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Immunology and Infection

Sobreexpresión y Purificación de Humanos doi: 10.3791/56430 Published: August 3, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Un protocolo simple para la sobreexpresión y purificación de la cis- preniltransferasa humana optimizada con codones, en condiciones no desnaturalizantes, de Escherichia Coli , junto con un ensayo de actividad enzimática. Este protocolo puede generalizarse para la producción de otras proteínas de cis- preniltransferasa en cantidad y calidad adecuadas para estudios mecánicos.

Abstract

Las preniltransferasas (PT) son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación. El DHDDS (deshidrodolicil difosfato sintasa) es un cis- PT (que forma enlaces dobles cis de la reacción de condensación) eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS es de importancia biomédica, como una mutación no conservadora (K42E) en la enzima resulta en la retinitis pigmentosa , en última instancia, conduce a la ceguera. Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir grandes cantidades de DHDDS purificado, adecuado para estudios mecánicos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en cis -PT entre diferentes especies sugiere que este protocolo se puede aplicar para otros eucariotas cis- TP, así como los que participan en la síntesis de caucho natural.

Introduction

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Las preniltransferasas son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación 1 , 2 . Enzimas de tipo Z catalizan la formación de dobles enlaces cis de la reacción de condensación, mientras que las enzimas de tipo E catalizan la formación de trans doble enlace 3. Las cis- priltransferasas (enzimas cis -PT, tipo Z) se clasifican clásicamente de acuerdo con la longitud de su cadena de productos en cadenas cortas (C 15 ), de cadena media (C 50-55 ) y de cadena larga (C 70-120 ) 4 . El DHDDS (deshidrodolichil difosfato sintasa) es un cis- PT de cadena larga eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, un difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Esto da como resultado la formación de difosfato de deshidrodolicilo, difosfato de polifenilo C 55-100 que sirve como precursor para dolicilpirofosfato, la molécula portadora de glicosilo implicada en la glicosilación de proteínas ligadas al N 1 . Entre los judíos asquenazíes, una mutación no conservadora de sentido erróneo (K42E) en DHDDS da lugar a la retinitis pigmentosa autosómica recesiva 7 , 8 . Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir DHDDS purificado adecuado para estudios mecánicos.

Escherichia coli se considera el huésped más conveniente y rentable para la expresión de la proteína recombinante, y por lo tanto es también el huésped más frecuentemente utilizado. Sin embargo, cuando se intenta heterólogamente sobreexpresar proteínas en E. coli , se deben tomar consideraciones específicas de proteínas. Obtener correctamente doblado, activE las proteínas recombinantes de E. coli , no es una cuestión sencilla debido a las distintas propiedades de diferentes proteínas. Se han desarrollado numerosos enfoques para superar estos obstáculos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en E. coli . De nota, un intento previo de sobreexpresar levadura cis- TP sin fusión de proteínas no fue exitosa debido a la insolubilidad completa, incluso en presencia de detergente [ 12] . El protocolo descrito es simple, rentable, ahorrador de tiempo y permite obtener preparados de DHDDS adecuados para estudios mecánicos. Dada la homología de cis -PT entre diferentes especies, sugerimos que este protocolo se puede aplicar para otros eucarióticos cis- TP también.

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Protocol

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1. Clonación de cis- TP para sobreexpresión en E. coli

  1. Obtener el vector de expresión pET-32b, diseñado para la clonación y de alto nivel de expresión de las secuencias de proteínas fusionadas con la proteína 109aa tiorredoxina (TRX) 17, y E. coli con codones optimizados 18 secuencia de longitud completa -PT cis codificación.
  2. Tener cuidado de tener un TEV-proteasa (tabaco proteasa del virus etch) sitio de escisión (ENLYFQ / G, donde "/" indica el punto de escisión) 9 seguido por un enlazador flexible corto (SGSGSG, para mejorar sitio de escisión de accesibilidad) aguas arriba de los cis -PT ( Figura 1 A ). También, añadir sitios de restricción 5 'y 3' adecuados para la clonación.
  3. Clonar el constructo de ADN sintetizado en el vector pET-32b usando técnicas de ligadura estándar 10 .

2. SobreexpresarSsión de DHDDS humano en E. coli

  1. Transformar E. coli T7 expresa células competentes con la construcción TRD-DHDDS de fusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Plantar las células transformadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante sobre LB-agar bajo condiciones selectivas de ampicilina (200 mg / L).
  3. Inocular las colonias seleccionadas en 100 ml de medio LB en frascos de 250 ml de cultivos iniciadores con 100 mg / l de ampicilina e incubar durante la noche a 37ºC con agitación constante a 200 rpm.
  4. Inocular 80 ml del cultivo en dos matraces de 5 L (40 ml por frasco), conteniendo cada uno 1,5 L de medio YT 2x (triptona 16 g / l, extracto de levadura 10 g / l, NaCl 5 g / L) con 100 mg / L de ampicilina.
  5. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación constante a 180 rpm hasta alcanzar la DO 600 nm = 0,5.
  6. Bajar la temperatura a 16 ° C e inducir las células mediante la adición de 0,5 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). EstafaIncubar en las mismas condiciones durante 16-20 h para la expresión de proteínas.
  7. Se cosechan las células por centrifugación (10.000 x g durante 10 min).
    Nota: El protocolo se puede pausar aquí; El gránulo de células debe mantenerse a -80ºC hasta la purificación.

3. Purificación de DHDDS humano

  1. Resuspender las células en tampón A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,1%, β-mercaptoetanol 10 mM), ADNasa I 1 μg / ml y una mezcla de inhibidores de proteasa.
  2. Homogeneizar las células utilizando un homogeneizador de vidrio-Teflón.
  3. Interrumpir las células utilizando un microfluidizador o equivalente a 12.000 - 15.000 psi [ 11] .
  4. Centrifugar el lisado celular a 40.000 xg durante 45 minutos a 4 ° C. Recuperar el sobrenadante, que contiene la fracción soluble.
  5. Cargar el sobrenadante en una columna de 5 - 10 ml de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado con cobalto (Co2 + - IMAC) 12 con 10MM de imidazol, seguido de un lavado a fondo con tampón A y 10 mM de imidazol para reducir la unión de proteínas no específica.
  6. Eluir las proteínas sobreexpresadas con tampón A suplementado con imidazol 250 mM.
  7. Eliminar el imidazol usando una columna de desalinización preparativa de 53 ml equilibrada con tampón A.
  8. Añadir proteasa TEV marcada con 6xHis (1 mg de proteasa TEV por 50 mg de proteína) a las proteínas eluidas para eliminar su proteína de fusión TRX marcada con 6xHis a 4ºC durante la noche.
  9. Cargar las proteínas escindidas en una columna de Co2 + -IMAC, equilibrada con tampón A suplementado con imidazol 5 mM, para eliminar la proteína de fusión TRX 6x His marcada y la proteasa TEV.
  10. Recoger el flujo a través de y concentrar a 3 - 4 ml utilizando un 30 kDa de peso molecular de corte del filtro centrífugo.
  11. Cargar la proteína concentrada en una columna de cromatografía de exclusión de tamaños superdex-200 equilibrada con tampón A para purificación final. La proteína eluye como un dímero (~ 76 kDa).
  12. Seleccionar fracciones relevantes comparando el perfil de elución con una curva de calibración de la columna.
  13. Evaluar la pureza de la preparación usando SDS-PAGE.
  14. Determinar la concentración de proteína necesaria para la experimentación posterior y congelar por congelación alícuotas de proteínas purificadas y concentradas en nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C hasta su uso.

4. Cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC)

  1. Para asegurar la capacidad de la proteína de soportar ciclos de congelación-descongelación, descongelar una alícuota de las proteínas congeladas y centrifugar a 21.000 x g durante 10 minutos para eliminar los agregados insolubles. Recoger el sobrenadante.
  2. Cargar las proteínas en una columna analítica superdex-200 previamente equilibrada con Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,02%, β-mercaptoetanol 10 mM, utilizando un sistema de cromatografía de líquidos de ultra rendimiento 13 , 14 .
  3. Monitor triptophan fluoreScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) para detectar el perfil de elución eluente de las proteínas. Asegúrese de tener una curva de calibración válida para la evaluación del peso molecular - tales curvas están disponibles a través de los fabricantes de columnas SEC.

5. Cinética enzimática - Actividad 15 , 16 , 17 dependiente del tiempo

  1. Para asegurar la actividad de la proteína purificada, se mezcla 5 M de DHDDS purificadas con 10 FPP mu M y 50 M 14 C-IPP para iniciar la reacción en tampón A con 0,5 mM de MgCl 2 en 22 - 30 ° C.
    Nota: Las condiciones de reacción exactas pueden variar con las preparaciones de cis- TPs diferentes de DHDDS. Por otra parte, la actividad de DHDDS también depende de la temperatura y [Mg 2 + ].
    Precaución: 14 C-IPP es radioactivo y debe utilizarse de acuerdo con las regulaciones locales de seguridad radiológica.
  2. Retirar muestras de 15 μL de la reacción a 0, 2, 4 y 6 h, después de la extinción inmediata de la reacción mediante la adición de 15 μl de tampón A suplementado con 20 mM de EDTA (hasta una concentración final de EDTA 10 mM).
  3. Añadir 1 ml de H 2 O-1-butanol saturado y agitar a fondo para extraer los productos de reacción.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí y las muestras se pueden guardar para su posterior lectura.
  4. Añadir cóctel de centelleo a las muestras y, utilizando un contador de centelleo, cuantificar los productos de reacción en la fase de butanol que abarca 14 C, junto con la radiactividad de 15 μ l de la mezcla de reacción, que representa la radiactividad total.
  5. Restar las lecturas de fondo medidas usando las muestras de 0 h de cada punto de tiempo y calcular el porcentaje de 14 C-IPP utilizado.
  6. Calcular la incorporación neta de 14 C-IPP en cada punto de tiempo calculando el porcentaje utilizado del total 14 14 C-IPP con el tiempo.

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Representative Results

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En la Figura 1 se muestra la descripción general del constructo utilizado y el proceso de purificación. Las muestras obtenidas en cada etapa de purificación se muestran en la Figura 2 . Este análisis de SDS-PAGE muestra la purificación por etapas de DHDDS, dando como resultado un producto altamente purificado. La Figura 3 muestra los resultados de la SEC analítica de la enzima purificada, revelando que la proteína sólo se observa como un homodímero. La Figura 4 muestra un ensayo de actividad dependiente del tiempo representativo. La incorporación de C-IPP aumenta claramente a las 6 h, verificando que la enzima purificada es funcional.

Figura 1
Figura 1: Clonación y Purificación de DHDDS Humanos . ( B ) Esquema del protocolo de purificación DHDDS humano descrito aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Purificación de DHDDS humanos . Análisis de SDS-PAGE de etapas de purificación de afinidad DHDDS humanas. Carril 1, marcador de peso molecular (kDa); Carril 2, extracto bruto; Carril 3, Co 2+ -IMAC flujo-a través. Flecha indica la proteína de fusión TRX-DHDDS; Carril 4, eluyente de Co _ { 2+} - IMAC; Carril 5, proteína-TEV mezcla de proteasa después de la incubación durante la noche; Carril 6, Co 2+ -IMAC flujo a través de la división de TEV; Carril 7, Co2 + -IMAC eluido después de la escisión de TEV; Pista 8, DHDDS humano purificado (indicDespués de una cromatografía de exclusión por tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: SEC analıtica de DHDDS humano purificado. La fluorescencia de triptófano se monitorizó como se describe en el protocolo. De acuerdo con la curva de calibración de esta columna, DHDDS forma un homodímero (77,4 kDa). La flecha indica el volumen vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 : TiMe-dependiente de DHDDS humano purificado. La actividad in vitro de DHDDS humano purificado en la reacción con 10 μM de FPP y 50 μM de 14C-IPP como sustratos se expresa como incorporación de IPP por proteína (mol / mol). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo descrito aquí para la purificación de DHDDS humano funcional en células de E. coli es simple y eficiente, permitiendo una sobreexpresión y purificación de la proteína en 3 - 4 días una vez que se dispone de una construcción adecuada. Tales protocolos para la purificación de proteínas son de especial importancia dado los avances en la secuenciación del genoma, que proporcionó gran cantidad de información sobre la genética de muchas enfermedades [ 18] , lo que requiere el desarrollo de métodos de alto rendimiento para caracterizar mecanismos patogénicos a nivel de proteína [ 19] .

Para superar los errores comunes en la sobreexpresión y purificación de proteínas heterólogas, aquí se tomaron varias medidas, que son críticas para obtener con éxito proteínas solubles y funcionales. En primer lugar, DHDDS se sobreexpresó como una fusión TRX. TRX facilita el plegamiento de la proteína de fusión y aumenta la solubilidad de la proteína de fusión, evitando la inclusión bOdy formación 20 . A continuación, para aumentar el rendimiento de proteína, la construcción de ADN fue codón optimizado para la expresión en E. coli [ 21] . Por último, para reducir aún más la probabilidad de formación de cuerpo de inclusión, la expresión de la proteína se indujo a 16 ° C para ralentizar la tasa de síntesis de proteínas, probablemente ayudando a plegamiento de proteínas [ 22] .

Tomando en consideración la homología de cis -PT entre diferentes especies, sugerimos que este protocolo se puede aplicar para otros eucarióticos cis -PT también 1 . Utilizando el protocolo actual como punto de partida, y dado los lineamientos generales críticos para la expresión de DHDDS, este método puede ser modificado para la expresión óptima de diferentes cis- TPs. Por ejemplo, se puede intentar diferentes socios de fusión (tales como proteína de unión a maltosa) o bien optimizar las condiciones de cultivo para la proteína específica a estudiar.

<Con su significación biomédica y biotecnológica 1 , 7 , 8 , el uso futuro del protocolo descrito para obtener grandes cantidades de DHDDS funcional purificado, junto con otros cis- PT, permitiendo la búsqueda de su caracterización estructural y funcional . Por ejemplo, estudios moleculares adicionales del DHDDS resolverán los mecanismos subyacentes a la retinitis pigmentosa relacionada con el DHDDS, lo que podría conducir al descubrimiento y desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Además, como los cis- PTs procarióticos están implicados en la síntesis de la pared bacteriana, este grupo de enzimas forma potencialmente nuevos objetivos para nuevos agentes antibacterianos. De hecho, una caracterización exhaustiva de los estudios de enzimas eucariotas y procariotas puede permitir el desarrollo racional de fármacos antimicrobianos selectivos para el cis- PT procariótico. Finalmente, como el caucho natural se sintetiza bY los miembros de la familia cis- PT, el enfoque descrito aquí puede encontrar uso futuro en la síntesis industrial de caucho natural.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Centro para la Excelencia en Investigación de la Fundación Israelí de Ciencias (I-CORE) en Biología de las Células Estructurales (1775/12) y la Fundación Israel de Ciencia otorga 1721/16 y 2338/16 (YH), ​​y 825/14 (DK ). El apoyo de la Fundación Fields Estate a DK es muy apreciado. Este trabajo fue realizado por Ilan Edri y Michal Goldenberg en el cumplimiento parcial de los requisitos de la tesis MD de la Facultad de Sackler de Medicina, Universidad de Tel Aviv.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

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References

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Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em
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Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).More

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