Summary
제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.
Abstract
교양된 설치류 두뇌 분할은 신경 및 그들의 정상적인 vivo에서 상호 작용의 대부분을 유지 하는 환경에서 명과의 세포질이 고 분자 행동을 공부 하 고 유용 합니다. 다양 한 유전자 변형 마우스 라인 또는 붙일 태그가 단백질 또는 야생 타입 두뇌 조각에서 기자 들의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터의 사용에서 얻은 조각 고해상도 이미징 형광 현미경 검사 법에 의해 허용. 비록 뇌 조각, 조각 문화를 결합 하 여 수행 하는 기능을 영상에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다 오래 기간 동안 라이브 분할 영역에 특정 셀의 반복적인 고해상도 이미징 문제 행 세 하고있다. 이것은 최고의 사용자를 보호 하 고 교차 오염을 방지 하는 닫힌된 시스템에서 수행 하는 이후 외 인 단백질의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터 사용 하는 경우 이것은 특히 사실. 간단한 수정 롤러 튜브 뇌 조각 문화 방법에 많은 주 동안 조각의 반복 고해상도 이미징 동봉된 시스템에서 허용 하는 보고 됩니다. 경작 photoetched coverslips에서 조각 신속 하 고 정확 하 게 다른 치료 전후 시간이 지남에 동일한 필드를 이미지를 무대 위치를 표준 마크의 사용을 허용 합니다. 예 특정 신경 얼룩 및 hippocampal 조각 건축에서 변화를 관찰 하는 식, 형광 단백질의 바이러스 중재 신경 식 및 cofilin 병리학의 개발이이 방법의 사용에 대 한 표시 됩니다. 이전 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 올리고 슬라이스 치료 응답에 Alzheimer의 질병 (광고)의 해 마에서 관찰 되었다.
Introduction
해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m2 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상1을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된2되었습니다.
두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스3 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭4를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표5를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경6을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화5에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트7에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.
플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한8에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.
우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애9, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD8의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율10,11, 12. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia8, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβo)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.
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Protocol
동물 사용 동물 관리 및 사용 지침의 콜로라도 주립 대학에 승인 된 사육 및 동물 사용 프로토콜 준수는 다음과 같습니다.
참고: 프로토콜 아래 장기 인큐베이션 및 hippocampal 조각의 간헐적인 이미징에 대 한 준비 및 문화 메서드를 설명합니다. 단일 hippocampal 슬라이스 플라즈마 응고를 사용 하 여 특별히 준비 photoetched coverslip에 연결 하 고 롤러 인큐베이터에서 유지 됩니다 교 련된 아웃 롤러 튜브의 평평한 면에는 coverslips는 봉인 하는 다음. 플라즈마 혈전 형광 단백질 표정 및 고해상도 이미징에 대 한 바이러스 감염 전에 plasmin로 해산 됩니다. 형광 신경 중요 한 염료 슬라이스 내의 뉴런을 이미지 하는 데 사용 됩니다.
1입니다. 준비 롤러 튜브 랙
- 그림 1 에 표시 된 서식 파일을 사용 하 여 눈금 막대에 표시 된 크기에 인쇄. 손톱으로 펀치 구멍을 중심으로 하는 서식 파일에서 작은 구멍 (대형 충분히 좋은 포인트 마커).
- 15 cm 조직 문화 접시 (공칭 지름 14 cm)의 바닥에 서식 파일을 설정 하 고 구멍의 위치를 표시 합니다. 두 번째 접시에 이것을 반복 합니다.
- 드릴 비트 플라스틱에 사용 하기 위해 설계 된, 구멍 센터 접시의 가장자리에서 2.5 c m로 6 각형 배열 (4.8 cm 센터-에-센터)에 각 접시에 6 개의 1.5 cm 직경 구멍을 드릴. 3 개의 구멍 (직경에서 3 m m) 가장자리를 equidistantly 그림 1A와 같이 큰 구멍의 2 사이 12 m m 드릴.
- 각 접시의 바닥으로, 서로 마주 장소는 2.5 인치 긴 기계 나사 (3/16 인치 직경) 두 번째 플랫 와셔 조각 뒤 작은 구멍 중 하나를 통해 플랫 와셔와 폴 리 에틸렌 튜브 (스페이서, 4.7 cm), 다른 플랫 와셔 두 번째 조직 문화 접시, 다른 플랫 와셔, 잠금 와셔 및 너트.
- 1.4 다른 두 기계 나사, 및 모든 기계 나사 장소에 때까지 느슨하게 강화 단계를 반복 합니다. 그런 다음 안전 하 게 너트를 조입니다.
- 마지막 롤러 튜브를 랙 하단 접시의 구멍에 밧줄 고리 (5/16 인치 두께, 5/8 인치 구멍 직경)을 작동 (그림 1B; 자리에 두 개의 튜브와 함께 표시). 고유 번호로 각 선반에는 스티커를 놓습니다.
2입니다. 롤러 튜브 및 Coverslips의 준비
- 롤러 튜브에 구멍을 드릴링 지 그 만들기
- 1.5 c m 구멍 8 cm 깊은 같은 각도에서 5.5 인치 나무 블록 x 4 x 2의 센터 측에 블록 삽입과 거의 평행한 것 롤러의 편평한 측 지 튜브 (그림 2A).
- 둥근 나무 파일을 사용 하 여 확대와 테이퍼 튜브 삽입을 허용 하도록 구멍을 구멍을 확대 (롤러 튜브는 모자 끝 직경에서 경미하게 더 큰) (그림 2B).
- 1.5 cm 직경 수직 구멍, 블록의 측면에서 5.5 cm 그리고 가운데 옆 구멍 (그림 2C)에.
- 측면 구멍은 충분히 테이퍼는 때 슬라이스에 대 한 구멍 센터를 위치 튜브 표시 된 자리를 중심으로 1.5 c m 세로 구멍에 원하는 자리에 표시 된 롤러 튜브를 삽입 합니다.
- 튜브를 제거 하 고 튜브의 끝에 자리에서 거리를 측정 한다. 이 거리는 지 그에서 구멍의 센터에서 표시 하 고 올바르게 위치 ( 그림 2C화살표) 드릴링에 대 한 튜브를 중지를 제공 하는 네일 삽입.
- 쇠 톱을 사용 하 여 부상을 방지 하기 위해 나무 블록의 표면으로 플러시 못 잘라.
- 경우 슬롯 수에 그것을 허용 하는 드릴 프레스 고정 (그림 2D 검은 화살표)는 지 그의 하단에 스프링 클립을 추가 합니다. 그렇지 않으면, C-클램프를 사용 하 여 드릴 프레스에 안전 하 게 지 그를.
- 지 그를 사용 하 여 개최 하 고 위치 (그림 2A)까지 편평한 측으로 평면 양면된 11 cm 플라스틱 문화 관 6 m m 직경 구멍 바닥에서 1.0 cm 센터 위에서 설명한 고 튜브의 측면 사이 중심.
참고: 플라스틱을 위한 드릴 비트는 사용 되어야 한다. - 회전 시키는 버 제거 도구 (그림 2E) 구멍의 가장자리를 매끄럽게 그리고 4 홈 안쪽에 구멍의 가장자리 (그림 2E, 삽입) 회전 하는 동안 구멍의 배출 촉진을.
- 12 m m 구멍 펀치, 12 mm 직경 디스크 비 독성 이중 양면된 접착 실리콘 고무 시트에서를 잘라. 사용 공식 로고는 한 구멍 종이 펀치 (6 m m 직경)를 표준으로 보호 되어, 각 디스크의 중심에 구멍을 만들.
- 뚫고 튜브 70% 에탄올을 린스, 공기 건조 그들 생물 안전 캐비닛, 튜브 및 생물 안전 캐비닛에 UV 램프 (30 70 cm 평균 거리에서)에서 40 분 대 한 천공된 접착제 디스크 소독.
- 위치를 변경할 튜브 및 디스크 20 분 후에 모든 노출된 표면 살 균 된다. 무 균 조건 하에서 껍질을 화이트 접착제 디스크에서 백업 하 고 실리콘 고무 튜브, 구멍 (그림 2F) 정렬의 외부에 부착.
주의: 자외선에 노출을 피하기 위해, 눈 보호를 착용 하 고 UV 램프를 켜기 전에 캐비닛을 닫습니다. - 12 m m 직경 photoetched (100 센터 번호가 1 m m 사각) 독일 유리 coverslips 청소. 집게와는 coverslips를 부드럽게 잡고 절대 에탄올, 물, 다시, 절대 에탄올 뒤 뒤에서 찍어와 마지막으로 에탄올을 구울 화 염에 coverslips을 찍어. Coverslips 냉각 허용 합니다.
- 집게는 coverslips 개최, 아세톤에 2 %3-aminopropyltriethoxysilane로 10 미 린스 초순와 coverslips와 건조 공기를 허용.
- 캐비닛 생물학 안전 내부 살 균 필터 종이에 coverslips를 설정 하 고 UV 빛 켭니다. 20 분 동안 coverslips의 각 측면을 노출 합니다.
주의: 자외선에 노출을 피하기 위해, 눈 보호를 착용 하 고 UV 램프를 켜기 전에 캐비닛을 닫습니다.
3. hippocampal 슬라이스 준비
- 해 부를 시작 하기 전에 조직 헬기에 대 한 양 날 면도날의 반쪽을 준비 합니다. 블레이드를 신중 하 게 손가락으로 세로로 접어 하 고 절반에 스냅.
- 절대 에타 놀에서 rinsing 하 여 다음, 그들을 청소 하 고 건조 공기를 면봉을 사용 하 여 아세톤과 블레이드 반쪽 린스.
참고: 뇌 조각 문화 프로토콜 마우스 또는 쥐 긴장 또는 유전자 형의 독립적입니다. 서로 다른 유전적 배경 가진 많은 유전자 변형 마우스 라인 사용 되었습니다.
- 집게, 안정성에 대 한 페 트리 접시의 측면에 대 한 트림된 두뇌 후부 쪽과 복 부 측 붙. 부드럽게 화살 중간 주위 멀리 meninges 애타게 고 midbrain 조직 잘 흘린된 뒤 몽 #5 집게 (그림 3C, 점선된 원)를 사용 하 여 제거 합니다.
- 그것은 오픈 (그림 3C, 파선)을 전파 하는 두뇌의 측면을 따라 두 컷을 확인 합니다. 뇌 아래 등 쪽 측 및 확산 오픈 배치는, 일단 hippocampal 균열 표시 되어야 합니다 (그림 3D, 화살표).
- Polychlorotrifluoroethylene 플라스틱 필름 조각에 확산 오픈 두뇌를 전송 하 고 조직 헬기의 단계에 부 러 뜨 리 위치. GBSS/포도 당 블레이드 습식 및 해 마 ~ 300 µ m 두꺼운 조각으로 잘라.
- 전송 피 펫와 함께 GBSS/포도 당 (그림 3E)을 포함 하는 신선한 60 mm 접시에 플라스틱 필름에서 슬라이스 뇌를 플러시. 부드럽게 떨어져 꼬 집 고 잘 밀고 집게, 나머지 meninges와 다른 비 hippocampal 조직 (그림 3F) (그림 3G, H) 조각에서 멀리, 애타게.
4. 도금 조각
- 조각을 받은 후 준비 coverslip photoetched 측면의 중앙에 닭 플라즈마의 2 µ L를 놓습니다. 약간 자리를 달성 한 3-4 m m 직경 플라즈마 확산.
참고: photoetched 측면 coverslip 숫자는 방향이 올바르게 되도록 해 부 현미경을 통해 볼 때의 최고의 측면이 이다. - 1 뇌 조각 살 균 좁은 팁 주걱(그림 4)와 플라즈마 자리 (그림 4B) 전송. 닫힌된 집게를 사용 하 여 GBSS/포도 당에서 슬라이스를 해제 하는 동안 주걱 끝에 슬라이스를 유지.
- 닫힌된 집게와는 coverslip에 자리 플라즈마 주걱 터치는 coverslip에 슬라이스를 밀어.
- 믹스 2.5 µ L의 플라즈마와 별도 튜브에 트 롬 빈의 2.5 µ L. 신속 하 게 부드럽게 그것은 (그림 4B)를 혼합 하 고 슬라이스를 위아래로 피펫으로 주변이 혼합물의 2.5 µ L를 배치 합니다.
참고: 플라스마는 응고 10-15 s 내 그래서이 신속 하 게 이루어져야 합니다. 조각을 접착 문제가 경우 5 µ L 트 롬 빈으로 5 µ L 플라즈마를 혼합 하 고 4-5 µ L를 사용 하 여 조각, 일부는 슬라이스는 coverslip에 평평 거짓말을 혼합 후 제거에. - 이전 롤러 튜브에 부착 된 실리콘 고무 접착제의 노출 된 측면에서 다루는 투명 한 플라스틱을 제거 하 고 구멍 (그림 4C) 내에서 분할 영역을 정렬 하는 접착제에 두뇌 슬라이스 coverslip 장소.
- 접착 되도록 하는 coverslip 아래로 균등 하 게 누르고 그것은 약 1 분 동안 생물 안전 캐비닛에 그것을 전송 하는 동안 엄지 coverslip 심지어 압력 소프트, 적용 됩니다.
- 생물 안전 캐비닛, 각 관 (그림 4D)를 완전 한 Neurobasal A 문화 매체 (자료 테이블)의 0.8 mL를 추가 합니다.
- 클램프에 의해 안전 하 게 개최 살 균 면 연결 파스퇴르 피펫으로 통해 5% CO2/95% 공기 혼합물의 흐름. 가스 혼합물으로 롤러 튜브를 플러시 하 고 빠르게 피펫으로 주위에서 철회로 튜브를 캡.
- 슬라이스 번호와 튜브 라벨 그리고 수를 랙. 그들은 기하학적으로 균형 보장 롤러 선반에 튜브를 삽입 합니다. 튜브의 홀수가 있는 경우에, 균형을 튜브를 추가 합니다.
- 롤러에 대 한 롤러 선반에 선회와 35 ° C 롤러 인큐베이터에서 랙에 배치 10-13 RPH (그림 4E). 튜브의 하단에 있는 매체를 유지, 기울기는 인큐베이터의 전면 보드에 올려서 약 5 °를 다시.
- 슬라이스 및 관찰 날짜의 모든 정보를 기록 하는 데 사용 되는 스프레드시트에 조각과 관을 입력 합니다.
- 에 약 문화, 하루 6 각 관에 활성 plasmin의 1 µ L (0.002 U) 추가.
- 혈전을 완전히 분해 후 (일반적으로 몇 시간), 매체를 제거 하 고 plasmin 없이 신선한 매체. 필요한 경우 슬라이스를 plasmin 하룻밤 incubated 수 그리고 매체 변경 다음 날.
- 슬라이스는 일반적으로 실험에서 사용 하기 전에 적어도 7-10 일 동안 알을 품을. 중간 발음 하 고 당일 3 또는 4 일 7, 그리고 모든 7 일 그 후에 다시 합니다.
5. 대비 바이러스 성 벡터의 Transgene 식
참고: 슬라이스 문화의 뉴런에서 transgenes 표현의 이루어집니다 유전자 조작된 설치류에서 두뇌를 사용 하 여 나는 transgene를 도입 하 여 재조합 복제 결핍 바이러스 감염에 의해.Adenoviruses (AV), adeno 관련 바이러스 (AAV), 및 재조합 lentivirus 벡터 모두 사용 되었습니다 우리의 hippocampal 슬라이스 문화에 뇌 조각에 다른 형광 단백질 키메라의 표현에 대 한.
- 복제 방법 관심의 RNA를 표현 하기 위한 결핍 AV 설명 되어13,14준비. Titer 바이러스 감염 U/ml로 virally 표현한 단백질에 항 체를 사용 하 여 직렬 희석 방법에 의해 설명 된14. Cofilin 집계와 cofilin-걸 막대 형성을 관찰, cofilin-R21Q-mRFP cDNA (플라스 미드 #51279)16을 사용 합니다.
참고: synapsin 1 발기인 세포 발기인은 많은 세포 유형13높은 식 레벨을 운전 하는 데 유용 하는 반면에 신경 특정 식15, 탁월한 선택입니다. - AAV 여 준비 전송의 공동 transfection 관심사의 유전자를 포함 하는 플라스 미드와는 담당자/모자 플라스 미드, 도우미 플라스 미드의 유무에 관계 없이 앞에서 설명한17,18바이러스 E1 유전자 공급 HEK293 포장 세포로.
참고: 재조합 형 AAV 또한 호스트 세포 게놈19에 타겟된 삽입을 위해 만들 수 있습니다. 전송 플라스 미드에 대 한 우리는 C 터미널 mRFP1 형광 단백질 태그 (플라스 미드 #50856)는 synapsin 발기인 포함 된 AAV 플라스 미드 하류 칼슘 센서 GCaMP5G20로 복제 인간 cofilin 1를 사용 합니다. 인코딩 P2A 자체 cleaving 펩 티 드 순서 DNA의 피스는 GCaMP5G와 cofilin-RFP PCR 단일 AAV 사본21에서 두 단백질의 식을 제공 하는 전송 플라스 미드의 준비 동안에 삽입 됩니다. - 전송 플라스 미드 유전자 또는 cDNA의 관심 및 통합 신호를 분할 바이러스 성 개 그, 폴, 레 브, 및에 vsv g 유전자 혼합 포장 3 세대 lentivirus 포함의 공동 transfection에 의해 재조합 lentivirus 벡터를 준비 3 별도 플라스 미드22,23.
- 전송 플라스 미드를 사용 하 여 복제 시스템24 번 pLKO.1-GFP (플라스 미드 #30323), synapsin 발기인와 cofilin-R21Q-mRFP는 hPGK 교체로 synapsin 발기인 및 (에서 플라스 미드 #51279) cofilin-R21Q-mRFP cDNA를 조립 발기인 및 GFP cDNA, 각각.
- 앞에서 설명한23으로 인산 칼슘에 의해 HEK293T 세포로 최종 플라스 미드 transfect.
- 4 10 cm에서에서 매체를 수집, 500 µ L 150 K 구분 원심 집중 장치를 사용 하 여에 집중 하 고 빠른 액체 질소에서 동결 후 작은 aliquots에-80 ° C에서 최종 lentivirus를 저장. 세포를 감염에 대 한 aliquot 한번만 녹여
- 각 바이러스 유형의 볼륨 준비 표현의 다양 한 양의 바이러스 감염 후 transgenes는의 식을 따라 다른 슬라이스 문화의 숫자를 설정 하 여 원하는 학위를 달성 하기 위해 실험적으로 결정 합니다.
참고: 일반적으로 바이러스의 1-10 µ L 슬라이스 당 사용 됩니다.
6. 슬라이스 치료
- 바이러스 감염 조각
- 생물학 안전 장은 바이러스 벡터에 대 한 적절 한 생물 안전 수준 작업에 대 한 승인에서 working, 0.8 mL 전체 매체의 바이러스 (일반적으로 1-10 µ L)의 약 수 믹스.
- 표 백제를 포함 하는 컬렉션 함정 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 슬라이스에에서 중간 발음 보조 함정 첫 번째 함정 그리고 진공 근원 사이 항상 사용 됩니다.
- 위의 준비는 바이러스를 포함 하는 약 수와 함께이 매체를 대체, 랙, 문화 관을 반환 하 고 인큐베이터에 배치.
- 생물 안전 캐비닛에 바이러스 조각이 잠복기의 2-5 일 후 살 균 전송 피 펫과 바이러스 포함 된 매체를 제거 하 고 바이러스를 죽 일 승인 된 항 바이러스 대리인을 포함 하는 병으로 배치 합니다.
- 중요 한 염료와 뉴런의 얼룩
- 준비 및 100 μ M의 농도에서 액체 질소에 aliquots의 빠른 냉동 4 µ L에 의해 형광 신경 중요 한 염료25 의 aliquots를 저장 하 고 이러한-20 ° c.에 저장 할 하지 동결/동결 해제는 염색 한 번 이상.
- 형광 현미경 검사 법에 의해 신경 시각화에 대 한 레이블, 신경 중요 한 염료에의 한 약 수를 녹여 및 완전 한 Neurobasal 매체에 4 mL에 희석 (최종 염료 농도 100 nM).
- 포부 (또는 매체 바이러스를 포함 하는 경우 전송 피 펫) 조각에서 매체를 제거 하 고 100 nM 신경 중요 한 염료를 포함 하는 매체의 0.8 mL와 함께 그것을 대체. 인큐베이터에서 롤러 장치에는 분할 영역을 반환 합니다.
- 잠복기 2 h에 대 한 조각, 후 염료를 포함 하는 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛에 신선한 완전 한 매체의 0.8 mL와 함께 그것을 대체 합니다.
참고: 중요 한 염료와 조각에서 신경의 라벨 외피의 몇 시간을 필요 합니다. 첫 번째 이미지는 일반적으로 색소 치료 후 24 시간 촬영 한. 신경은 구체적으로 표시 하 고, 신경 영상 더 주고 2-3 일 동안 하락 배경 형광은. 중요 한 염료의 농도 72 h 후 거절합니다. - 시간이 지남에 조각 형태에 변화를 따라 클럭이 슬라이스 7 일 마다.
7. 슬라이스 이미징
- 거꾸로 현미경에 분할 영역을 봅니다. 밝은 형광 이미징, 이미징, 전에 24 h에 대 한 페 놀 레드 pH 지시자 없이 완전 한 Neurobasal A 매체와 문화 매체를 교환 합니다.
참고: 여기에서 보고 된 실험에 대 한 조각 볼 수 있습니다 선형 인코딩된 갖춘 거꾸로 회전 디스크 공초점 형광 현미경에 x, y 단 피 z 제어 및 민감한 고해상도 디지털 카메라. - 튜브는 coverslip 수직으로 유지 하는 무대 어댑터 (그림 5B)에 배치 되는 주문 품 튜브 홀더그림 5(A)에 롤러 튜브 장치에서 이미지를 슬라이스 문화를 전송합니다 목표 고 긴 간격에 걸쳐 반복적인 이미징 세션 동안 동일한 방향에서 슬라이스를 유지.
- 위치 (그림 5B)에 튜브를 튜브에 대 한 꽉 무대 어댑터에 슬라이더를 밀어.
참고: 튜브 홀더의 세부 단계 어댑터, 및 히터에 액세스할 수 있습니다: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
참고: 표준 마크에서이 상쇄 위치 수 조각 몇 군데 같은 coverslip 위치의 일관 된 지적 원래 x 표준 마크의 y 설정을 변경 하더라도 때 튜브 또는 단계 어댑터 제거 되 고 대체.
참고: 이미지 비행기 보통 0.5 µ m 크기와 이미지 기능 원하는 해상도 따라 2 µ m의 간격으로 얻어진 다. 이미지 기능 인수, 여러 비행기에 확장 하 고 그래서 작은 기능을 시각화, 작은 간격으로 하는 비행기 사이 요구 품질의 3D 이미지를 구축.
참고: 대부분의 이미징 세션 보고 여기 18 분/조각 아래에서 했다. 그러나, 우리가 일부 조각 10 또는 더 많은 시간, 그리고도로 몇 군데 있다 분할의 장기 생존에 명백한 해 없이 단일 세션에서 40 분으로.
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Representative Results
얼마나 정확 하 게 확인 하려면 표준 마크를 활용할 수 있는 시간이 지남에 같은 필드 내에서 동일한 셀을 이미지 복원, 하 우리 검사 photoetched coverslips (그림 6A)에 성장 하는 조각. 뉴런은 중요 한 염료와 염색 법에 의해 시각 (100 nM 2 h;에 대 한 비 신경 세포를 얼룩이 되지 않습니다)는 셀25를 해치지 않고 시간이 지남에 따라 뉴런에서 사라집니다. 우리는 표준 식별 마크 단일 그리드 스퀘어 (그림 6A, B), 라벨, 후의 중요 한 염료-표시 24 h 지역 발견 기록 x 그리고 y 오프셋 위치 표준 마크 (그림 6의B)에서 수집, 4 연속적인 일에 영상 반복이 영역의 confocal 이미지 스택을 60 X 목표를 사용 하 여. 30 µ m 이미지 스택 같은 위치에서 촬영의 최대 프로젝션 이미지 (그림 6C F) 표시 됩니다. 형태학 상 변화 발생 지역 내에서 4 일 동안, 하지만 시간이 지남에 (의 몇몇 표시는) 동일한 셀을 다음 수 있습니다. 중요 한 염료의 형광 강도 시간이 지남에 따라 감소 하지만 신경 여전히 라벨 후 명확 하 게 식별 4 일. 대부분 신경 중요 한 염료 형광의 확산, 세포질 내에서 비록 일부 punctate 얼룩 항상 관찰 되었다, 더 눈에 띄게 된 형광 거부를 배경으로. 건강에 해로운 조각, 비 신경 세포의 punctate 얼룩 또한 악화 하는 조각으로 관찰 되었다. 이러한 결과 조각에 식별 된 셀 수 그들을 찾을 수 fiducial 마크를 사용 하 여 반복 군데 수 보여 줍니다.
장기적인 문화 중 신경 조직 및 분할 영역 내에서 생존 시간에 따른 변화를 검사, 우리 따라 동일한 조각 5 주 동안 주 이미징 하기 전에 24 시간에 한 번씩 형광 신경 중요 한 염료로. 몇 주 동안이 중요 한 염료와 염색의 여러 라운드의 축적을 증가 했다. 플라즈마 혈전에 아직도 있던 갓 도금된 조각 내 뉴런 염료와 로드 되었고 1 일에 생체 외에서 (1 개의 DIV)에서 몇 군데. 같은 조각 5 주 동안 다시 매주 몇 군데 있었다. 4 x 목표와 함께 단일 조각에서 얻은 이미지 (그림 7A-E) 표시 됩니다. 488 nm 및 형광 방출에서 측정에 흥분 하는 경우 CA와 DG 영역의 피라미드 세포 층 밝게 표시 된 > 620 nm. 19 조각 관찰의 5 주 동안, 3 개의 슬라이스는 coverslip 벗 및 다른 두 그들의 전형적인 형태를 잃 었 하 고 불투명, 되었다 그들의 죽음의 표시. 따라서, 실험을 위해 약 70%의 생존 율을 고려 한다, 그리고 여분의 조각 분석을 위해 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 준비. 분할 영역 조직 헬기 300 µ m의 공칭 두께 설정을 준비 했다. 5 주 후에 문화, 우리 이미징 신경 중요 한 염료 얼룩이 진 조각 회전 디스크 confocal 현미경에 40 X 오일 목적으로 슬라이스를 통해 최대 coverslip에서 슬라이스 두께 측정. 257의 평균 발생 한 뉴런의 초점의 손실 nm (n = 슬라이스 당 사용 하는 여러 개의 지사가 있는 5 조각), 도금의 시간에서 발생 했다 그 아주 작은 조각의 숱이 보여주는. 우리 수 정확 하 게 측정 하지 슬라이스 두께 형광 현미경 검사 법에 의해 중요 한 염료 플라즈마 응고에 갇힌 준 확산 형광 초점의 손실 발생 한 위치를 정확 하 게 측정 하기가 어렵습니다 때문에 도금의 시간에서. 그러나, 슬라이스 내의 뉴런의 3D 이미지 쉽게 얻을 수 있습니다 조각에서 플라즈마 응고 제거 후. 21 DIV 조각, 그림 7F, 낮은 확대율에서 표시 되었다 confocal 현미경 (1 µ m 단계)에 60 X 목적으로 신경 중요 한 염료와 로드 후 3 일 몇 군데. 60 µ m 3D 이미지 초점 비행기 (그림 7G)에서 건축 되었다. 신경 및 중요 한 염료와 분류 neurite 프로세스 차원에서 다음 수 있습니다. 형태와 조각의 3D 구조 적어도 3 개월 동안 잘 유지 했다 그리고 긴 시간 현재 연구에 사용 되었다.
장소를 걸릴 수 있습니다 제안 하는 coverslip에 조각의 운동을 이전 이미지 위치의 형태에 큰 변화는 또한 일부 조각에 발생 했습니다. 물론, 이미징 사이 긴 간격에 걸쳐 몇 군데 되 고 필드에 세포 이미징 이전 세션에서 관찰 하는 사람에 게 동일 했다 확실 하 게 알아야 더 어렵게 되었다. 따라서, 조각의 중요 한 염료 표시 (그림 8) 4 주에 걸쳐 주간 간격 60 x 목표와 동일한 위치에 인수 confocal 스택의 최대 프로젝션 이미지 보여 신경 생존 잘 유지 하지만 그것은 어려운 이미지 세션 사이의 긴 시간 간격을 얻을 수 있습니다 때 시간이 지남에 따라 특정 뉴런 식별 합니다. 아마도 여러 fluorophores 표시 셀의 패턴 셀 이미지 스택을 통해 스크롤에 의해 관찰 하는 경우 지역화 된 그룹에는 더 쉽게 인식 될 것 이다.
Hippocampal 조각의 뉴런에 외 인 유전자의 도입에 대 한 다른 바이러스 성 벡터의 유용성을 평가 하기 위해 우리는 슬라이스 infectivity AV, AAV, 재조합 lentiviral 벡터, 각 다른 형광 태그를 표현 또는 사용을 사용 하 여 비교 드라이브 식 다른 발기인입니다. AV (2 x 107 감염 U/슬라이스) 마우스 hippocampal 슬라이스를 coverslips에 교양된 9 주 감염 하는 데 사용 되었다 cofilin-mRFP 강한, 비 세포 특정 CMV 발기인 뒤에 표현. Cofilin-mRFP 표현의 가장 강렬한 주위 슬라이스 4 x 목표(그림 9)와 관찰로 식으로 5 일 후 감염에서 슬라이스를 통해 발견 됐다. Cofilin-mRFP를 표현 하는 조각 내 셀 일부 밝은 punctate 얼룩과 20 X 목표 (그림 9B) 또한 관찰 되었다 고 또한 신경 세포와 비 신경 세포에 식 확산. 17 주 후에 문화 (8 주 후 감염), 자발적인 cofilin 봉 아마도 야생 타입 cofilin-mRFP (그림 9C)26,27의 overexpression에 의해 구동 일부 셀에 형성 했다.
우리는 또한 그 증명 AAV (1010 입자) 조각에 식에 사용 될 수 있었다.AAV, 신경 특정 synapsin 발기인 번역된 polyprotein21의 링커에 자체 cleaving P2A 펩 티 드 순서와 GCaMP5-cofilin-mRFP 표현의 운전 하는 문화에서 9 주에 감염 하는 조각의 이미지 했다 캡처된 8 주 후 감염 (17 주 문화에서)입니다. GCaMP5와 cofilin mRFP 뉴런, 일부 cofilin 막대/집계 형성 (그림 9D-F). 봉/집계의 형광 강도 너무 강한 확산 cofilin mRFP의 아주 작은 형광 완전 한 채도 없이 관찰 될 수 있었다 하 고 막대의 cofilin 형광 이미지의 꽃. 자발적인 cofilin 봉 신경 있는 야생-타입 cofilin 형광 단백질 키메라는 계속 이상 표현된26,27, 아울러 강조 했다 신경10에 나타납니다. AAV의 약 100 ~ 500 배 높은 입자 수 같은 infectivity 약을 얻기 위해 필요한 infectivity14 그리고 AAV titer를 결정 하는 데 사용 되는 입자 수의 기준 결정, 아 데 노 바이러스의 titers에 따라 / 유명에 비해 조각에 식
조각에 형광 단백질의 재조합 lentivirus 중재 표현에 따라, 조각 1, 3, 10, 6 DIV 및 신경 특정 식 (synapsin 발기인) cofilin-R21Q-mRFP의 재조합 lentivirus의 30 µ L aliquots에 감염 되었다 라이브 셀 이미징 프로브 cofilin 걸 막대 형성16으로 개발. 분할 영역 11 DIV에서 신경 중요 한 염료로 표시 되었고 염료와 12와 14 본부 cofilin-R21Q-mRFP 식에 대 한 특정 지역에 몇 군데 감염 된 바이러스의 30 µ L 약 수 조각 이미징 살아나지 않았다 하지만 triplicate 조각으로 치료 바이러스의 다른 볼륨 mRFP는 복용량-의존 표현 했다. 그림 10 조각 1 µ L와 10 µ L lentivirus 6, 8 일 후 감염에서의 감염의 이미지를 보여줍니다. 두 개의 서로 다른 조각의 여러 지역 공동 중요 한 염료와 mRFP 식 뉴런의 얼룩에 대 한 정량 했다. 슬라이스 1 µ L lentivirus의 감염, 신경 세포의 약 28 %6 일 후 감염, 감염 된 후 8 일 85% 증가에서 mRFP 표현. 분할 영역 10 µ L lentivirus의 감염, 신경 세포의 약 58 %6 일 후 감염, 감염 된 후 8 일 86% 증가에서 mRFP 표현. 따라서,는 lentivirus의 1 µ L 8 일 후 감염에 의해 광범위 하 게 슬라이스 infectivity 및 신경 식 제공 하기에 충분 했다.
이 문화 시스템은 cofilin 병리학의 다음 개발에 유용한 입증, 조각 cofilin-R21Q-mRFP 신경에 표현 하기 위한 lentivirus 감염 치료 또는 다양 한 농도와 치료 남았다 (1 µ M, 333, 및 100 nM)의 합성 인간 Aβ 단백질 그 양식을 올리고28부 화 겪고 했다. 이전 학문에서 결과는 합성 Aβo 시연 끊된 hippocampal 신경29,,3031의 25%까지에 cofilin-말라 봉 유도. Aβ의 1 µ M 농도와 치료 모든 3 조각 온 첫 24 시간에 coverslip에서 느슨한 모든 차량 취급 조각 (제어) 하 고 그는 333으로 치료 및 Aβ의 100 nM 농도 그들이 다음 2 주 동안 살아남았다. 같은 세포 지역 (CA1, CA3, DG) 100 nM Aβo 로 치료 한 조각에 했다 몇 일 동안 (60 x 목표) 군데. CofilinR21Q-mRFP 구동 synapsin 표현 lentivirus 6 DIV에 감염 된 제어 조각 15 DIV (그림 11A)에 의해 확산 셀룰러 mRFP 식을 했다. 분할 영역 14 DIV에서 100 nM Aβo 노출 및 15 DIV에서 몇 군데 cofilin-R21Q-mRFP 분포 punctate, 두 막대 모양의 구조와 집계 (그림 11B)에 게재 된 보여주었다. 이러한 구조는 (그림 11C, 그림 11B로 셀의 같은 필드) Aβ-치료 후 훨씬 더 눈에 띄는 6 일 되었다. 많은 장소에서 풍부한 neurites 신경 세포 somas 결 석 (그림 11D)는, cofilinR21Q mRFP의 punctate 및 막대 모양의 배열을 개발 ( 그림 11C에 화살표), cofilin-말라의 분포와 비슷한 막대는 이전 문화29,,3031Aβ 처리 뉴런의 neurites 내 보고. 따라서, hippocampal 분할 영역을 관찰 하 고 경작에 대 한이 새로운 방법을 사용자가 결정 하는 cofilin 집계 및 막대 세포의 장기 생존 능력 병 리의 가역 개발, 그리고 다양 한 단계에서 쉽게 하면 차단 하거나 반대는 더 vivo에서에서 cofilin 병리학의 형성 수 있는 시 약에 복용량 응답 측정을 수행-세포 조직 처럼.
그림 1: 롤러 튜브 랙 준비. (A) 15 cm 조직 문화 접시 바닥에 밖으로 드릴링 구멍 위치를 표시 하기 위한 템플릿. 그림 표시 눈금 막대의 크기를 인쇄 하는 경우 그것은 잘라 고 표시 구멍 드릴링을 위한 15 cm 문화 접시에 위치를 표시 하기 위해 사용. (B) 롤러 튜브 랙 두 튜브 삽입 완료. 각 랙 선반 위에 쉽게 표시 스티커에 번호가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 롤러 문화 관의 준비. (A) 앞 롤러 튜브 튜브에서 6mm 구멍 드릴링을 위한 드릴 프레스에는 지 그에 삽입의 볼. 파선 지 그의 평면 양면된 롤러 튜브의 위치를 보여줍니다. (B) 끝 지 그의 삽입 튜브와 함께 하 고 드릴 구멍에 정렬 하는 비트. (C) 6 m m 드릴 비트와 함께 롤러 튜브 밖으로 드릴링 지 그에서 구멍의 최고 볼 수 있습니다.흰색 화살표 표시 삽입 튜브, 위치에 대 한 정지로 잘라 손톱의 위치 그리고 블랙 더블 라인 비트 정렬. (D) 봄 드릴 때 클립 (검은색 화살표) 지 그 하단에 안전 하 게 설치 된 위치에 그것을 잡고 튜브 합니다. (E) 구멍 드릴링, 가장자리는 링 도구와 함께 부드럽게는 홈 구멍 (구멍 해 부 현미경을 통해 본 인세트 쇼)의 안쪽에 잘립니다 후 관 회전 하는 동안 구멍에서 중간 배출 향상. (F) 문화는 coverslip 장착할 것 이다 실리콘 고무 접착제에 구멍에 구멍으로 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Hippocampal 뇌 조각의 준비. 해 부 현미경 표시와 함께 찍은 사진: (A) 그대로 마우스 뇌. 개 및 소 뇌를 제거 하는 컷의 위치는 파란색 파선으로 표시 됩니다. (B) 개 및 소 뇌의 제거 후. B 에서 뇌의 (C) 조각은 후부 지역 (소 뇌)으로 향하도록 90 ° 대칭 이동. 접시의 측 옆에 조각 위치 midbrain (파란색 점선된 원) 나머지 해 마, 시상, 시상 하 부에서 조롱 될 수 있는 제거 도움이 됩니다. 겸 자 (파란색 파선) 두 컷 평면 확산 두 반구에서 해 마를 포함 하는 나머지 조각 허용. (D) 일반된 뇌 조각 hippocampal 균열 (파란색 화살표)을 따라 실행 하는 혈관을 보여주는. 이 조직 플라스틱 필름에 배치 하 고 점선 방향으로 부 러 뜨 리 조직 헬기를 전송. (E) GBSS/포도 당에 반환 후 절반 보다 약간 더 해 마를 보여주는 조직 슬라이스. (F) 최종 해 부 해 마의 비 hippocampal 재료를 제거 하는 조각의 청소. (G) 여러 부동 조각 최종 정리 후. (H) coverslip 전송에 대 한 단일 조각의 확대 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 도금과 잠복기. (A) A 마우스 hippocampal 슬라이스 집게의 팁을 사용 하 여 솔루션에서 무료 리프트 수 있도록 주걱 끝에 문화 접시에서 제거 됩니다. (B) 조각 평평는 photoetched의 중심에에서 배치 되 고 치킨 플라즈마의 2 µ L에 12 m m coverslip 취급 고 1:1 플라즈마/트 롬 빈 혼합물의 다른 2.5 µ L 혈전 생성에 추가 됩니다. (C) 혈전 설정 후 (약 1-2 분), 덮 음 롤러 튜브에 실리콘 고무 접착 원형에서 제거 되 고는 coverslip 응고 구멍;에 중심 위치는 다음는 coverslip 엄지와 장소에서 누르면 이며 완전 한 문화 매체의 0.8 mL (D) 추가 약 1 분에 대 한 위치에서 개최. (E) 롤러 튜브의 하단에 매체를 계속 5 ° 기울기를 앞으로 큰 롤러 인큐베이터 안에 홀더 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 롤러 튜브 홀더 및 단계 격판덮개 인큐베이터. (A) 튜브는 coverslip 유지 되도록 이미지에 대 한 위치에 배치 하는 튜브 홀더. (B) 튜브 홀더 현미경 단계 어댑터 플레이트에 장착. 슬라이더에 안전 하 게 이미징에 대 한 튜브를 개최. (C) 단계 튜브 홀더 및 측면 패널 어댑터 추가 열전 온도 컨트롤러에 연결 된 포함 된 난방 스트립. 일단 튜브 장착 위치, 상자에 단단한 최고 이미징 동안 온도 유지 하기 위해 추가할 수 있습니다. 주황색 와이어 열전대 지도 이다입니다. 디자인 및 무대 어댑터와 히터의 건물에서 사용할 수 있습니다에 대 한 계획: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 표준 마크를 사용 하 여 동일한 셀의 반복적인 이미징. (A) Hippocampal 쪼 갠 다 photoetched coverslip subiculum 펼쳐 (꼬리)와 (1 m m 사각)에 객관적이 고 밝은 필드 조명 x 4와 볼. 플라스틱 롤러 튜브의 곡률 격자의 시각화를 향상 시키는 간접 조명을 만들 수 있습니다. 상자 위치 및 60 X 필드의 크기를 보여 줍니다. (B) A 34에서 4의 아래쪽의 팁으로 표준 마크를 찾는 20 x 목표와 동일한 슬라이스 보기 Y 및 x 오프셋 reproducibly 찾아 더 높은 확대 confocal 영상에 대 한 원하는 상자 중심에 표시 됩니다. (FC-) 쪼 갠 다 13 DIV는 60 x 목표를 사용 하 고 4 일 연속 (14-17 DIV)에 30 µ m 프로젝션 이미지를 몇 군데 신경 중요 한 염료와 함께 표시. 동일한 신경에는 매일 몇 군데 있었다. 3 뉴런의 각 핵의 위치는 다른 기호로 표시 됩니다. 그들은 더 쉽게 그들의 3D 위치 변경으로 약간 이미지 스택을 통해 스크롤로 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 신경 중요 한 염료와 조각에서 신경 세포 이미징. (A) 신경 중요 한 염료 스테인드 플라즈마 응고 4 X 목적으로 도금 후 24 h를 찍은의 조각. 염료 (100 nM) 조각 롤러 튜브 홀더에 처음 이었고 나중 2 h 씻 추가 되었습니다.해 마는 응고 주위 Subiculum 모습을 드러냅니다. (EB-) Plasmin 6 DIV에 추가 하 여 응고 해산, 다음 조각 중요 한 염료 주간 간격 이미징 사전 24 h와 5 번을 다시 로드 되었다. 표시 된 이미지 8, 21, 28, 35 DIV에서 수집 된 (B-전자, 각각). (F) Hippocampal 슬라이스 3 주 동안 경작 하 고 신경 중요 한 염료 4 X 목표 이미징 사전 24 h와 스테인드. (G) F 1 µ m 간격으로 61 비행기의 3 차원 보기와 같이 동일한 슬라이스에 이미지의 Confocal 스택. 신경 중요 한 염료 neurites와 세포 체를 명확 하 게 레이블 하지만 핵에서 제외 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 영상 분할의 단일 위치에서 뉴런의 4 주 이상 반복. 30 µ m confocal 이미지 스택 셀 (포지셔닝) 12, 20, 30, 및 40 DIV에서 찍은 중요 한 염료 라는 조각에서 같은 분야의 최대 프로젝션 이미지 (A-D, 각각). 반복적으로 프로젝션 이미지에 긴 시간 프레임 동안 개별 셀을 식별 하는 것이 어렵습니다. 그러나,이 오랜 기간 동안도 동일한 세포의 식별은 종종 이미지 스택을 통해 스크롤 가능 하 또는 건물 3D 이미지를 회전할 수 있습니다, 같은 그림 7G키를 누릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 바이러스 중재 표현과 형광 단백질의 영상. (A) Hippocampal 쪼 갠 다 9 주 동안 경작 하 고 cofilin-mRFP CMV 발기인 뒤에 표현에 대 한 아 데 노 바이러스 감염. 식 5 일 감염 된 후에 조각에 걸쳐 발견 하지만 형광 조각 주변에 가까운 밝은 했다. (B) 같은 조각 조각 20 X 목적으로 볼 때 내 깊은 셀에 식을 보여주었다. 이미지는 20 이미지 스택에서 프로젝션 간격 2 µ m 떨어져 있습니다. (C) 동일한 슬라이스 문화 (8 주 후 감염)에 17 주 후에 시험 되었다 그리고 cofilin mRFP 40 X 목적으로 찍은 23 이미지, 떨어져, 3 µ m의 70 µ m 스택에서이 프로젝션 이미지에서 볼 수 있듯이 막대 모양의 집계에서 관찰 되었다. (-DF) 마우스 hippocampal 슬라이스는 AAV 표현 GCaMP5-문화에서 9 주에 감염 (P2A)-cofilin-mRFP synapsin 발기인 뒤에. 10 일 후에 형광 빨강 및 녹색 채널에 표시 이었다. 많은 cofilin 포함 된 봉, 그리고 (F) 오버레이 이미지 (D) GCaMP5, 칼슘 민감한 기자, (E)의 식을 보여주는 조각의 단일 평면 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 : Cofilin-R21Q-mRFP 재조합 lentiviral 벡터 감염 신경에 있는 synapsin 발기인에 의해 구동의 식. 약한 형광 신호 감지 바이러스의 10 µ L를 사용 하 여 3-4 일 후 감염에 대 한에 의해 처음 관찰 60 x 목적으로 취득 하는 이러한 이미지에서 보듯이 5-6 일, (E)에 의해 사용할 수 되 고. 그것은 바이러스의 1 µ L로 식의 동일한 수준을 달성 하기 위해 오래 걸립니다, 하지만 8 일 후 감염에 의해 뉴런 (분류 하는 중요 한 염료)의 유사한 높은 비율 했다 표현 cofilin-R21Q-mRFP. 뉴런의 27%만 mRFP 형광 1 µ L (A, B)와 함께 6 일 후 감염에 대 한 긍정적인 했다 하지만 두 일 (C, D) 85% 증가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 : Aβ cofilin 올리고 머 유발 병 리 마우스 hippocampal 조각에서. 30 µ m으로 촬영 한 모든 이미지 60 x 목적으로 스택 하 고 최대 투영 이미지로 표시 됩니다. 조각 6 cofilin-R21Q-mRFP 감염 했다 팀 (A) 15 DIV 슬라이스 차량 (DMSO/햄의 F12 매체 Aβo를 생성 하는 데 사용)와 14 DIV에 치료. (B) 조각 15 DIV 100 nM Aβo로 치료. (C) B 20 DIV에서 찍은 및 (D) 신경 중요 한 염료 레이블이 오버레이로 표시에서 같은 필드. 화살표는 neurites 하지만 몇 셀 시체를 포함 하는 분할의 지역에서 cofilin 집계 및 막대의 선형 배열 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 롤러 튜브 메서드 장기 배양 및 슬라이스 뇌 조직의 고해상도 라이브 이미징에 대 한 수 있습니다. 장착 및 유지 보수의 조각에 슬라이스 기법으로 여기 적용 한 주요 문제가입니다. Coverslip 코팅 슬라이스 접착을 지 원하는 홍보 조각 조각;에서 셀의 마이그레이션 및 neurites의 파생물을 강화 하 여 숱이 따라서, 우리는이 기판의 사용을 피 했다. 3-aminopropyltriethoxysilane와 함께 처리 하 여 유리에 아미노 그룹의 삽입 향상 조각, 준수 하지만 coverslip에 너무 약간 또는 너무 많은 치킨 플라즈마 준수 문제를 슬라이스 잃게 발생할 수 있습니다. 적절 한 접착에 필요한 플라즈마의 볼륨 교양된 뇌 조각의 크기에 따라 이며 따라서 쥐 hippocampal 슬라이스는 약 4 배 더 큰 영역에 마우스 뇌 조각 보다 큽니다. 만약 너무 많은 플라즈마는 조각 아래에서 응고, 세포 접착 하는 coverslip 장애인 이며 plasmin 치료 위치를 변경 하거나 완전히 분리 되도록 분할을 불 것 이다. 그러나, 너무 작은 플라즈마는 응고에는 인큐베이터에 회전의 처음 몇 일 동안 슬라이스 손실 발생할 수 있습니다. 39 조각 관련 된 최근 실험에서 3 분실 되었다 그러나 그 손실의 일부 조각화 프로세스 중 발생 하는 슬라이스 손상에서 결과 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 일반적으로 약 50% 예상 수보다 더 많은 조각 실험에 필요한 준비. 문화 문제의 두 번째 주요 원인이 coverslip 인감 주위 매체의 누설 이다. 이 문제는 coverslips 개최 되지 않습니다 단단히 위치 적어도 1 분 동안에 물개를 부착 후 때 악화 시킨다. 가능성이 가장 높은 압력을 적용 하는 데 사용 하는 손가락에서 열 접착을 완료 하는 데 도움이 됩니다. 않는 발생 하는 누설은 종종 해 부 현미경으로 관찰 될 수 있다 coverslip 아래 작은 어 채널을 통해. 이 일반적으로 장기간된 엄지 압력을 사용 하 여 따라 사라집니다. 문화 느린 누설 때문에의 약 2%의 손실 예상 될 수 있다 하 고 따라서 바이러스 성 감염을 수행 하기 전에 culture를 설정 후 10 일을 기다려야 것이 좋습니다. 과도 한 엄지 압력은 coverslip에 걸쳐 균등 하 게 생산 하는 경우에 특히 또한 균열에 coverslip을 발생할 수 있습니다. 파손 문제 이면 인큐베이터에 예 열 고무 마우스 패드에 평면 아래로 튜브를 누르면는 coverslip 걸쳐 더 조차 압력을 제공 하기 위해 도움이 될 수도.
앞에서 설명한 뇌 조각 문화 또는 밀봉 된 플라스틱 튜브 (닫힌된 시스템) 내부 유리 coverslip 공기 액체 인터페이스 (개방형 시스템)에서 막에 대 한 방법 장기 슬라이스 생존을 위해 매우 효과적인 하지만 각 방법에는 그것의 힘 및 약점입니다. 공기 액체 인터페이스에서 세포 막에 슬라이스 문화 고해상도 이미징7, 침수 목표와 결합 electrophysiological 연구 유리 하지만 셀의 정확한 필드를 찾는 관련 단점 시간 및 잠재적인 사용자 노출 및 객관적인 오염 reimaging 중재 바이러스 성 유전자 발현을 사용 하는 경우. Transgenes의 표현에 대 한 바이러스의 사용은 안전 하 고 닫힌된 시스템에서 수행 하기 위해 쉽게 현미경 목표의 오염 문제가 되지 않습니다. 우리의 수정된 롤러 튜브 메서드 액세스할 수 조각의 고해상도 이미징에 대 한 의무가 electrophysiological 연구 하는 것은 아니지만.
슬라이스 문화 조건2설치류 두뇌 많은 지역에 대 한 설립 되었습니다 그러나 때문에 그것은 가장 광범위 하 게 공부 두뇌 영역 중 하나는 해 마에서 발생 하는 변경의 연구에 큰 관심의 유일한 마 여기 활용 인지 장애입니다. CA와 DG 영역의 피라미드 세포 층 그들의 조직 문화에 몇 주 동안을 유지 하 고 형태학 상으로 쉽게 관찰 될 수 있다. 우리는 새로 개발된 된 형광 신경 생존 마커25, 형광 속성을 신경 생존 및 일 개월의 기간 동안 hippocampal 조각 내 조직 모니터링 하는 데 사용 될 수 있도록 뿐만 아니라이 활용 다른 많은 형광 성 단백질 및 기자 들의 사용과 호환 됩니다. 비록 NeuO 형광25적합 하지, 우리 NeuO에서에서 488 nm 및 측정 방출에 자극 수 있습니다 > 617 nm. Photoetched coverslips에 표준 마크 문화의 많은 일 동안 반복적으로 동일한 세포를 찾아 도움과 많은 주 동안 이미지 조각의 동일한 지역에 있었습니다. 사실상 문화, 긴 시간 포인트는 우리가 얻은 슬라이스 두께 측정에서에서 5 주 동안 수정된 유리 coverslips에 발생 조각의 엷게 하기 없이 중요 한.
AV, AAV, 및 재조합 lentivirus 벡터 조각에 세 유전자를 표현 하기 위한 잘 작동 합니다. Lentivirus 신경 특정 발기인과 함께 매우 높은 비율에 식을 얻기 위해 특히 유용 (> 85%)의 감염 된 후 8 일 이내. 또한, 우리 인간의 광고10,11 에 마우스 광고 모델32 overexpressing Aβ 인식 적자의 개발과 관련 된 cofilin-말라 막대 병리학 슬라이스 문화 치료에서 모니터링할 수 있습니다 보여줍니다. 상대적으로 낮은 농도 (100 nM)의 합성 인간 Aβo. 우리는이 방법의 미래 응용 프로그램 cofilin-말라 막대 병리학 및 많은 신경 성 질환33에서 발생 하는 정확한 수지상 척추 이상이 반대 하는 새로운 치료 학 특성화 포함 됩니다 구상.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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