，DHDDS形成同二聚体（77.4kDa）。箭头表示空隙体积。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ：Ti纯化人DHDDS的依赖于依赖的活性。 在用10μMFPP反应和50μM的14 C-IPP纯化的人DHDDS的体外活性作为底物被表示为每蛋白IPP掺入（摩尔/摩尔）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里描述的用于纯化大肠杆菌细胞中功能性人DHDDS的方案是简单和有效的，允许一旦合适的构建体可用，在3-4天内过表达和纯化蛋白质。鉴于基因组测序的突破，蛋白质纯化的这些方案具有特殊的意义，这提供了许多关于许多疾病18遗传学的信息，因此需要开发高通量方法来表征蛋白质级19的致病机制。
为了克服异源蛋白过表达和纯化中的常见缺陷，本文采取了几项措施，对成功获得可溶性和功能性蛋白质至关重要。首先，DHDDS被过度表达为TRX融合。 TRX有助于融合蛋白的折叠，增加融合蛋白的溶解性，防止包涵body形成20 。接下来，为了增加蛋白质产量，将DNA构建体密码子优化用于在大肠杆菌 21中表达。最后，为了进一步降低包涵体形成的可能性，在16℃诱导蛋白质的表达以减缓蛋白质合成速度，可能有助于蛋白质折叠22 。
考虑到不同物种中顺式 -PT的同源性，我们建议该方案可以应用于其他真核的顺式 -PT以及1 。以目前的方案为起点，给出DHDDS表达关键的一般指导方针，可以对不同顺式 -PTs的最佳表达进行修改。例如，可以尝试不同的融合配偶体（例如麦芽糖结合蛋白）或进一步优化待研究的特定蛋白质的培养条件。
<P类=“jove_content”>随着他们的生物医学和生物技术意义1， 图7， 图8，描述的协议的将来的用途，以获得大量的纯化的官能DHDDS的，与其它顺 -PT一起，从而允许它们的结构和功能表征的追求。例如，DHDDS的进一步分子研究将解决与DHDDS相关的色素性视网膜炎的机制，潜在地导致新型治疗方法的发现和开发。此外，由于原核的顺式 -PT参与细菌壁合成，这组酶潜在地形成新的抗菌剂的新靶标。事实上，真核和原核生物酶研究的彻底表征可能允许合理开发选择性原核的顺式 -PT的抗微生物药物。最后，合成天然橡胶b顺式 -PT家族的成员，这里描述的方法可能会发现未来在天然橡胶工业合成中的应用。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作由以色列科学基金会结构细胞生物学研究中心（I-CORE）（1775/12）和以色列科学基金会资助，授予1721/16和2338/16（YH）和825/14（DK ）。对“田园遗产基金会”的支持表示高度赞赏。这项工作由Ilan Edri和Michal Goldenberg完成，部分履行了特拉维夫大学萨克勒医学院的MD论文要求。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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