Summary
הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.
Abstract
פרוסות המוח מכרסמים בתרבית שימושיים הלומדים את ההתנהגות תאית ומולקולרית של נוירונים, עכשיו, דונלד סביבה המתחזק רבים של האינטראקציות שלהם נורמלי ויוו . פרוסות המתקבל מגוון של קווים העכבר הטרנסגניים או השימוש וקטורים נגיפי עבור ביטוי של חלבונים fluorescently מתויגות או כתבים פרוסות המוח פראי סוג לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. למרות פותחו מספר שיטות הדמיה פרוסות המוח, שילוב התרבות פרוסה עם היכולת לבצע דימות ברזולוציה חוזרות של תאים ספציפיים בפרוסות בשידור חי על פני תקופות זמן ארוך יש היוותה בעיות. הדבר נכון במיוחד כאשר נגיפי וקטורים משמשים עבור ביטוי של חלבונים אקסוגני מאז זה נעשית בתוך מערכת סגורה כדי להגן על המשתמשים ולמנוע זיהום לחצות. פשוט השינויים שבוצעו בשיטת תרבות רולר פרוסה המוח צינור לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה חוזרות של פרוסות במשך שבועות רבים במערכת סגורה מדווחים. Culturing פרוסות על photoetched coverslips מאפשר את השימוש סימני fiducial למיקום במהירות ובדיוק את הבמה כדי תמונה של שדה זהים לאורך זמן לפני ואחרי טיפולים שונים. דוגמאות מוצגים עבור השימוש בשיטה זו בשילוב עם מכתים עצביים מסוימים, ביטוי לבחון שינויים בארכיטקטורת פרוסה בהיפוקמפוס ויראלי בתיווך ביטוי עצביים של חלבונים פלורסנט, הפיתוח של פתולוגיה cofilin, אשר נצפתה בעבר בהיפוקמפוס של מחלת אלצהיימר (AD) בתגובה לטיפול פרוסה עם oligomers של פפטיד עמילואיד-β (Aβ).
Introduction
התרבות העיקרי של נוירונים הפומבית מאזורים במוח מכרסמים היא כלי חשוב משמשים חוקרים לבחון את התגובות באופן פתולוגי בהפרות גירויים. אולם, מחקרים כאלה יש החיסרון להסתכל על נוירונים בדו מימד בלבד וללא מערכת תמיכה גליה שלהם. יתר על כן, אלא אם כן גדל בתנאים של צפיפות גבוהה מאוד (640 מ"מ/נוירונים2 או כ- 16% של שטח פנים) אותה הופכת בלתי אפשרי לעקוב את תוצר אקראי של דנדריט או האקסון יותר במרחק קצר מן הגוף תא, בהיפוקמפוס הכדאיות עצביים מעל 4 שבועות מסרב באופן משמעותי1, הגבלת השימוש של תרבויות הפומבית ללימודים מורחבים של פתולוגיות הקשורות לגיל. Culturing הפרוסות מקריסטלים של המוח מכרסמים הוא אופציה אטרקטיבית מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שמירה של ארכיטקטורה התא מאורגן ואת הכדאיות במשך שבועות או חודשים. תנאים לשמירה על אזורים שונים רבים של המוח מכרסמים בתרבות פרוסה כבר מתואר2.
שתי שיטות העיקריים נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח: culturing על ממברנות אוויר נוזלי ממשק3 או culturing על coverslips צינורות אטום הרשאה עושה סיבוב חממה רולר לספק אוורור4. פרוסות תרבותי על ממברנות יכול לדימות ישירות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה פלורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ זקופה של מים טבילה מטרות5. לחלופין, פרוסות תרבותי על ממברנות הועבר לטיפולו כלי הזכוכית התחתונה כדי להשיג ברזולוציה טובה של הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה של6. עם זאת, שתי שיטות הדמיה פרוסות גדל על ממברנות הן מערכות פתוחות דורשים שינויים בינוני, לעתים קרובות להשתמש פטריות ו/או אנטיביוטיקה כדי למנוע או להפחית זיהום5,6. פרוסות על קרום-הממשק אוויר-בינוני לשמור על הישרדות ומורפולוגיה מעולה, אך חוזרים שוב ושוב אל מיקומים מדויקים במהלך דימות חוזרות בהגדלה גדולה היא משימה קשה ביותר, אלא אם הניסוי הוא בעקבות קבוצות קטנות בלבד של תאים הבעת סמן פלורסנט. למרות פרוסות גדל על ממברנות השתמשו בביטוי ויראלי בתיווך של5,transgenes6, פרוטוקולי אבטחה עשויה לדרוש מערכת תרבות סגורה להיות מועסק מסוימים וקטורים ויראלי המשמשים עבור ביטוי fluorescently מתויגות חלבונים ו כתבים של פיזיולוגיה של התא. יתר על כן, מטרות טבילה דורשים טיהור בין הדגימות שהופיעו לאחר מכן תרבות5. יישום מרכזי אחד של תרבויות ממשק ממברנה היא שילוב הדמיה ברזולוציה גבוהה עם אלקטרופיזיולוגיה-פעם נקודות7.
שיטת צינור רולר עם coverslips בתוך צינור פלסטיק אינו מתיר כל אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה ברזולוציה גבוהה מבלי להסיר את coverslip. לכן, בשיטה זו הוחלה לרוב על מחקרים ארוכי טווח שבו קיבוע שאחרי תצפיות שנעשו8. המתוארים כאן היא שיטה מנצל את הטכניקה תרבות של שפופרת רולר, אך על צינורות קדח-אאוט עם פרוסות על coverslips זה יכול לדימות שוב ושוב ככל התרבויות נשמרים. מערכת סגורה דורש שינוי בינונית עבור הדמיה, מנצל photoetched coverslips לספק סימני fiducial לאפשר הדמיה בהגדלה גדולה, לאחר ימים או שבועות, השדות מדויק בעבר עם תמונה.
אנו מיישמים שיטה זו לבחון שינויים בהיפוקמפוס מכרסמים, אזור מרכזי המוח המעורבים זיכרון ולמידה. מכרסמים ההיפוקמפוס הוא למד לעיתים קרובות כמודל עבור שינויים פתולוגיים או הקשורות לגיל נצפתה במהלך הפיתוח של פגיעה קוגניטיבית9, כגון אלה המתרחשות לספירה. השיטה שלנו מתאימה במיוחד ללמוד שינויים פתולוגיים להתפתח בתוך פרוסה אחת לאורך זמן בתגובה לשינויים סביבתיים, כגון העלאות Aβ פפטידים, אשר מאפיינת של המודעה8. פתולוגיה אחד המשויך מכרסמים ואנושי המוח לספירה היא הנוכחות של cofilin-אקטין אגרגטים והם מוטות, חבילות המכילות האחרון של חוטים cofilin, אקטין 1:1 יחס טוחנת10,11, 12. נצפו מוטות פרוסות קבוע של ההיפוקמפוס עכברוש לאחר הטיפול Aβ, כמו גם בתוך פרוסה המוח מכרסם חי לבטא cofilin-GFP נתון היפוקסיה8, הם עשויים לתרום תפקוד סינפטית ראיתי במודעה וקו. כאן אנו משתמשים culturing שיטה חדשה להתבונן על מסלול הזמן והפצה בתוך פרוסות של ביטוי חלבונים אקסוגני chimeric פלורסנט שהוצגו על ידי נגיפים שונים. אנחנו ואז לנצל את הביטוי הספציפי עצביים של מבנה הכתב cofilin לעקוב אחר ההתפתחות של cofilin רוד, פתולוגיה צבירה בפרוסות בהיפוקמפוס בתגובה לטיפול עם Aβ מסיסים oligomers (Aβo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שימוש בבעלי חיים בעקבות גידול שאושרו ופרוטוקולים שימוש בבעלי חיים שמתאימים טיפול בעלי חיים, שימוש בהנחיות של קולורדו סטייט.
הערה: פרוטוקול שלהלן מתאר את השיטה הכנה ותרבות דגירה ארוך טווח, הדמיה לסירוגין של פרוסות בהיפוקמפוס. בהיפוקמפוס פרוסה אחת מחוברת coverslip photoetched שהוכן באמצעות קריש פלזמה ולאחר מכן coverslips חתומות על הצד השטוח של צינור רולר קדח-אאוט, אשר נשמר בחממה רולר. קרישי דם פלזמה הם מומס עם פלסמין לפני זיהום ויראלי ביטוי חלבון פלואורסצנטי, דימות ברזולוציה גבוהה. הפלורסנט חיוני עצביים משמש לשיקוף נוירונים בתוך הפרוסות.
1. הכנת מתלה צינור רולר
- השתמש בתבנית המוצגת באיור 1A מודפס לגודל שמוצג על סרגל קנה מידה. עם מסמר, אגרוף חורים קטנים (גדול מספיק על סמן הצבע בסדר) בתבנית שבמרכזה החורים.
- הגדר את התבנית בתחתית צלחת תרביות רקמה 15 ס מ (קוטר נומינלי של 14 ס מ) ולסמן את מיקום החורים. חזור על זה בצלחת שניה.
- עם מקדחים מיועדים לשימוש על פלסטיק, תרגיל 6 חורים בקוטר 1.5 ס מ על כל מנה במערך משושה (4.8 ס מ מרכז למרכז) עם חור מרכזי 2.5 ס מ מהקצה של המנה. תרגיל 12 מ מ מהקצה הממוקמות equidistantly בין שני חורים גדולים יותר כפי שמוצג באיור 1Aשלושה חורים (3 מ מ קוטר).
- עם תחתית של כל מנה אחד מול השני, במקום 2.5 אינטש זמן מכונת בורג (3/16 ס מ קוטר) עם דסקית שטוחה באחד החורים קטנה ואחריה דסקית שטוחה השני חתיכה של פוליאתילן אבובים (מרווח, 4.7 ס"מ), עוד יתד נגדית , המנה תרביות רקמה שנייה, עוד יתד נגדית, דסקית נעילה, אגוז.
- חזור על שלב 1.4 על שני ברגים במכונה אחרים, והידוק רק באופן רופף עד ברגים במכונה כל נמצאים במקום. ואז להדק את האגוזים בצורה מאובטחת.
- לעבוד את grommets (5/16 אינץ 5/8 אינץ ' עבה, חור קוטר) לתוך החורים של המנה התחתון כדי להשיג הצינור רולר הסופית מתלה (איור 1B; מוצג עם שני צינורות במקום). מקם מדבקה על כל מדף עם מספר ייחודי.
2. הכנת Coverslips שפופרות רולר
- ביצוע רוסמ קידוח החור בשנת רולר צינורות
- לקדוח חור 1.5 ס מ 8 ס מ עמוק בצד מרכז של 2 x 4 x 5.5 ס מ בלוק עץ בזווית כזו כי הצד השטוח של רולר צינור רצון להיות כמעט מקביל עם הרחוב בעת הכנסתו (איור 2א).
- להגדיל את החור באמצעות קובץ עץ עגול הרחב והן להתחדד החור כדי לאפשר החדרת צינור (רולר צינורות הם קצת יותר גדולים בקוטר לקראת הסוף cap) (איור 2B).
- לקדוח 1.5 ס מ קוטר אנכי חור, 5.5 ס"מ מהצד של הבניין, ממורכז מעל לחור צד (איור 2C).
- כאשר החור צד הוא צמצום מספיק, הכנס צינור רולר המסומן במקום הרצוי למרכז החור על הפרוסה, מקם את הצינור כך המקום המסומן ממורכזת בתוך החור אנכי 1.5 ס מ.
- הסר את הצינור, למדוד את המרחק בין הנקודה בסוף הצינור. לסמן את המרחק ממרכז של החור. החגיגה והכנס מסמר כדי לספק עצירה כראוי למקם את צינור קידוח (חץ באיור 2C).
- השתמש מסור לנתק את המסמר בסימני ההיכר של גוש עץ כדי למנוע פגיעה.
- להוסיף קליפים האביב על החלק התחתון של התוכנית, אם יש לי. עם חריצים המאפשרים לה להיות מעוגן (איור 2D שחור חץ). אחרת, השתמש סוגרים C להחזיק את החגיגה בצורה מאובטחת על גבי העיתונות קודח.
- באמצעות ג ' יג שתוארו לעיל החזק של הצב צינור פלסטיק תרבות שטוח צדדית 11 ס עם הצד השטוח (איור 2א), לקדוח חור בקוטר 6 מ מ עם המרכז 1.0 ס מ מהתחתית וממורכז בין הצדדים של הצינור.
הערה: מקדחה המיועדת פלסטיק אמור לשמש. - עם כלי deburring מסתובב, להחלקת קצות החור (איור 2E) ולעשות 4 חריצים מבפנים הקצה של החור (איור 2E, הזחה) כדי להקל על ניקוז של החור במהלך הסיבוב.
- עם חור 12 מ"מ אגרוף, לחתוך דיסקים בקוטר 12 מ"מ גליונות גומי סיליקון דבק צדדית כפולה רעיל. באמצעות אגרוף נייר חור אחד רגיל (6 מ מ קוטר), לעשות חור במרכז כל דיסק.
- לשטוף את צינורות קדח עם 70% אתנול, אוויר יבש אותם בבטיחות ביולוגית ארונית, ולחטא הצינורות ודיסקים דבק מנוקב למשך 40 דקות תחת מנורת UV (30 W במרחק ממוצע 70 ס"מ) בארון הבטיחות הביולוגי.
- למקם מחדש את צינורות ודיסקים לאחר 20 דקות כך כל המשטחים החשופים סטריליים. תחת תנאים סטריליים, לקלף את וייט מוותר מדיסק דבק, ולהצמיד את גומי סיליקון החיצוני של שפופרת, יישור החורים (איור 2F).
התראה: כדי למנוע חשיפה UV, לענוד הגנה העין וסגור הקבינט לפני להדליק את מנורת UV. - נקה 12 מ מ קוטר photoetched (100 מרכז ממוספרים 1 מ מ ריבועים) גרמני coverslips זכוכית דקה. החזק את coverslips בעדינות עם מלקחיים וטבול אתנול מוחלטת, ואחריו מים, ואחריו שוב, אתנול מוחלטת, בסופו של דבר לטבול את coverslips ב להבה לשרוף האתנול. לאפשר coverslips להתקרר.
- מחזיק את coverslips עם מלקחיים, לטבול בתוך 2% 3-aminopropyltriethoxysilane ב אצטון עבור שטיפה ס' 10 על coverslips במים הנדסה גנטית, לאפשר לאוויר יבש.
- להגדיר את coverslips על נייר סינון סטרילי בתוך בטיחות ביולוגית ארון, תדליק אור UV. לחשוף בכל צד של coverslips כעשרים דקות.
התראה: כדי למנוע חשיפה UV, לענוד הגנה העין וסגור הקבינט לפני להדליק את מנורת UV.
3. בהיפוקמפוס פרוסה הכנה
- לפני שמתחילים את הקרע, היכונו חצאים של סכיני גילוח פיפיות למסוק רקמות. מקפלים את הלהבים לאורכו בזהירות עם האצבעות והכנס לשניים.
- יש לשטוף את החצאים להב עם אצטון באמצעות מקלון צמר גפן כדי לנקות אותם, ולאחריה שטיפה מוחלטת אתנול, אוויר ייבוש.
הערה: פרוטוקול התרבות פרוסה המוח היא עצמאית של עכבר או חולדה זן או גנוטיפ. קווים העכבר הטרנסגניים רבים עם רקע גנטי שונה שימשו.
- עם מלקחיים, להחזיק את הצד האחורי של המוח החתוך למעלה ואת הצד הבטני כנגד הצד של הפטרי ליציבות. בעדינות להקניט קרומי המוח נמצא סביב האמצע הסאגיטלי ולהסיר את רקמת המוח האמצעי באמצעות בסדר משופעת דומונט #5 מלקחיים (איור 3C, עיגול מקווקו).
- לעשות שני חתכים לאורך הצד של המוח, כדי להפיץ את זה פתוח (איור 3C, קווים מקווקווים). ברגע המוח ממוקמת בצד הגבי למטה ופתח כפולה, פיסורה בהיפוקמפוס אמור להיות גלוי (איור 3ד', חץ).
- להעביר את המוח פתוח התפשטות חתיכה של הסרט פלסטיק polychlorotrifluoroethylene ומקם אותה שמגיע על הבמה של מסוק רקמות. להרטיב את הסכין עם GBSS/גלוקוז וקוצצים ההיפוקמפוס לפרוסות עבות ~ 300 מיקרומטר.
- עם פיפטה העברה, לרוקן את המוח הפרוס מהסרט פלסטיק לתוך תבשיל טריים 60 מ מ המכילה GBSS/גלוקוז (איור 3E). בעדינות לצבוט את ואת לקנטר משם, עם מלקחיים משופעת בסדר, קרומי המוח הנותרים ורקמות אחרות שאינן בהיפוקמפוס (איור 3F) מ. הפרוסות (איור 3G, H).
4. ציפוי פרוסות
- פעם אחת פרוסות הושגו, מקום 2 µL של עוף פלזמה על המרכז בצד photoetched coverslip מוכן. מורחים פלזמה מעט כדי להשיג נקודה בקוטר 3-4 מ מ.
הערה: הצד photoetched הוא הצד העליון של coverslip כאשר צפו דרך מיקרוסקופ ניתוח כזה כי המספרים הם שכיוונו כראוי. - העבר 1 פרוסה המוח עם מרית צרות-קצה סטרילי (איור 4א') במקום פלזמה (איור 4B). להשתמש מלקחיים סגורות כדי לשמור על הפרוסה בקצה מרית כשאתם מרימים את הפרוסה GBSS/גלוקוז.
- תיגע המרית כדי לזהות את coverslip, ועם מלקחיים סגור הפלזמה, לדחוף את הפרוסה על גבי coverslip.
- 2.5 מיקס µL של פלסמה עם 2.5 µL של תרומבין בשפופרת נפרדים. במהירות מקום µL 2.5 של תערובת זו מעל ומסביב את הפרוסה ואת pipet למעלה ולמטה בעדינות לערבב את זה (איור 4B).
הערה: הפלזמה ייקרש בתוך 10-15 s, כך זה צריך להיעשות במהירות. אם הפרוסה אדהזיה היא בעיה, מערבבים 5 µL פלזמה עם 5 µL תרומבין ולהשתמש µL 4-5 על הפרוסה, הסרת לאחר ערבוב כך הפרוסה שקרים שטוח על coverslip. - הסר את כיסוי מן הצד החשוף של הדבק גומי סיליקון בעבר למוט צינור רולר הפלסטיק ברור ולמקם את coverslip עם הפרוסה המוח על גבי הדבק יישור הפרוסה בתוך החור (איור 4C).
- כדי להבטיח הדבקות, החל רכים, הלחץ אפילו coverslip עם האגודל על ידי לוחץ את coverslip באופן שווה ואני שומר את זה בשביל בערך 1 דקות בעת העברת אותו בארון לבטיחות ביולוגית.
- ב- cabinet בטיחות ביולוגית, להוסיף 0.8 מ ל א Neurobasal מלאה תרבות בינוני (טבלה של חומרים) כל שפופרת (איור 4D).
- זרימה של 5% CO2/95% תערובת אוויר דרך סטרילי מחובר כותנה פסטר פיפטה מוחזק באופן מאובטח על ידי מלחציים. לשטוף את הצינור רולר עם תערובת גז, במהירות קאפ הצינור כמו זה נסוגה מפני סביב פיפטה.
- תווית הצינורות עם המספר פרוסה, לצבור מספר. הכנס צינורות לתוך ארון רולר, להבטיח שהם מאוזנים גיאומטריים. אם יש מספר אי-זוגי של צינורות, להוסיף צינורות כדי לאזן.
- למקם את המדפים חממה רולר 35 ° C עם רולים מפנה המדף רולר-על 10-13 RPH (איור 4E). כדי לשמור את המדיום בתחתית של הצינורות, הטיה החממה בחזרה כ 5° באמצעות העלאת החזית על לוח.
- הזן את מספר פרוסה, שפופרת לתוך גיליון אלקטרוני, אשר משמש כדי להקליט את כל המידע של טיפולים פרוסה ותאריכים תצפית.
- על יום 6 בתרבות, להוסיף 1 µL (0.002 U) של פלסמין פעיל כל שפופרת.
- לאחר הקרישים מתמוססים לחלוטין (בדרך כלל תוך מספר שעות), להסיר את המדיום, והחלף אותו בינוני טריים ללא פלסמין. במידת הצורך, פרוסות יכול להיות מודגרות עם פלסמין בן לילה, המדיום השתנה ביום למחרת.
- פרוסות בדרך כלל מודגרת למשך 7-10 ימים לפחות לפני שימוש בניסויים. האחות בינונית ולהחליפו ביום 3 או 4, שוב על יום 7 ולאחר כל 7 ימים לאחר מכן.
5. הכנה של וקטורים ויראלי ביטוי Transgene
הערה: הביטוי של transgenes בנוירונים של תרבויות פרוסה מושגת או באמצעות המוח של מכרסמים מהונדס גנטית, או על ידי החדרת את transgene על ידי הידבקות בווירוסים לקוי שכפול רקומביננטי.Adenoviruses (AV), adeno-הקשורים וירוסים (AAV) ו- lentivirus רקומביננטי וקטורים כל היו בשימוש בתרבויות שלנו פרוסה בהיפוקמפוס להבעה של חלבון פלואורסצנטי שונים כימרות פרוסות המוח.
- להכין שכפול AV לקוי לביטוי את הרנ א עניין על פי השיטות שתוארו במקום אחר13,14. כייל נוגדנים וירוסים זיהומיות U/mL בשיטת דילול סדרתי באמצעות נוגדן כדי לשווק ביטוי חלבון כמו שמתואר14. לצפות cofilin אגרגטים היווצרות רוד cofilin-אקטין, לנצל את ה-cDNA cofilin-R21Q-mRFP (פלסמיד #51279)16.
הערה: האמרגן 1 synapsin היא בחירה מצוינת עבור ביטוי מסוים עצביים15, בעוד האמרגן cytomegalovirus שימושית עבור נהיגה רמות הביטוי גבוהה סוגי תאים רבים13. - להכין AAV על ידי שיתוף תקנים של העברת פלסמיד המכיל את הגן עניין פלסמיד נציג/כובע, עם או בלי פלסמיד המסייע, לתוך תאים אריזה HEK293, אשר מספקים את הגן E1 ויראלי, כפי שתואר לעיל17,18.
הערה: Recombinant AAV יכולים להתבצע גם להכנסה יישוב לתוך הגנום התא המארח19. עבור פלסמיד העברה, אנו משתמשים אנושיים cofilin 1 מסומן C-מסוף mRFP1 קרינה פלואורסצנטית חלבון (פלסמיד #50856) משובטים לתוך synapsin המכילים מקדם AAV פלסמיד במורד הזרם חיישן GCaMP5G סידן20. פיסת דנ א קידוד הרצף פפטיד P2A עצמית שהפריד נוסף באמצעות PCR בין GCaMP5G ו- cofilin-RFP במהלך הכנת פלסמיד העברה למתן ביטוי של חלבונים שתי התמליל AAV יחידה21. - הכן lentivirus רקומביננטי וקטורים באמצעות שיתוף תקנים של העברת פלסמיד המכיל את הגן או cDNA של אותות עניין ואינטגרציה, יחד עם lentivirus הדור השלישי אריזות תערובת המחלק את איסור פרסום ויראלי, פול פוט, rev ו גנים vsv-g על גבי שלושה פלסמידים נפרד22,23.
- עבור פלסמיד ההעברה, השתמש צעד אחד שכפול מערכת24 להרכיב את המקדם סינפסין ואת cDNA cofilin-R21Q-mRFP (מ פלסמיד #51279) לתוך pLKO.1-GFP (פלסמיד #30323), עם יזם סינפסין ו cofilin-R21Q-mRFP מחליף את hPGK יזם ו- GFP cDNA, בהתאמה.
- Transfect את פלסמיד הסופית לתאי HEK293T על ידי סידן פוספט כפי שתואר לעיל23.
- לאסוף בינוני ארבע המנות 10 ס מ, להתרכז כדי 500 µL באמצעות רכזים צנטריפוגלי 150 אלף דולר-הפסקת, לאחסן את lentivirus הסופית ב-80 מעלות צלזיוס aliquots קטן לאחר הקפאה מהירה בחנקן נוזלי. להפשיר רק פעם אחת aliquot שמאחורי הדבקת תאים.
- לקבוע מדעית שהנפח של כל סוג הוירוס מוכן להשיג את מידת הביטוי הרצוי על-ידי הגדרת מספר תרבויות פרוסה שונים לעקוב אחר הביטוי של transgenes לאחר ההדבקה עם כמויות שונות של וירוס.
הערה: בדרך כלל, µL 1-10 של וירוס משמש לחתיכה.
6. פרוסה טיפולים
- מדביק פרוסות עם וירוס
- עבודה של בטיחות ביולוגית הקבינט אישר עבור וירוס עבודה ברמת בטיחות ביולוגית מתאים וקטור, מערבבים aliquot של הנגיף (בדרך כלל 1-10 µL) 0.8 מ של מדיום מלאה.
- האחות האמצעי הפרוסה באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר למלכודת אוסף המכיל אקונומיקה. מלכודת משני משמש תמיד בין המלכודת הראשונה המקור ואקום.
- החלף בינוני aliquot המכיל וירוס המוכן מעל, לחזור הצינורות תרבות מתלה, ולמקם בחממה.
- אחרי 2-5 ימי המקננת את הפרוסות עם וירוס בארון הבטיחות הביולוגי, להסיר את המדיום המכיל וירוס עם פיפטה העברה סטרילי ולמקם אותו לתוך בקבוק המכיל סוכן אנטי ויראליים שאושרו להרוג וירוס.
- צביעת של נוירונים עם צבע חיוני
- להכין ולאחר לאחסן aliquots של הפלורסנט חיוני עצביים25 על-ידי µL 4 הקפאה מהירה של aliquots בחנקן נוזלי-ריכוז של 100 מיקרומטר ולאחסן אותם ב-20 ° C. לא ההקפאה/ההפשרה לצבוע יותר מפעם אחת.
- תווית נוירונים להמחשת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, להפשיר aliquot אחד של לצבוע חיוני עצביים, לדלל עד 4 מ"ל במדיום Neurobasal מלאה (ריכוז לצבוע הסופי הוא 100 ננומטר).
- הסר את המדיום פרוסות על-ידי שאיפה (או עם פיפטה העברה אם המדיום מכיל וירוס) ולהחליף אותו עם 0.8 מ של המדיום המכיל 100 ננומטר לצבוע חיוני עצביים. להחזיר את הפרוסות מנגנון רולר בחממה.
- לאחר המקננת הפרוסות כבר שעתיים, תשאף המדיום המכיל צבע והחלף אותו 0.8 מ של טרי במדיום בטיחות ביולוגית ארון שלם.
הערה: תיוג של נוירונים פרוסות עם צבע חיוני דורש כמה שעות של דגירה. תמונות ראשונות נלקחים בדרך כלל 24 שעות לאחר טיפול צבע. למרות נוירונים מסומנות באופן ספציפי, יש קרינה פלואורסצנטית רקע זה מסרב לתת יותר עצביים הדמיה במשך 2-3 ימים. עוצמת לצבוע חיוני מסרב לאחר 72 h. - כדי לבצע שינויים מורפולוגיה פרוסה לאורך זמן, relabel את הפרוסות מדי 7 ימים.
7. פורסים הדמיה
- להציג פרוסות על מיקרוסקופ הפוכה. עבור הדמיה פלורסצנטיות המבריקים, ב- 24 שעות לפני הדמיה, חילופי תרבות בינונית בינונית Neurobasal A מלאה ללא מחוון ה-pH פנול אדום.
הערה: לניסויים דיווחו כאן, פרוסות נצפים על מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות דיסק מסתובב הפוך מצויד פונקציה קווית מקודד x, y הבמה עם אלמנט פייזו z ובקרה מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה רגיש. - העברת הצינור עם התרבות פרוסה לדימות של המנגנון צינור רולר לפני מחזיק שפופרת בהזמנה אישית (איור 5א), אשר ממוקם המתאם הבמה (איור 5B), כדי לשמור על coverslip בניצב המטרה לשמור על הפרוסה בכיוון זהה במהלך מפגשים הדמיה חוזרות על מרווחי זמן.
- לדחוף את המחוון על המתאם הבמה צמוד על צינור כדי להחזיק את הצינור בעמדה (איור 5B).
הערה: פרטים של בעל שפופרת, שלב מתאם, ניתן לגשת חימום: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
הערה: העמדות את סט מסימן fiducial לאפשר פיתוח עקבית של coverslip באותו המיקום בעת הפרוסה הוא עם תמונה, אף-על-פי המקורי x, y הגדרה של הסימן fiducial משנה כאשר מתאם צינור או שלב הם להסיר והחליפו.
הערה: התמונה מטוסים מתקבלים בדרך כלל במרווחים של 0.5 מיקרומטר 2 מיקרומטר, תלוי בגודל הרזולוציה הרצויה של תכונות התמונה. בניית תמונה תלת-ממד באיכות דורש כי תכונות תמונה להתמשך על פני מישורים מרובים של רכישה, אז כדי להמחיש התכונות קטנים יותר, במרווחים קטנים יותר יש צורך בין מישורי.
הערה: רוב ההפעלות הדמיה דיווחו כאן היו תחת 18 min/פרוסה. עם זאת, לנו יש תמונה כמה פרוסות עשר או יותר פעמים, אפילו בתור עוד 40 דקות במושב בודד, ללא פגיעה נראית לעין ההישרדות לטווח ארוך של הפרוסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע במדויק איך יכול להיות מנוצל סימני fiducial כדי reimage אותם התאים בתוך אותם שדות לאורך זמן, בדקנו פרוסות גדל על coverslips photoetched (איור 6א). נוירונים היו דמיינו ידי מכתימה עם צבע חיוני (100 ננומטר עבור 2 h; אינו מכתים תאים שאינם עצבית), אשר נעלם נוירונים לאורך זמן מבלי לפגוע בתאים25. זיהינו fiducial של מארק בכיכר רשת יחיד (איור 6A, B), נמצא באזור של נוירונים התווית על-ידי צבע חיוני 24 שעות אחרי תיוג, הקליט את x ואת y לקזז עמדות מסימן fiducial (איור 6B), אסף, באמצעות יעד X 60, אוספי תמונות קונאפוקלית של האזור, חוזרים ההדמיה ב- 4 ימים רצופים. תמונות תמונה מוקרנת מרבי של 30 מיקרומטר בערימה תמונות שצולמו באותו מיקום מוצגים (איור 6C-F). למרות כמה שינויים מורפולוגיים להתרחש בתוך האזור במשך 4 ימים, ניתן בעקבות של תאים זהים (כמה מהם מסומנים) לאורך זמן. עוצמת קרינה פלואורסצנטית לצבוע חיוני ירדה לאורך זמן אבל העצב היו עדיין בבירור 4 ימים לאחר תיוג. אף על פי רוב פלורסצנטיות עצביים צבע חיוני היה מפוזר בתוך הציטופלסמה, מכתים punctate כמה תמיד נצפתה, ואשר הפך יותר בולט כמו רקע זריחה נדחה. פרוסות לא בריא, צביעת punctate של תאים שאינם עצבית גם נצפתה כמו פרוסות חלה הידרדרות. תוצאות אלו מדגימים כי תאים מזוהה פרוסות יכול שוב ושוב לדימות באמצעות סימוני fiducial כדי למצוא אותם.
לבחון שינויים תלויי-זמן הארגון עצביים הכדאיות בתוך פרוסות במהלך תרבות לטווח ארוך, עקבנו הפרוסות הרגילות מעל 5 שבועות, תיוג עם עצביים חיוני הפלורסנט פעם בשבוע 24 שעות לפני הדמיה. מספר סיבובים של צביעת עם צבע חיוני זה על פני מספר שבועות גדל הצטברות של אגרגטים. נוירונים בתוך פרוסות טרי מצופה כי היו עדיין קרישי פלזמה טעון עם צבע, עם תמונה-יום אחד במבחנה (1 DIV). הפרוסות הרגילות היו עם תמונה שוב פעם בשבוע למשך 5 שבועות. תמונות המתקבל פרוסה אחת עם יעד 4 x מוצגים (איור 7א-י). שכבות תאים כפירמידה האזורים CA ודי. ג'י מסומנות בצבעים בהירים כשהוא מתרגש-488 ננומטר, קרינה פלואורסצנטית פליטה נמדד ב > 620 ננומטר. על פני תקופה 5-שבוע של התבוננות פרוסות 19, שלוש פרוסות ירד את coverslip, שניים אחרים איבדו שלהם מורפולוגיה אופיינית והפך אטום, מעיד על מותם. לפיכך, יש לקחת בחשבון את שיעור ההישרדות של 70% לניסויים, ועל פרוסות להכין להבטיח מספר הולם לצורך ניתוח. פרוסות הוכנו-הגדרה נומינלית עובי למסוק רקמות של 300 מיקרומטר. לאחר 5 שבועות בתרבות, מדדנו את עובי הפרוסה על ידי הדמיה עצביים חיוני שהוכתמו לצבוע פרוסות coverslip למעלה דרך הפרוסה עם יעד שמן 40 X במיקרוסקופ קונפוקלי של הדיסק מסתובב. אובדן המיקוד של נוירונים התרחש בממוצע של 257 nm (n = 5 פרוסות עם מיקומים מרובים בשימוש לכל פרוסה), הממחיש את מעט מאוד דליל של הפרוסה אירע מימי ציפוי. אנחנו יכולים לא למדוד במדויק את עובי הפרוסה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בזמנו של ציפוי כי לצבוע חיוני לכודים בתוך קריש פלזמה נתן ' מאטום לשקוף ' קרינה פלואורסצנטית ומקשה למדוד במדויק את המיקום שבו אירעה אובדן המיקוד. עם זאת, תמונות 3D של נוירונים בתוך פרוסות מתקבלים בקלות לפרוסות לאחר שקריש פלזמה יוסר. הפרוסה DIV 21, מוצג בהגדלה נמוכה ב- איור 7נ, צולמה עם יעד X 60 במיקרוסקופ קונפוקלי (1 מיקרומטר שלבים) 3 ימים לאחר טעינה עם לצבוע חיוני עצביים. תמונת תלת-ממד מיקרומטר 60 נבנה מן המטוסים מוקד (איור 7גרם). נוירונים ותהליכים neurite שלהם עם התווית עם לצבוע חיוני ניתן בעקבות ב- 3D. במבנה התלת-ממדי של פרוסות ומורפולוגיה היו מתוחזקים היטב במשך לפחות 3 חודשים, התקופה הארוכה ביותר היו בשימוש במחקר הנוכחי.
שינויים משמעותיים המורפולוגיה של עמדה בעבר שבעורך התרחשו גם כמה פרוסות, מציעה את התנועה של הפרוסה על coverslip יכול להתרחש. בהחלט, על מרווחי זמן ארוכים בין הדמיה היא הפכה קשה יותר לדעת בוודאות התאים בשדה להיות עם תמונה היו זהים לאלו שנצפו בהפעלות הדמיה קודמות. לפיכך, להראות תמונות תמונה מוקרנת מרבי של ערימות קונאפוקלית של פרוסות חיוני התווית על-ידי צבע, רכשה במיקום זהה עם המטרה 60 x במרווחים שבועיים הנמשכים 4 שבועות (איור 8) הכדאיות עצביים מתוחזקות היטב. אבל שזה קשה לזהות נוירון מסוים לאורך זמן כאשר מתקבלים תמונות עם מרווחי זמן ארוך בין ההפעלות. יש להניח התבנית של תאים המסומנת fluorophores מרובים יהיה המוכר יותר בקלות, כמו הם תאים בקבוצות מקומי בעת שנצפה על ידי גלילה באמצעות אוסף תמונות.
כדי להעריך את התועלת של וקטורים ויראלי שונים עבור החדרת גנים אקסוגני הנוירונים בהיפוקמפוס פרוסות, השווינו infectivity פרוסה באמצעות AV, AAV רקומביננטי וקטורים lentiviral, כל ביטוי שונה פלורסנט תגיות או באמצעות היזמים שונים לביטוי נסיעה. AV (2 x 107 U/המדבק) לבטא cofilin-mRFP מאחורי חזקה, התא הלא ספציפית CMV מקדם שימש להדביק חתיכה בהיפוקמפוס העכבר שהיו בתרבית 9 שבועות על coverslips. הביטוי של cofilin-mRFP נמצאה לאורך הפרוסה ב 5 ימים לאחר הפגיעה, עם ביטוי האינטנסיבי ביותר ברחבי הפריפריה פרוסה כפי שנצפה עם יעד 4 x (איור 9א). תאים בתוך הפרוסה לבטא cofilin-mRFP נצפו גם עם יעד X 20 (איור 9ב') עם כמה כתמים punctate בהיר ומפוזר גם ביטוי נוירונים והן תאים שאינם עצבית. לאחר שבועות 17 בתרבות (8 שבועות לאחר הפגיעה), cofilin ספונטנית-מוטות גיבש בתאים מסוימים, ככל הנראה מונע על ידי ביטוי פראי סוג cofilin-mRFP (איור 9ג)26,27.
אנחנו גם הדגימו כי AAV (חלקיקי10 10) ניתן להשתמש להבעה פרוסות.תמונות של פרוסות נגוע ב 9 שבועות בתרבות עם AAV, שבו נסעתי מקדם synapsin עצביים מסוימים הביטוי של GCaMP5-cofilin-mRFP עם רצף פפטיד P2A עצמית שהפריד מקשר של polyprotein מתורגמת21, היו 8 שנתפסו שבועות לאחר הפגיעה (17 שבועות בתרבות). בנוירונים לבטא את GCaMP5 ואת cofilin-mRFP, cofilin כמה מוטות/אגרגטים הקימו (איור 9D-F). עוצמת קרינה פלואורסצנטית המוטות/מצרפי הייתה כל כך חזקה כי מעט מאוד זריחה של cofilin-mRFP ' מאטום לשקוף ' יכול להיות שנצפו ללא רוויה מלאה וגם פורחת בתמונה זריחה cofilin של מוטות. מוטות cofilin ספונטנית מופיעים נוירונים שבו כימרות פראי-סוג cofilin-פלורסנט חלבון יש כבר ביטוי יתר26,27, וכן ב הדגיש נוירונים10. בהתבסס על titers של אדנו, אשר נקבעים על הבסיס של infectivity14 ו את ספירת חלקיקים המשמשת לקביעת AAV כייל נוגדנים, מקפלים כ 100 עד 500 מספרי החלקיקים גבוהה יותר של AAV יש צורך לקבל בערך את אותו infectivity / הביטוי פרוסות בהשוואה באב.
לעקוב רקומביננטי בתיווך lentivirus ביטוי של חלבונים פלורסנט פרוסות פרוסות נדבקו 6 DIV עם 1, 3, 10, ו 30 aliquots µL של lentivirus רקומביננטי עבור ביטוי מסוים עצביים (סינפסין יזם) של cofilin-R21Q-mRFP, פיתח כמו תא חי הדמיה רגש cofilin-אקטין רוד היווצרות16. פרוסות היו עם צבע חיוני עצביים-11 DIV תוויות, עם תמונה אזורים ספציפיים עבור צבע והבעה cofilin-R21Q-mRFP ב- 12 ו 14 חטיבת הפרוסה נגוע aliquot 30 µL של וירוס לא שרד עבור הדמיה אבל פרוסות triplicate שטופלו אמצעי אחסון אחרים של וירוס הראה ביטוי למינון של mRFP. איור 10 מראה תמונות של פרוסות נגוע 1 µL ו- 10 µL של lentivirus-6 ו- 8 ימים לאחר הפגיעה. אזורים מרובים של שתי פרוסות שונים היו לכמת עבור צביעת משותפת של נוירונים עם צבע חיוני, ביטוי mRFP. עבור פרוסות נגוע µL 1 של lentivirus, כ-28% על נוירונים הביעו mRFP ב 6 ימים לאחר הפגיעה, גדל ל 85% על ידי 8 ימים לאחר הפגיעה. עבור פרוסות נגוע 10 µL של lentivirus, כ- 58% של נוירונים הביעו mRFP ב 6 ימים לאחר הפגיעה, 86% והגדילו 8 ימים לאחר הפגיעה. לפיכך, 1 µL של lentivirus היה מספיק כדי לספק infectivity פרוסה נרחבת וביטוי העצבית על-ידי 8 ימים לאחר הפגיעה.
כדי להדגים את מערכת תרבות זו שימושית בפיתוח הבאים של פתולוגיה cofilin, פרוסות נגוע lentivirus לביטוי cofilin-R21Q-mRFP בנוירונים נותרו אינו מטופל או שטופלו עם ריכוזים שונים (1 מיקרומטר, 333 ננומטר, ו- 100 ננומטר) של סינתטי האנושי Aβ חלבון שעברו הדגירה טופס oligomers28. תוצאות של מחקרים קודמים הדגימו את Aβ סינתטיo זירוז cofilin-אקטין מוטות עד 25% של נוירונים בהיפוקמפוס הפומבית29,30,31. כל שלוש פרוסות שטופלו 1 מיקרומטר ריכוז Aβ השתחרר מן coverslip ב- 24 השעות הראשונות, ואילו כל רכב פרוסות (בקרה) ובא אלה שטופלו 333 nM ו- 100 ננומטר ריכוזי, Aβ שרד במשך השבועיים זה. עקבו. התאית האזורים זהה (CA1, CA3 ודי. ג'י) בפרוסה שטופלו 100 ננומטר Aβo היו עם תמונה (המטרה x 60) במשך מספר ימים. פרוסות בקרה אשר נדבקו על 6 DIV עם lentivirus לביטוי סינפסין מונע cofilinR21Q-mRFP היה הביטוי ' מאטום לשקוף ' mRFP תאית על ידי 15 DIV (איור 11א). פרוסות נחשפים 100 Aβ ננומטרo ב- 14 DIV, עם תמונה-15 DIV הראו כי ההתפלגות של cofilin-R21Q-mRFP הפך punctate, המופיעים בשני מוט בצורת מבנים, אגרגטים (איור 11ב'). מבנים אלה הפך בולט אפילו יותר 6 ימים לאחר טיפול Aβ (איור 11ג, אשר באותו השדה של תאים כמו באיור 11ב'). במקומות רבים עשירים neurites איפה דופאמינרגיים somas נעדר (איור 11D), פיתח מערכים punctate דמוי מוט של cofilinR21Q-mRFP (חיצים איור 11C), דומה להתפלגות של cofilin-אקטין מוטות דיווח בעבר בתוך neurites של נוירונים שטופלו Aβ ב תרבות29,30,31. לפיכך, שיטה חדשה עבור culturing והתבוננות פרוסות בהיפוקמפוס יאפשר למשתמשים לקבוע את הכדאיות לטווח של תאים ב- cofilin אשר אגרגטים וטופס מוטות של הפיכות של הפתולוגיה בשלבים שונים של פיתוח, ועל מנת בקלות לבצע מדידות מנה-תגובה על ריאגנטים שעלולים לחסום או הפוך להיווצרות הפתולוגיה cofilin עוד אין ויוו-כמו ארגון הסלולר.
איור 1: הכנת מתלה צינור רולר. תבנית (א) לסימון מיקומי החורים לקידוח החוצה תחתיות צלחת של תרביות רקמה 15 ס מ. אם הדמות מודפס לגודל של סרגל קנה מידה המוצג, הוא יכול להיות לגזור, המשמש לסימון את העמדות על צלחת תרבות 15 ס מ עבור קידוח החורים המוצג. (B) הושלמה רולר צינור לארון תקשורת עם שני צינורות מוכנס. כל ארון תקשורת ממוספר על-גבי מדבקה גלויים בקלות על המדף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הכנת הצינורות תרבות רולר. (א) בחזית הצג של הצינור רולר מוכנס ג'יג במכונת דפוס מקדחה קידוח דרך החור 6 מ מ בצינור. קו מקווקו מציג את המיקום של הצינור רולר צדדית שטוח לרעתנו. (B) סוף תצוגה של התוכנית עם הצינור מוכנס, קודח הסיביות מיושר מעל החור. (ג) מבט מלמעלה של החור. החגיגה קידוח החוצה רולר צינורות עם מקדחה 6 מ מ.חץ לבן מראה את המיקום של הציפורן ניתוק נוסף כ עצירה לצורך מיקום הצינורות, קווים כפולים שחור קצת ליישור. האביב (D) סרטונים (חץ שחור) מותקן בתחתית לרקדן כדי בצורה מאובטחת שיצמיד אותו מיקום כאשר קידוח צינורות. (E) אחרי קידוח דרך החור, הקצוות הם החליק עם כלי deburring, חריצים נחתכים בצד הפנימי של החור (שיבוץ מראה החור צפו ב דרך מיקרוסקופ דיסקציה) כדי לשפר את ניקוז בינוניים מהחור במהלך הסיבוב ברכבת התחתית. תרבות (F) צינור עם החור המיושר חור דבק גומי סיליקון, שאליו תצורף את coverslip. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכנת פרוסות המוח hippocampal. תמונות שצולמו עם הצגה מיקרוסקופ לנתיחה: מוח העכבר שלם (A). המיקום של חתכים להסיר הקדמי, המח מוצגים כקווים מקווקווים כחול. (B) לאחר הסרת הקדמי, המח. (ג) חלק של המוח B ערק 90 ° עם אחורי (לכיוון המוח הקטן) פונה כלפי מעלה. מיקום היצירה ליד הצד של המנה מסייע עם ההסרה של המוח האמצעי (עיגול מקווקו כחול) אשר יכול שיציקו מן הנותרים היפוקמפוס, תלמוס, ההיפותלמוס. שני חתכים עם המלקחיים (קווים מקווקווים כחולים) מאפשרים את הפיסה האחרונה המכיל ההיפוקמפוס בין שתי ההמיספרות מפוזרים במול. (ד) המוח שעברו שיטוח חתיכה מציג את כלי הדם לאורך של פיסורה בהיפוקמפוס (חץ כחול). רקמה זו היא מונחת הסרט פלסטיק והעבירו למסוק רקמות שמגיע בכיוון של הקו המקווקו. (E) חתוכים רקמת מראה מעט יותר ממחצית ההיפוקמפוס לאחר מוחזר GBSS/גלוקוז. (F) הקרע הסופי של ההיפוקמפוס וניקוי הפרוסות כדי להסיר חומר שאינו בהיפוקמפוס. (G) צף מספר פרוסות לאחר ניקיון סופי. (H) צילום מוגדל של פרוסה אחת לשם העברה אל coverslip. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : משוריין, ומוכנסות פרוסות. (א) א העכבר פרוסה בהיפוקמפוס יוסר המנה תרבות על קצה מרית משתמש הקצה של מלקחיים כדי לעזור להרים את זה חינם מהפתרון. (B) הפרוסה ממוקמת במול במרכז photoetched וטיפל 12 מ מ coverslip ב 2 µL של עוף פלזמה ומצורפת עוד 2.5 µL תערובת 1:1 פלזמה/תרומבין ליצירת קריש דם. (ג) לאחר שקריש מוגדר (בערך 1-2 דקות), הכיסוי יוסר מעגל דבק גומי סיליקון על צינור רולר, coverslip ממוקם עם קריש הדם מרוכז לתוך החור; אז coverslip במקום עם אגודל של מתג החזיק בעמדה עבור 1 מינימלית (D) הוסף 0.8 מ של מדיום תרבות שלמה. רולר (E) צינור מחזיקי בתוך חממה הרים גדולים עם החזית הרים כדי להטות 5 ° כדי לשמור על המדיום בחלק התחתון של הצינורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מחזיק שפופרת רולר, הבמה צלחת חממה. (א) מחזיק שפופרת הממקמת את הצינור כך coverslip נשמר במצב הדמיה את. (B) מחזיק שפופרת רכוב בצלחת מתאם הבמה מיקרוסקופ. המחוונים על הצד החזק את הצינור בצורה מאובטחת עבור הדמיה. (ג) שלב מתאם עם הלוחות מחזיק וצד צינור נוסף המכיל רצועות חימום מחובר בקר טמפרטורה תרמואלקטרי. ברגע צינורות רכוב וממוקמים, ניתן להוסיף מלמעלה מוצק על התיבה כדי לשמור על הטמפרטורה במהלך דימות. חוט כתום הוא להוביל צמד תרמי. תוכניות עיצוב בניית הבמה המתאם והן דוד נמצאים לרשותכם: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : שימוש בסימוני fiducial עבור הדמיה חוזרות של תאים באותו. (א) בהיפוקמפוס פרוסה על photoetched coverslip (1 מ מ ריבועים) עם subiculum פרש (זנב) צפו עם 4 x תאורה שדה אובייקטיבית ובהיר. העקמומיות של צינור פלסטיק רולר מסייעת ליצירת של תאורה עקיפה המשפר את הפריט החזותי של הרשת. התיבה מציגה את המיקום ואת הגודל של שדה X 60. (B) A תצוגה של הפרוסה אותו עם יעד 20 x למציאת הסימן fiducial כתיאור של החלק תחתון של 4 מכיכר 34. Y ו- x ההיסטים מוצגים לאתר reproducibly המרכז של התיבה הרצוי עבור הדמיה קונאפוקלית הגדלה גבוהה יותר. (FC–) פרוסה המסומנת עצביים צבע חיוני ש-DIV 13 צולמה באמצעות מטרה 60 x ולהפוך תמונת הקרנה 30 מיקרומטר על 4 ימים רצופים (DIV 14-17). נוירונים זהים היו עם תמונה לכל יום. העמדה של הגרעין אחד של נוירונים שלושה מסומן עם סמל שונה. הם מזוהים בקלות רבה יותר על ידי גלילה אוספי תמונות כמו השינויים המיקום התלת-ממדיים שלהם מעט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : הדמיה נוירונים פרוסות עם צבע חיוני העצבית. (א) צבע חיוני עצביים צבעונית פרוסה ב פלזמה קריש דם שנלקחה 24 שעות לאחר ציפוי במטרה X 4. צבען (100 ננומטר) נוספה כאשר הפרוסה קודם היה להציב בעל שפופרת רולר, דהוי שעתיים מאוחר יותר.Subiculum מקופל סביב היונקים הקריש. (B–E) בעקבות פירוק קריש הדם על ידי פלסמין שמתווסף 6 DIV, הפרוסה נטען 5 פעמים עם לצבוע חיוני 24 שעות מראש הדמיה במרווחי זמן שבועי. הראו תמונות נאספו ב 8, 21, 28, 35 DIV (B–E, בהתאמה). פרוסה בהיפוקמפוס (F) תרבותי למשך 3 שבועות, מוכתם צבע חיוני עצביים 24 שעות מראש הדמיה במטרה X 4. (G) מחסנית קונאפוקלית של תמונות על הפרוסה אותו כמו F מציג תצוגה תלת-ממדית של מטוסים 61 שצולמו במרווחים 1 מיקרומטר. צבע חיוני עצביים תוויות בבירור neurites וגוף התא, אבל זה לא כלול מהגרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : חוזרות הדמיה של נוירונים במיקום יחיד של הפרוסה מעל 4 שבועות. תמונות תמונה מוקרנת מרבי של 30 מיקרומטר התמונה קונאפוקלית ערימות באותו השדה של תאים (על-ידי הצבת) פרוסות חיוני התווית על-ידי צבע, שצולמו 12, 20, 30 ו- 40 DIV (A–D, בהתאמה). קשה לזהות תאים בודדים שוב ושוב על מסגרות זמן ארוך יותר בתמונות הקרנה. אולם, אפילו על פני תקופות ארוכות אלה, זיהוי של אותם התאים אפשרי לעיתים קרובות על-ידי גלילה דרך המחסן תמונה או בניין תמונות 3D ניתן לסובב, כמו שמוצג באיור 7גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : הביטוי בתיווך ויראלי והדמיה של חלבונים פלורסנט. (א) פרוסה בהיפוקמפוס תרבותי במשך 9 שבועות ולא נגוע אדנו לביטוי cofilin-mRFP מאחורי מקדם CMV. הביטוי נמצא לאורך הפרוסה ב 5 ימים לאחר הפגיעה אך קרינה פלואורסצנטית היה המבריקים ליד הפריפריה פרוסה. (B) פרוסה באותו הראה ביטוי עמוק בתוך הפרוסה כאשר צפו במטרה X 20 תאים. התמונה היא שהשלכה של מחסנית של 20 תמונות במרווחים ביניהם 2 מיקרומטר. (ג) הפרוסה באותו נבדקה לאחר 17 שבועות בתרבות (8 שבועות לאחר הפגיעה), cofilin mRFP נצפתה ב מוט בצורת אגרגטים כפי שניתן לראות בתמונה זו השלכה מאוסף מיקרומטר 70 תמונות 23, בנפרד, 3 מיקרומטר עם מטרה X 40. (נד–) העכבר פרוסה בהיפוקמפוס נגוע ב 9 שבועות בתרבות AAV לבטא GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP מאחורי מקדם synapsin. קרינה פלואורסצנטית היה גלוי בערוצים גם אדום וגם ירוק לאחר 10 ימים. תמונת יחיד המטוס הפרוסה מציג הביטוי של GCaMP5 (D), עיתונאי רגיש סידן, (E) רבים המכילים cofilin מוטות (F) כיסוי תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10 : הביטוי של cofilin-R21Q-mRFP מונחה על ידי יזם synapsin בנוירונים נגוע רקומביננטי וקטורים lentiviral. זיהוי של אות חלש פלורסצנטיות נצפית לראשונה על ידי על 3-4 ימים לאחר הפגיעה באמצעות 10 µL של וירוס והופך להיות שמיש לפי 5-6 ימים, (E) כפי שניתן לראות בתמונות האלה רכשה עם יעד 60 x. אמנם זה לוקח זמן רב יותר כדי להשיג את הרמות באותו ביטוי עם µL 1 של וירוס, על-ידי זיהום שלאחר 8 ימים דומים אחוז גבוה של נוירונים (חיוני צבען מתויג) הבעת את cofilin-R21Q-mRFP. רק 27% של נוירונים היו חיוביים עבור mRFP זריחה ב- 6 ימים לאחר הפגיעה עם µL 1 (A, B), אבל זה עלה ל- 85% (C, D) ב- 8 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 11 : Aβ cofilin הנוצרות על-ידי אוליגומר פתולוגיה בפרוסות בהיפוקמפוס העכבר. כל התמונות שצולמו כתמונת 30 מיקרומטר ערימות עם יעד 60 x, מוצגים כתמונות תמונה מוקרנת מרבי. פרוסות היו נגועים cofilin-R21Q-mRFP-6 חטיבת פרוסה DIV (א) 15 שטופלו על DIV 14 עם רכב (דימתיל סולפוקסיד/ר' F12 בינוני המשמש ליצירת Aβo). (B) פרוסה 15 DIV שטופלו 100 ננומטר Aβo. (ג) באותו שדה כמו B שצולמו 20 DIV והן יוצגו ב (D) ככיסוי עם תווית צבע חיוני עצביים. חיצים מראים מערכים ליניארי של מוטות אגרגטים cofilin באזור הפרוסה המכיל neurites אבל מספר הנייד גופות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צינור רולר השיטה המתוארת כאן מאפשר לטווח ארוך culturing והדימות ברזולוציה גבוהה בשידור חי של רקמת המוח הפרוס. בעיה גדולה אחת עם טכניקה פרוסה כפי שהוא מיושם כאן הוא הרכבה ותחזוקה של פרוסות. ציפויים Coverslip התומכים אדהזיה פרוסה, לקדם פרוסה דליל על ידי שיפור את המוצלח neurites והעברה של תאים מחוץ הפרוסה; לכן, אנחנו נמנע השימוש של סובסטרטים אלה. הכניסה של קבוצות אמינו לתוך הזכוכית על ידי טיפול עם 3-aminopropyltriethoxysilane שיפור הדבקות של פרוסות, אבל פלזמה עוף קטן מדי או יותר מדי על coverslip עשוי גם לגרום לבעיות הדבקות מובילים לירידה פרוסה. נפח הפלסמה הדרושים עבור אדהזיה נכונה תלויה בגודל של הפרוסה המוח בתרבית, ובכך הוא גדול לפרוסות בהיפוקמפוס עכברוש, המהווים כ-4 פעמים גדול יותר באזור מאשר פרוסות המוח של העכבר. אם יותר מדי פלזמה ייקרש תחת הפרוסה, תא הדבקה על coverslip נפגע, טיפול עם פלסמין ישחררו את הפרוסה כך שהוא משנה את המיקום או מנתק לחלוטין. עם זאת, מעט מדי פלזמה ב קריש הדם עלול להוביל פרוסה אובדן במהלך הימים הראשונים של סיבוב בחממה. בניסוי זה התבצעה מעורבים פרוסות 39, שלושה אבדו אבל חלק לאלה שאבדו ייתכן נבעה נזק פרוסה המתרחשים במהלך התהליך עם פרוסות. למרות זאת, אנחנו בדרך כלל להכין כ-50% פרוסות יותר מאשר המספר המשוער לצורך הניסוי. הסיבה המובילה השניה של בעיות תרבות היא דליפה של מדיום סביב החותם coverslip. בעיה זו מחמיר כאשר coverslips לא נערכים בחוזקה במצב מתאים לפחות 1 דקות לאחר הדבקות אותם כדי החותם. חום מן האגודל משמש כדי להפעיל לחץ ככל הנראה עוזר להשלים את הידבקות. זליגת המתרחשות לעתים קרובות בצינורות אוויר זעירים תחת coverslip זה יכול להיות שנצפו עם מיקרוסקופ לנתיחה. אלה בדרך כלל נעלמים בעת שימוש לחץ ממושך. ניתן לצפות הפסד של-2% של תרבויות עקב דליפה איטית, ולכן מומלץ לחכות 10 ימים לאחר הגדרת התרבויות לפני ביצוע זיהומים וירליים. הלחץ האגודל מופרז, במיוחד אם המיוצר באורח לא אחיד על פני coverslip, יכול גם לגרום את coverslip לפצח. אם שבירה היא סוגיה, הקשה על הצינורות למטה שטוח על גבי משטח העכבר גומי חימם באינקובטור עשוי לעזור כדי לספק אפילו יותר לחץ על פני coverslip.
שתואר קודם לכן בשיטות לתרבות פרוסה המוח על ממברנות-הממשק אוויר נוזלי (מערכת פתוחה) או על coverslip של זכוכית בתוך צינור פלסטיק אטום (מערכת סגורה) יעילים מאוד לשרוד פרוסה לטווח ארוך, אבל לכל שיטה יש את החוזק שלה, חולשות. תרבויות פרוסה על ממברנות-הממשק אוויר נוזלי יתרון ללימודי אלקטרופיזיולוגיות משולב עם טבילה יעדים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה7, אבל יש חסרונות לגבי מציאת השדה המדויק של תאים עבור reimaging לאורך זמן, חשיפה אפשרית משתמש זיהום אובייקטיבי בעת שימוש ויראלי בתיווך גנים. השימוש וירוסים עבור ביטוי של transgenes הוא יותר קל לביצוע במערכת סגורה שבהם זיהום של מיקרוסקופ מטרות אינה מהווה בעיה. השיטה שלנו צינור רולר ששונה נותן גישה של הפרוסה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה, למרות שלא לבצע מחקרים אלקטרופיזיולוגיות.
תנאי התרבות פרוסה הוקמו באזורים רבים של המוח מכרסמים2, אבל כאן אנו מנצלים רק ההיפוקמפוס כי היא אחד מאזורי המוח נרחב ביותר למד השינויים המתרחשים ההיפוקמפוס הם עניין רב בלימודי פגיעה קוגניטיבית. שכבות תאים כפירמידה האזורים CA ודי. ג'י לשמר את הארגון שלהם במשך מספר שבועות בתרבות, ניתן בקלות לעקוב אחר מורפולוגית. אנחנו מסויימת של הכדאיות עצביים פלורסנט פיתח סמן25, אשר יש מאפיינים פלורסצנטיות, לאפשר לו להשתמש כדי לפקח על הכדאיות עצביים והארגון בתוך בהיפוקמפוס פרוסות על פני תקופות ימים חודשים, אך גם הוא תואם עם השימוש של רבים פלורסנט חלבונים אחרים, עיתונאים. למרות אופטימלית עבור זריחה NeuO25, אנחנו יכולים. להלהיב ב NeuO-488 ננומטר ולמדוד פליטות > 617 ננומטר. סימני fiducial על coverslips photoetched סייעו לאתר שוב ושוב לאותם התאים ימים רבים של תרבות ואיפשר לנו תמונה זהה באזורים הפרוסות במשך שבועות רבים. כמעט אין דילול משמעותי של הפרוסות אירע coverslips זכוכית ששונה דקה במהלך חמישה שבועות בתרבות, נקודת הזמן הארוך אשר השגנו מדידות עובי הפרוסה.
AV, AAV lentivirus רקומביננטי וקטורים לפעול גם לביטוי גנים אקסוגני לפרוסות. Lentivirus עם מקדם ספציפי עצביים יעיל במיוחד להשגת ביטוי באחוז מאוד גבוה (> 85%) של נוירונים בתוך 8 ימים לאחר הפגיעה. יתר על כן, נראה כי ניתן לנטר את הפתולוגיה רוד cofilin-אקטין הקשורים להתפתחות קוגניטיבית לספירה האנושי10,11 , Aβ overexpressing עכבר מודלים לספירה32 בתרבויות פרוסה שטופלו ריכוז נמוכה יחסית (100 ננומטר) של סינתטי האנושי Aβo. אנחנו לדמיין כי יישומים עתידיים של שיטה זו תכלול אפיון הרפוי חדש כדי להפוך cofilin-אקטין רוד פתולוגיה ו/או ליקויים הנכון דנדריטים בעמוד השדרה המתרחשים הפרעות נוירולוגיות רבות33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
