Summary
Presenteras här är en modifierad rulle tube metod för odling och intermittent högupplöst avbildning av gnagare hjärnan skivor under många veckor med precisa ompositionering på photoetched coverslips. Neuronala livskraft och slice morfologi är väl underhållna. Tillämpningar av detta helt slutna system med virus för celltyp specifika uttryck tillhandahålls.
Abstract
Odlade gnagare hjärnan skivor är användbara för att studera cellulära och molekylära beteendet hos nervceller och glia i en miljö som har bevarat många av deras normala in-vivo -interaktioner. Skivor som erhållits från en mängd transgena möss linjer eller användning av virala vektorer för uttryck av fluorescently märkta proteiner eller reportrar i vildtyp hjärnan skivor möjliggör högupplöst avbildning genom fluorescensmikroskopi. Även om flera metoder har utvecklats för imaging hjärnan skivor, kombinera segment kultur med förmågan att utföra har repetitiva högupplöst avbildning av specifika celler i levande skivor över långa tidsperioder inneburit problem. Detta gäller särskilt när virala vektorer används för uttryck av exogena proteiner eftersom detta görs bäst i ett stängt system att skydda användare och förhindra korskontaminering. Enkla ändringar som gjorts till metoden rulle tube hjärnan slice kultur som möjliggör repetitiva högupplöst avbildning av skivor under många veckor i ett slutet rörsystem redovisas. Odling skivor på photoetched coverslips tillåter användning av relaterat märken snabbt och precist flytta scenen för att bild fältet identisk med tiden före och efter olika behandlingar. Exempel visas för användning av denna metod kombineras med specifika neuronala färgning och uttryck att iaktta förändringar i hippocampus bit arkitektur, viral-medierad neuronala uttrycket av fluorescerande proteiner och utvecklingen av cofilin patologi, som observerades tidigare i hippocampus vid Alzheimers sjukdom (AD) i behandlingssvaret skiva med oligomerer av β-amyloid (Aβ) peptid.
Introduction
Primära kultur av dissocierade nervceller från regioner i hjärnan som gnagare är ett viktigt verktyg som används av forskare för att följa Svaren till patologiskt inblandad stimuli. Sådana studier har dock nackdelen med tittar på nervceller i bara 2D och utan deras gliaceller stödsystem. Dessutom, såvida inte odlas under förhållanden med mycket hög densitet (640 nervceller mm2 eller ca 16% av ytan) där det blir omöjligt att följa den slumpmässiga utväxten av en dendrite eller axon för mer än ett kort avstånd från sin cell kropp, Hippocampus neuronala lönsamhet minskar under 4 veckor avsevärt1, begränsa användningen av dissocierade kulturer för utökade studier av åldersrelaterade sjukdomar. Odling av skivor beredd från gnagare hjärnan är ett attraktivt alternativ som övervinner dessa begränsningar genom att upprätthålla en organiserad cell arkitektur och livskraft i veckor eller månader. Villkor för att upprätthålla många olika regioner av gnagare hjärnan i slice kultur har varit beskrivs2.
Två stora metoder används allmänt för långtidsodling av hjärnan skivor: odling på membran på luft-vätska gränssnitt3 eller odling på coverslips i förslutna rör tillåtet för att rotera i en rulle inkubator att ge luftning4. Skivor som odlade på membran kan avbildas direkt med högupplöst fluorescensmikroskopi använder ett upprätt Mikroskop och water immersion mål5. Alternativt, skivor odlade på membran har överförts till glas botten rätter att uppnå bra upplösning av Dendritutskotten använder en inverterade mikroskopet6. Båda metoderna för imaging skivor odlas på membran är dock öppna system som kräver medium ändringar och använder ofta svampdödande och/eller antibiotika för att förhindra eller minska föroreningar5,6. Skivor på ett membran på gränssnittet luft-medium upprätthålla utmärkt morfologi och överlevnad, men tillbaka till exakta platser under repetitiva imaging med hög förstoring är extremt svårt om experimentet är efter bara små grupper av celler uttrycker en fluorescerande markör. Även om skivor som odlas på membran har använts med viral-medierade uttryck av transgener5,6, kan biosäkerhet protokoll kräva ett medföljande kultur-system användas för vissa virala vektorer som används för uttrycka fluorescently märkta proteiner och reportrar av cellfysiologi. Dessutom kräver nedsänkning målen sanering mellan prover som kommer att följas i kultur5. En viktig tillämpning av membran gränssnitt kulturer är att kombinera hög upplösning imaging med elektrofysiologi vid gång punkterna7.
Metoden rulle tube med coverslips inuti plast röret tillåter inte någon elektrofysiologi eller högupplöst avbildning utan att ta bort täckglaset. Således, denna metod har tillämpats oftast att långtidsstudier där efter fixering observationer har gjorts8. Beskrivs här är en metod som utnyttjar den rulle tube kultur tekniken men på borrade ut rör med skivor på coverslips som kan avbildas upprepade så länge som kulturerna bibehålls. Det slutna systemet kräver ingen medium förändring för avbildning och utnyttjar photoetched coverslips för att ge relaterat märken som tillåter imaging med hög förstoring, efter dagar eller veckor, fälten exakt tidigare avbildade.
Vi tillämpar denna metod för att undersöka förändringar i gnagare hippocampus, en större hjärnregionen som deltar i minne och inlärning. Gnagare hippocampus studeras ofta som en modell för patologiska eller åldersrelaterade förändringar som observerats under utvecklingen av kognitiv svikt9, till exempel de som uppstår i AD. Vår metod är särskilt väl lämpade att studera sjukliga förändringar som utvecklas inom en cirkelsektor över tid i Svaren till miljöförändringar, såsom ökning av Aβ peptider, vilket är karaktäristiskt för AD8. En patologi är associerad med mänskliga och gnagare AD hjärna är förekomsten av cofilin-aktin aggregat och spön, de senare som innehåller buntarna av filament som cofilin och aktin är en 1:1 molar förhållandet10,11, 12. stavar har observerats i fasta skivor av råtta hippocampus efter Aβ behandling, liksom inom en levande gnagare hjärnan slice uttrycker cofilin-GFP utsätts för hypoxi8, och de kan bidra till synaptic dysfunktion ses i AD och stroke. Här använder vi denna nya culturing metod för att observera fördelningen inom skivor av uttryckt exogena chimära fluorescerande proteiner infördes genom olika virus och tidsförlopp. Vi använder sedan det neuronala specifika uttrycket av en cofilin reporter konstruktion att följa utvecklingen av cofilin spö och sammanlagda patologi i hippocampus skivor svar på behandling med lösliga Aβ oligomerer (Aβo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av djur följer godkänd avel och användning av djur protokoll som överensstämmer till djur vård och använda riktlinjer av Colorado State University.
Obs: Protokollet nedan beskriver metoden förberedelse och kultur för långsiktiga inkubation och intermittent avbildning av hippocampus skivor. En cirkelsektor Hippocampus är kopplad till ett speciellt beredd photoetched täckglas använder en plasma propp, och sedan coverslips förseglas på den platta sidan av en borrad-out rulle tube, som upprätthålls i en rulle inkubator. Plasma blodproppar löses med plasmin innan virusinfektion för fluorescerande proteinuttryck och högupplösta imaging. En fluorescerande neuronala vitala färgämnet används till bild nervceller inom sektorerna.
1. beredning av rulle Tube Rack
- Använd den mall som visas i figur 1A tryckt till den storlek som visas på skalstapeln. Med en spik, punsch små hål (stor nog för en fin punkt markör) i mallen centrerad på hålen.
- Ställ in mallen på botten av en 15 cm vävnadsodling maträtt (nominell diameter på 14 cm) och markera positionen för hålen. Upprepa detta på en andra maträtt.
- Med borr avsedd att användas på plast, borra sex 1,5 cm diameter hål på varje maträtt i en hexagonala matris (4,8 cm center till mitten) med hålet centers 2,5 cm från kanten av skålen. Borra tre hål (3 mm i diameter) 12 mm från kanten som placeras equidistantly mellan två av de största hålen som visas i figur 1A.
- Med bottnarna i varje maträtt inför varandra, placera en 2,5 tums lång maskin skruv (3/16 tum i diameter) med en platt bricka genom en av de små hålen som följt av en andra platt bricka, ett stycke polyeten slangen (spacer, 4,7 cm), en annan plan bricka , andra vävnadsodling skålen, en annan plan bricka, en låsplatta och en mutter.
- Upprepa steg 1,4 på de andra två maskinskruvar och åtstramning bara löst tills alla maskinskruvar är på plats. Dra åt muttrarna ordentligt.
- Arbeta tågringarna (5/16 tum tjock, 5/8 tum håldiameter) in i hål i nedre skålen att få sista rullen röret rack (figur 1B; visas med två rör på plats). Placera ett klistermärke på varje rack med ett unikt nummer.
2. upprättande av rullen rör och Coverslips
- Att göra Jigg för att borra hål i rullen rör
- Borra ett 1,5 cm hål 8 cm djup i center sidan av en 2 x 4 x 5.5 tums trä block vinkel sådan att den platta sidan av rullen tube kommer vara nästan parallella med blocket när införas (figur 2A).
- Förstora hålet med en trä rundfil att både bredda och avsmalnar i hålet för att tillåta tube införande (rullen rören är något större i diameter nära cap slutet) (figur 2B).
- Borra ett 1,5 cm diameter vertikala hål, 5,5 cm från sidan av blocket, och centrerad över sidan hålet (figur 2C).
- När sidan hålet är avsmalnande nog, infoga en rulle tube som markerats på önskad plats att centrera hålet för segmentet och placera röret så att den markerade platsen är centrerad i 1,5 cm vertikala hål.
- Ta bort röret och mät avståndet från platsen till slutet av röret. Markera detta avstånd från mitten av hålet i jiggen och infoga en spik för att ge ett stopp för att korrekt placera röret för borrning (pilen i figur 2C).
- Använd en bågfil avskurna flush med ytan av trä blocket för att förhindra skada nageln.
- Lägg till fjäderklämmorna nedtill på jiggen om det finns en drill press med platser som gör det möjligt att vara förankrade (figur 2D svart pil). Annars Använd C-klämmor för att hålla jiggen ordentligt på drill press.
- Med jiggen beskrivs ovan att hålla och placera en platt dubbelsidig 11 cm plast kultur röret med den platta sidan upp (figur 2A), borra ett 6 mm diameter hål med center 1,0 cm från botten och centrerad mellan sidorna av röret.
Obs: En borr som utformats för plast bör användas. - Med en svivlande gradning verktyg, jämna ut kanterna på hålet (figur 2E) och göra 4 spår på insidan kanten av hålet (figur 2E, infälld) att underlätta tömning av hålet under rotation.
- Med ett 12 mm hål hålslag, klippa 12 mm diameter diskar från giftfri dubbel dubbelsidig självhäftande kisel gummi ark. Använder en standard ett papper hålslagning (6 mm diameter), gör ett hål i mitten av varje disk.
- Skölj borrade rören med 70% etanol, luft torka dem i biologiska säkerhetsdragskåp, och sterilisera rören och stansade självhäftande skivor för 40 min under UV-lampa (30 W vid 70 cm Genomsnittligt avstånd) i den biologiska säkerhetsskåp.
- Flytta rör och skivor efter 20 min så att alla exponerade ytor är steriliserade. Under sterila förhållanden och dra av den vita uppbackning från en självhäftande skiva och anbringa silikongummi på utsidan av ett rör, rikta in hålen (figur 2F).
Försiktighet: Undvik UV-exponering, Använd ögonskydd och Stäng skåpet innan du slår på UV-lampan. - Rengöra 12 mm diameter photoetched (100 center numrerade 1 mm rutor) tyska glas coverslips. Håll coverslips försiktigt med pincett och doppa i absolut etanol, följt av vatten, följt av absolut etanol igen, och slutligen doppa coverslips i en flamma att bränna bort etanol. Tillåta coverslips svalna.
- Håller coverslips med pincett, doppa i 2% 3-aminopropyltrietoxisilan i aceton 10 s. skölja coverslips med ultrarent vatten och låt lufttorka.
- Ange coverslips på sterila filter papper inuti en biologisk säkerhet skåp och slå på UV ljus. Exponera varje sida av coverslips i 20 min.
Försiktighet: Undvik UV-exponering, Använd ögonskydd och Stäng skåpet innan du slår på UV-lampan.
3. Hippocampus Slice förberedelse
- Innan du börjar dissektion, förbereda halvorna av tveeggat rakblad för vävnad helikoptern. Vik bladen på längden försiktigt med fingrarna och fäst i hälften.
- Skölj bladet halvorna med aceton med en bomullspinne för att rengöra dem, följt av sköljning i absolut etanol och luft torkning.
Obs: Hjärnan slice kultur protokollet är oberoende av mus eller råtta stam eller genotyp. Många transgena möss rader med olika genetiska bakgrunder har använts.
- Med pincett, håll den trimmade hjärnan bakre sida upp och ventrala sida mot sida den Petri maträtt för stabilitet. Försiktigt reta bort hjärnhinnorna runt sagittal mittlinjen och ta bort mellanhjärnan vävnaden med hjälp av en fin lutad Dumont #5 pincett (figur 3C, streckad cirkel).
- Gör två snitt längs sidan av hjärnan för att sprida det öppna (figur 3C, streckade linjer). När hjärnan är placerat ryggsidan nedåt och spridning öppna, Hippocampus sprickan ska synas (figur 3D, pil).
- Överföra spridning öppna hjärnan till en bit av polyklortrifluoretylen plastfilm och placera den för skivning på scenen av en vävnad chopper. Våt bladet med GBSS/glukos och hacka hippocampus i ~ 300 µm tjocka skivor.
- Med överföring pipett, spola skivad hjärnan bort plastfilmen i en färsk 60 mm skål innehållande GBSS/glukos (figur 3E). Försiktigt Nyp bort och retas bort, med fina lutad pincett, återstående hjärnhinnorna och andra icke-Hippocampus vävnad (figur 3F) från skivor (figur 3G, H).
4. plätering skivor
- När skivor har erhållits, placera 2 µL av kyckling plasma i mitten på den photoetched sidan av ett beredda täckglas. Sprida plasma något för att uppnå en plats med 3-4 mm i diameter.
Obs: Photoetched sidan är ovansidan av täckglaset när de visas genom dissektion Mikroskop sådan att siffrorna orienteras korrekt. - Överföra 1 hjärnan skiva med en steril spatel smal-tips (figur 4A) till plasma plats (figur 4B). Använd stängt pincett för att hålla segmentet på spateln spetsen samtidigt lyfta segmentet från GBSS/glukos.
- Tryck på spateln för att plasma plats på täckglaset och med stängt pincett, push slice på täckglaset.
- Blanda 2,5 µL plasma med 2,5 µL av trombin i ett separat rör. Snabbt placera 2,5 µL av denna blandning över och runt slice och Pipettera upp och ner försiktigt blanda det (figur 4B).
Obs: Plasma kommer att levra inom 10-15 s, så detta måste göras snabbt. Om slice vidhäftning är ett problem, blanda 5 µL plasma med 5 µL trombin och Använd 4-5 µL på skiva, att ta bort några efter blandning så att segmentet ligger platt på täckglaset. - Ta bort den klar plast som täcker från den exponerade sidan av silikon gummi lim. tidigare fästs en rulle tube och placera täckglaset med hjärnan slice på limmet justera segmentet i hålet (figur 4C).
- För att säkerställa vidhäftning, applicera mjukt, jämnt tryck till täckglaset med tummen genom att trycka på täckglas ner jämnt och håller den i ca 1 min medan överföring till den biologiska säkerhetsskåp.
- I biologiska säkerhetsdragskåp, tillsätt 0,8 mL odlingsmedium för komplett Neurobasal A (Tabell för material) till varje rör (figur 4D).
- Flöda en 5% CO2/95% luftblandningen genom en sterila bomull-ansluten Pasteur-pipett sitter säkert med en klämma. Spola rulle röret med gasblandningen och snabbt locket röret som det dras tillbaka från runt pipetten.
- Märk rören med antalet segment och rack nummer. Sätt in rören i en rulle rack, säkerställa de balanseras geometriskt. Om det finns ett udda antal tuber, lägga rören att balansera.
- Placera rack i en inkubator med 35 ° C i rullen med valsarna vrida rulle racket på om 10-13 RPH (figur 4E). För att hålla mediet i botten av rören, tilt inkubatorn tillbaka ungefär 5° genom att höja dess bekläda på ett bräde.
- Ange antalet segment och röret på ett kalkylblad, som används för att registrera all information av slice behandlingar och observation datum.
- På cirka dag 6 i kultur, tillsätt 1 µL (0,002 U) aktivt plasmin i varje rör.
- Efter blodproppar upplösas helt (vanligtvis inom några timmar), ta bort mediet och ersätta det med frisk medium utan plasmin. Om det behövs skivor kan inkuberas med plasmin över natten och mediet ändras nästa dag.
- Skivor inkuberas vanligtvis i minst 7-10 dagar före användning i experiment. Aspirera medium och ersätta det på dag 3 eller 4, igen på dag 7 och varje 7 dagar därefter.
5. beredning av virala vektorer för transgenens uttryck
Obs: Uttryck av transgener i nervceller av slice kulturer uppnås antingen genom att använda hjärnor från genetiskt modifierade gnagare eller genom att införa transgenens genom infektion med rekombinant replikering bristfällig virus.Adenoviruses (AV), adeno-associerade virus (AAV) och rekombinant lentivirus vektorer har alla använts i våra Hippocampus slice kulturer för uttryck av olika fluorescerande protein chimärer i hjärnan skivor.
- Förbereda replikering bristfällig AV för att uttrycka RNA av intresse enligt metoder som beskrivs på andra ställen13,14. Titer virusen för infektiös U/mL av den seriella utspädning metoden använder en antikropp mot ett viralt uttryckt protein som beskrivs14. Att observera cofilin aggregat och cofilin-aktin stav bildning, utnyttja de cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plasmid #51279)16.
Obs: Synapsin 1 arrangören är ett utmärkt val för neuronal uttryck15, cytomegalovirus arrangören är lämpligt för körning höga nivåer i många cell typer13. - Förbereda AAV genom samtidig transfection överföring plasmid innehållande genen sevärdheter och ett rep/cap plasmid, med eller utan en helper plasmid, i HEK293 förpackning celler, som levererar den virala E1-genen, som tidigare beskrivits17,18.
Obs: Rekombinant AAV kan också göras för riktade insättning i den mottagande cell genomet19. För överföring plasmiden använder vi mänskliga cofilin 1 med en C-terminal mRFP1 fluorescens protein tagg (plasmid #50856) klonade in en synapsin som innehåller arrangören AAV plasmid nedströms från kalcium sensor GCaMP5G20. En bit av DNA sekvensen P2A själv proteinspjälkande peptid-kodning infogas av PCR mellan GCaMP5G och cofilin-RFP under utarbetandet av överföring plasmiden att ge uttryck av både proteiner från en enda AAV avskrift21. - Förbereda rekombinant lentivirus vektorer genom samtidig transfection av överföring plasmiden som innehåller genen eller cDNA av intresse och integration signaler, tillsammans med en tredje generationens lentivirus förpackning blandning som delar den virala gag, pol, rev och vsv-g gener på tre separata plasmider22,23.
- För överföring plasmiden, använda ett enda steg kloning system24 för att montera synapsin promotorn och cofilin-R21Q-mRFP cDNA (från plasmiden #51279) till pLKO.1-GFP (plasmid #30323), med synapsin promotorn och cofilin-R21Q-mRFP ersätter hPGK arrangören och god Jordbrukarsed cDNA, respektive.
- Transfect slutliga plasmiden i HEK293T celler av kalciumfosfat som tidigare beskrivits23.
- Samla in medel från fyra 10 cm rätter, koncentrat till 500 µL med 150K-cutoff centrifugal koncentratorer och lagra den slutliga lentivirus vid-80 ° C i små delprover efter snabb frysning i flytande kväve. Tina en delmängd bara en gång infektera celler.
- Bestämma empiriskt volymen av varje virustyp beredda att uppnå graden av uttryck som önskas genom att ställa in ett antal olika segment kulturer att följa ett uttryck för transgener efter infektion med olika volymer av virus.
Obs: Normalt 1-10 µL av virus används per skiva.
6. skiva behandlingar
- Infekterar skivor med virus
- Arbetar i biologiska säkerhetsdragskåp godkänd för virus arbete på biologisk säkerhetsnivå lämpligt för vektorn, blanda en alikvot av viruset (vanligtvis 1-10 µL) med 0,8 mL komplett medium.
- Aspirera på medellång från segmentet med hjälp av en steril Pasteur-pipett i en samling fälla som innehåller blekmedel. En sekundär fälla används alltid mellan första fällan och vakuumkällan.
- Ersätta detta medium med virusinnehållande alikvoten beredd enligt ovan, återgå kultur rören till ett rack och placera i inkubatorn.
- Efter 2-5 dagars ruvning skivor med virus i den biologiska säkerhetsskåp, ta bort de virusinnehållande mediet med sterila pipett och placera det i en flaska som innehåller en godkänd antiviralt medel för att döda virus.
- Färgning av nervceller med vitala färgämnet
- Förbereda och lagra alikvoter av fluorescerande neuronala vitala färgämnet25 genom snabb frysning 4 µL alikvoter i flytande kväve vid en koncentration på 100 µM och lagra dessa på-20 ° C. Inte frysas och tinas färgen mer än en gång.
- Att märka nervceller för visualisering av fluorescensmikroskopi, Tina en alikvot av det neuronala vitala färgämnet och späd 4 ml i fullständig Neurobasal medium (slutliga dye koncentration är 100 nM).
- Ta bort mediet från skivor av aspiration (eller med en överföring pipett om mediet innehåller virus) och ersätta det med 0,8 mL av mediet som innehåller 100 nM neuronala vitala färgämnet. Tillbaka skivor till rullen apparaten i inkubatorn.
- Efter inkubation skivor för 2 h, aspirera på dye-innehållande medellång och ersätta det med 0,8 mL färsk komplett medium i biologiska säkerhetsdragskåp.
Obs: Märkning av nervceller i skivor med vitala färgämnet kräver flera timmars inkubation. De första bilderna tas normalt 24 h efter dye behandling. Även om nervceller är specifikt märkta, finns det bakgrunden fluorescens som sjunker under 2-3 dagar att ge bättre neuronala imaging. Intensiteten av det vitala färgämnet sjunker efter 72 h. - För att följa förändringar i slice morfologi över tid, märka skivor varje 7 dagar.
7. skär Imaging
- Visa skivor på ett inverterat Mikroskop. För ljusaste fluorescens imaging, på 24 h innan imaging, utbyta odlingsmedium med komplett Neurobasal A medium utan indikatorn fenolrött pH.
Obs: För experiment som redovisas här, ses skivor på en inverterad snurrande skiva confocal fluorescens Mikroskop utrustat med en linjär kodad x, y-steget med piezo z kontroll och en känslig högupplöst digitalkamera. - Överföra röret med slice kulturen att avbildas från rulle tube apparaten till innehavaren skräddarsydda tube (figur 5A), som placeras i scenen adaptern (figur 5B), att hålla täckglaset vinkelrätt mot målet och behålla segmentet i samma riktning under repetitiva imaging sessioner över långa intervaller.
- Skjut reglaget på scenen adaptern tätt mot röret att hålla röret på plats (figur 5B).
Obs: Detaljer av innehavaren av tube, stage adapter och värmare kan nås på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Obs: Dessa avräknas positioner från relaterat mark tillåter konsekvent precisera av samma täckglas plats när segmentet är avbildade, även om den ursprungliga x, y inställningen av märket relaterat ändras när röret eller scenen adaptern är bort och ersättas.
Obs: Bilden plan erhålls vanligen med intervall på 0,5 µm till 2 µm, beroende på storlek och önskad upplösning bild funktioner. Bygga en 3D bild kvalitet kräver att funktioner bild sträcker sig över flera plan av förvärvet, och så för att visualisera mindre funktioner, mindre mellanrum krävs mellan plan.
Obs: De flesta imaging sessioner rapporterade här var under 18 min/skiva. Men vi har avbildats några skivor tio eller fler gånger, och även som länge 40 min i en enda session, utan uppenbar skada i segmentet långsiktiga överlevnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att avgöra hur exakt relaterat märken kan utnyttjas för att reimage samma celler inom samma fält över tiden, vi granskat skivor som odlas på photoetched coverslips(figur 6). Neuroner var visualiserat genom färgning med en vitala färgämnet (100 nM för 2 h; inte fläckar icke-neuronala celler), som försvinner från nervceller över tid utan att skada de celler25. Vi identifierade ett relaterat mark i en enda ruta (figur 6A, B), hittade en region av vitala färgämnet-märkt nervceller 24 h efter märkning, inspelad på x och y-förskjutning positioner från relaterat mark (figur 6B) och samlas in, använda ett 60 X-objektiv, confocal bildstaplar i denna region, upprepande av imaging på 4 dagar. De maximala projektion bilderna av en 30 µm bildstapel tagna på samma plats visas (figur 6C-F). Trots vissa morfologiska förändringar sker inom regionen över 4 dagar, kan identiska celler (varav flera är markerade) följas över tid. Fluorescensintensiteten hos det vitala färgämnet minskat över tiden men nervceller var fortfarande klart identifierbara 4 dagar efter märkning. Även om de flesta av neuronala vitala färgämnet fluorescensen var diffus inom cytoplasman, vissa punktuell färgning observerades alltid, som blev mer märkbar som bakgrund fluorescens minskade. I ohälsosamma skivor sågs en punktuell färgning av icke-neuronala celler också som skivor försämrats. Dessa resultat visar att identifierade celler i skivor kan avbildas upprepade genom att använda relaterat märken för att hitta dem.
För att undersöka tidsberoende förändringar i neuronala organisation och lönsamhet inom segment under långtidsodling, följde vi samma skivor under 5 veckor, märkning med fluorescerande neuronala vitala färgämnet en gång per vecka 24 h innan imaging. Flera omgångar av färgning med denna vitala färgämnet över flera veckor ökade ansamling av aggregat. Nervceller inom nymalen guldpläterade skivor som fortfarande var i plasma blodproppar lastades med färgämne och avbildas på en dag i vitro (1 DIV). Samma skivor var avbildade igen varje vecka i 5 veckor. Bilder tagna från en cirkelsektor med en 4 x-objektiv visas (figur 7A-E). De pyramidala celllagrar av Regionkommittén CA och GD är ljust märkta när glada på 488 nm och fluorescens utsläpp mäts vid > 620 nm. Under en 5 veckors period av observation 19 skivor, tre skivor lossnade täckglaset och två andra förlorade sin typiska morfologi och blev ogenomskinlig, uppgift om deras död. Således en överlevnad på cirka 70% för experiment bör övervägas, och extra skivor beredd att garantera ett tillräckligt antal för analys. Skivor var beredda på en nominell tjockleksinställning på vävnad helikoptern 300 µm. Efter 5 veckor i kultur mätte vi slice tjockleken av imaging neuronala vitala färgämnet-färgade skivor från täckglaset upp genom på segmentet med ett 40 X-objektiv på en snurrande skiva confocal Mikroskop olja. Förlust av fokus av nervceller inträffade i genomsnitt 257 nm (n = 5 skivor med flera platser används per skiva), visar att mycket lite gallring av segmentet hade inträffat från tiden av plätering. Vi kunde inte mäta tjockleken segment av fluorescensmikroskopi vid tidpunkten för plätering eftersom det vitala färgämnet anhållna i plasma proppen gav diffusa fluorescens vilket gör det svårt att exakt mäta position där förlust av fokus inträffade. Men är 3D-bilder av nervceller inom segment lätt erhållas i skivor efter plasma proppen avlägsnas. 21 DIV slice, visas i låg förstoring i figur 7F, fotograferades med en 60 X-objektiv på en confocal Mikroskop (steg om 1 µm) 3 dagar efter lastning med det neuronala vitala färgämnet. En 60 µm 3D bilden byggdes från de fokala plan (figur 7G). Nervceller och deras neurite-processer som är märkta med det vitala färgämnet kan följas i 3D. Morfologi och 3D-strukturen för skivor var välskött över minst 3 månader, och de längsta tiderna användes i den aktuella studien.
Stora förändringar i morfologi av tidigare avbildade ställning också förekommit i vissa skivor, vilket tyder på att rörligheten för segmentet på täckglaset kan äga rum. Visst, över längre intervall mellan imaging blev det svårare att veta med säkerhet att cellerna i fältet att vara avbildade var identiska med de som observerats i tidigare imaging sessioner. Således visar maximalt projektion bilder av confocal travar av vitala färgämnet-märkt skivor förvärvade på identiska plats med målsättningen 60 x med en veckas intervall som sträcker sig över 4 veckor (figur 8) att neuronala livskraft är välskött men att det är svårt att identifiera en specifik neuron med tiden när bilder erhålls med långa tidsintervaller mellan sessioner. Förmodligen skulle mönstret av celler märkta med flera fluorophores vara mer lättidentifierad, som är celler i lokaliserade grupper när observeras genom att rulla genom en bildstapel.
För att bedöma nyttan av olika virala vektorer för införandet av exogena gener i nervceller i hippocampus skivor, jämförde vi slice smittsamhet med hjälp AV, AAV och rekombinant lentiviral vektorer, varje uttrycker olika fluorescerande taggar eller använda olika initiativtagare till drive uttryck. AV (2 x 107 smittsamma U/slice) uttrycker cofilin-mRFP bakom en stark, icke-cell specifik CMV promotor användes för att infektera en mus Hippocampus segment som hade varit odlade 9 veckor på coverslips. Uttryck för cofilin-mRFP hittades i hela segmentet på 5 dagar efter infektion, med uttryck mest intensiva runt periferin slice som observerats med ett 4 x-objektiv (figur 9A). Celler inom segmentet uttrycker cofilin-mRFP observerades också med ett 20 X-objektiv (figur 9B) med några ljusa punktuell färgning och också diffust uttryck i både nervceller och icke-neuronala celler. Efter 17 veckor i kultur (8 veckor efter infektion), hade spontana cofilin-rods bildats i vissa celler, förmodligen drivs av överuttryck av wild typ cofilin-mRFP (figur 9C)26,27.
Vi visade också att AAV (1010 partiklar) skulle kunna användas för uttryck i skivor.Bilder av skivor infekterade 9 veckor i kultur med AAV, som körde en neuronal specifika synapsin promotor uttryck för GCaMP5-cofilin-mRFP med en egen proteinspjälkande P2A peptid sekvens i länkaren av översatta polyprotein21, var tagna 8 veckor efter infektion (17 veckor i kultur). I nervceller uttrycker GCaMP5 och cofilin-mRFP, vissa cofilin stavar/aggregat bildas (figur 9D-F). Fluorescensintensiteten hos stavar/aggregaten var så stark att mycket lite fluorescens av en diffus cofilin-mRFP kunde observeras utan fullständig mättnad och blommande cofilin fluorescens bilden av stavar. Spontana cofilin stavar visas i nervceller där vildtyp cofilin fluorescerande protein chimärer har varit alltför uttryckt26,27, som betonade nervceller10. Baserat på de titrar av adenovirus, vilka bestäms på grundval av smittsamhet14 och partikel räkningarna används för att bestämma AAV titer, ca 100 till 500 gånger högre partikeln numrerar av AAV behövs för att få ungefär samma smittsamheten / uttryck i skivor jämfört med AV.
För att följa rekombinant lentivirus-medierad uttrycket av fluorescerande proteiner i skivor, var skivor infekterade på 6 DIV med 1, 3, 10 och 30 µL portioner av ett rekombinant lentivirus neuronala särskilda uttryck (synapsin promotorn) för cofilin-R21Q-mRFP, utvecklats som en levande cell imaging proben för cofilin-aktin rod bildandet16. Skivor var märkt med neuronala vitala färgämnet på 11 DIV och avbildas i specifika regioner för dye och cofilin-R21Q-mRFP uttryck på 12 och 14 DIV. Segmentet infekterade med de 30 µL alikvoten av virus inte överlevde för imaging men tre exemplar skivor behandlas med andra volymerna av virus visade en dosberoende uttryck för mRFP. Figur 10 visar bilder av skivor infekterade med 1 µL och 10 µL av lentivirus på 6 och 8 dagar efter infektion. Flera regioner i två olika skivor kvantifierades för samtidig färgning av nervceller med vitala färgämnet och mRFP uttryck. För skivor infekterade med 1 µL lentivirus, uttryckt ca 28% av nervceller mRFP på 6 dagar efter infektion, öka till 85 procent till 8 dagar efter infektion. Cirka 58% av nervceller uttryckt för skivor infekterade med 10 µL lentivirus, mRFP på 6 dagar efter infektion, öka till 86 procent till 8 dagar efter infektion. Således var 1 µL av lentivirus tillräckliga för att ge omfattande slice smittsamhet och neuronala uttryck av 8 dagar efter infektion.
För att demonstrera att detta kultur-system är användbart i följande utveckling av cofilin patologi, skivor som angripits av lentivirus för att uttrycka cofilin-R21Q-mRFP i nervceller lämnades obehandlade eller behandlade med olika koncentrationer (1 µM, 333 nM och 100 nM) av syntetiska mänskliga Aβ protein som hade genomgått inkubation till formuläret oligomerer28. Resultat från tidigare studier visade att syntetiska Aβo framkalla cofilin-aktin spön i upp till 25% av dissocierade Hippocampus nervceller29,30,31. Alla tre skivor behandlas med 1 µM koncentrationen av Aβ lossnade från täckglaset i första 24 h, medan alla fordon skivor (kontroll) och de behandlade med 333 nM och 100 nM koncentrationer av Aβ överlevde under de två veckorna som de följdes. Samma cellulära regioner (CA1, CA3 och GD) i ett segment som behandlats med 100 nM Aβo var avbildad (60 x mål) över flera dagar. Kontroll skivor som var infekterade på 6 DIV med lentivirus för att uttrycka synapsin driven cofilinR21Q-mRFP hade diffusa cellulär mRFP uttryck av 15 DIV (figur 11A). Skivor utsätts för 100 nM Aβo på 14 DIV och avbildas på 15 DIV visade att fördelningen av cofilin-R21Q-mRFP blev punktuell, som förekommer i båda stav formad strukturer och aggregat (figur 11B). Dessa strukturer blev ännu mer framträdande 6 dagar efter Aβ-behandling (figur 11C, vilket är samma område av celler som figur 11B). På många ställen rik på neuriter där neuronala cell somas är frånvarande (figur 11D), utvecklat punktuell och rod-liknande matriser av cofilinR21Q-mRFP (pilar i figur 11C), liknar fördelningen av cofilin-aktin stänger tidigare rapporterats inom neuriter av Aβ-behandlade nervceller i kultur29,30,31. Således, denna nya metod för odling och observera Hippocampus skivor vilja tillåta förbrukaren till avgöra den långsiktiga livskraften hos celler i vilka cofilin aggregat och stavar form och reversibiliteten av patologin i olika stadier av utveckling, och att enkelt utföra dos-respons mätningar på reagenser som kan blockera eller backa bildandet av cofilin patologi i en mer in-vivo-gillar cellulära organisation.
Figur 1: Beredning av rulle tube rack. (A) mall för att markera hålet positioner för borrning ut 15 cm vävnadsodling maträtt bottnarna. Om siffran är tryckt till storleken på skalstapeln visas, kan det skära ut och används för att markera positionerna på en 15 cm kultur maträtt för att borra hålen visas. (B) slutfördes rulle tube rack med två rör insatt. Varje rack är numrerade på en etikett som är väl synlig på toppen av räcket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Förberedelse av rullen kultur rören. (A) Front Visa av rulle röret in i en jigg på en drill press för borrning ut 6 mm hålet i röret. Streckad linje visar positionen för platta dubbelsidig rulle röret i jiggen. (B) slutet av jiggen med röret införas och borrspets som arrangera i rak linje över hålet. (C) ovanifrån av hålet i jiggen för borrning ut rullen tuber med en 6 mm borr.Vit pil visar positionen för cut-off nageln infogas som ett stopp för positionering rören och svart dubbla linjer är för lite justering. (D) våren klipp (svart pil) installerad på jiggen botten för att säkert hålla det i position vid borrning rör. (E) efter borrning ut hålet, kanter jämnas med ett verktyg för gradning och spåren skärs på insidan av hålet (infälld visar hålet visas genom dissektion Mikroskop) att förbättra medium dränering från hålet under tube rotation. (F) kultur rör med hålet anpassas till ett hål i silikon gummi limmet, som täckglaset kommer att bifogas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beredning av hippocampus hjärnan skivor. Bilder tagna med en dissektion mikroskopet visar: (A) intakt mus hjärnan. Ställning av nedskärningar att avlägsna framhjärnan och lillhjärnan visas som blå streckade linjer. (B) efter borttagning av framhjärnan och lillhjärnan. (C) bit av hjärnan från B är vänt 90 ° med bakre region (mot lillhjärnan) vänd uppåt. Positionering bit bredvid sidan av skålen hjälper med avlägsnande av mellanhjärnan (blå streckad cirkel) som kan vara retad från de återstående hippocampus, thalamus och hypothalamus. Två snitt med tången (blå streckad linje) tillåta den resterande bit som innehåller hippocampus från båda hjärnhalvorna att spridas platt. (D), tillplattad hjärnan bit visar det blodkärl som löper längs Hippocampus sprickan (blå pil). Denna vävnad är på plastfilm och flyttas till vävnad helikoptern för skivning i riktning mot den streckade linjen. (E) skivad vävnad visar något mer än hälften hippocampus efter återsänds till GBSS/glukos. (F) slutliga dissekering av hippocampus och rengöring av skivor kan ta bort icke-Hippocampus material. (G) flera flytande skivor efter slutlig sanering. (H) förstorat foto av en cirkelsektor för överföring till täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bordläggningen och ruvande skivor. (A) A mus Hippocampus segment tas bort från kultur skålen på toppen av en spatel använda spetsen på tången för att lyfta den fri från lösningen. (B) segmentet placeras platt i mitten av en photoetched och behandlade 12 mm täckglas på 2 µL av kyckling plasma och en annan 2,5 µL av en 1:1 plasma/trombin blandning tillsätts generera en propp. (C) efter proppen är inställd (ca 1-2 min), beläggningen avlägsnas från silikon gummi självhäftande cirkeln på en rulle tube och täckglaset placeras med koagel centrerad i hålet; sedan täckglaset på plats med en tumme hålls intryckt i position i ca 1 min. (D) Lägg till 0,8 mL komplett odlingsmedium. (E) berg rör hållare inuti en stor rulle inkubator med framsidan upp för att luta 5 ° för att hålla medium längst ned i rören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Rulle tube innehavaren och scenen plattan inkubator. (A) Tube innehavaren som placerar röret så att täckglaset upprätthålls i position för avbildning. (B) Tube hållare monterad i en Mikroskop scenen adapterplatta. Reglagen på sidan håll röret ordentligt för avbildning. (C) Stadium lagt till kortet med tube innehavaren och side paneler som innehåller värme remsor ansluten till en termoelektrisk temperatur styrenhet. När rören är monterad och placerad, kan en solid topp till rutan läggas för att upprätthålla temperaturen under imaging. Orange tråd är termoelement ledningen. Planer för konstruktion och byggnad av scenen adapter och värmare finns på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Använder relaterat märken för repetitiva avbildning av samma celler. (A) Hippocampus skiva på photoetched täckglas (1 mm rutor) med subiculum ovikt (svans) tittade på med 4 x objektiva och ljusa fält belysning. Krökning av plast rulle tube hjälper till att skapa en sned belysning som förbättrar visualiseringen av rutnätet. Rutan visar position och storlek av en 60 X-fältet. (B) en vy av samma segment med ett 20 x-objektiv för att hitta relaterat märket som spetsen på botten av 4 från torget 34. Y och x förskjutningarna visas reproducibly hitta mitten av rutan önskad för högre förstoring confocal avbildning. (C–F) En skiva märkt med neuronala vitala färgämnet 13 DIV fotograferades med en 60 x mål och göra en 30 µm projektionsbild på 4 dagar (14-17 DIV). Identiska nervceller var avbildade varje dag. Placeringen av kärnan i var och en av tre nervceller är märkt med en annan symbol. De är mer lätt identifieras genom att rulla genom bildstaplar deras 3D-position ändras något. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Imaging nervceller i skivor med en neuronal vitala färgämnet. (A) neuronala vitala färgämnet målat slice i plasma clot tagit 24 h efter plätering med 4 X-objektiv. Färgämne (100 nM) lades när segmentet var först placeras i hållaren rulle tube och tvättas ut 2 h senare.Subiculum är böjt runt hippocampus i proppen. (B–E) Efter blodpropp upplösning av plasmin läggas till 6 DIV, var segmentet reloaded 5 gånger med det vitala färgämnet 24 h i förväg om imaging med en veckas intervall. Bilderna samlades på 8, 21, 28 och 35 DIV (B–E, respektive). (F) Hippocampus skiva odlade i 3 veckor och färgas med neuronala vitala färgämnet 24 h i förväg om bildbehandling med 4 X-objektiv. (G) Confocal bunt med bilder på samma skiva som i F visar en 3D-vy av 61 plan tagit 1 µm mellanrum. Neuronala vitala färgämnet etiketter tydligt både neuriter och cellkroppen, men det är uteslutet från kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Repetitiva imaging av nervceller i en enda plats i segmentet under 4 veckor. Maximala projektion bilder av 30 µm confocal bildstaplar av samma fält av celler (av positionering) från vitala färgämnet-märkt segment tas vid 12, 20, 30 och 40 DIV (A–D, respektive). Det är svårt att upprepande identifiera enskilda celler över längre tid ramar i projektion bilder. Dock även över dessa långa perioder, identifiering av samma celler är ofta möjligt genom att rulla genom bildstaplar eller bygga 3D-bilder som kan roteras, såsom visas i figur 7G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Viral-medierade uttryck och avbildning av fluorescerande proteiner. (A) Hippocampus slice odlade i 9 veckor och infekterade med adenovirus för att uttrycka cofilin-mRFP bakom en CMV promotor. Uttryck hittades i hela segmentet på 5 dagar efter infektion men fluorescens var ljusaste nära slice periferin. (B) samma segment visade uttryck i celler djupare inom segmentet då med 20 X-objektiv. Bilden är en projektion från en stack på 20 bilder fördelade 2 µm apart. (C) samma segment undersöktes efter 17 veckor i kultur (8 veckor efter infektion) och cofilin mRFP observerades i stav formad aggregat som kan ses i denna projektionsbild från en 70 µm bunt 23 bilder, 3 µm apart, tagna med ett 40 X-objektiv. (D–F) Mus Hippocampus slice infekterade 9 veckor i kultur med en AAV uttrycker en GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP bakom en synapsin promotor. Fluorescens var synlig i både röda och gröna kanalerna efter 10 dagar. En enda plan bild av segmentet visar uttrycket av (D) GCaMP5, kalcium känsliga reporter, (E) många cofilin-innehållande stavar, och (F), ett överlägg bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Uttryck för cofilin-R21Q-mRFP drivs av en synapsin promotor i nervceller infekterade med rekombinant lentiviral vektorer. Upptäckt av en svag fluorescens signal observeras först av om 3-4 dagar efter infektion med 10 µL av viruset och blir användbara vid 5-6 dagar, (E) som kan ses i dessa bilder som förvärvats med en 60 x-objektiv. Även om det tar längre tid att uppnå samma nivåer av uttryck med 1 µL av virus, av 8 dagar efter infektion en liknande hög andel av nervceller (vitala färgämnet märkt) uttryckte de cofilin-R21Q-mRFP. Endast 27% av nervceller var positiva för mRFP fluorescens på 6 dagar efter infektion med 1 µL (A, B) men detta ökade till 85% (C, D) av 8 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11 : Aβ oligomer-inducerad cofilin patologi i mus Hippocampus skivor. Alla bilder tagna som 30 µm bild travar med en 60 x mål och visas som maximal projektion bilder. Skivor var infekterade med cofilin-R21Q-mRFP på 6 DIV. (A), 15 DIV slice behandlas på 14 DIV med fordon (DMSO/skinka F12 medium används för att generera Aβo). (B) skiva 15 DIV behandlas med 100 nM Aβo. (C) samma område liksom B tas vid 20 DIV och visas i (D) som ett överlägg med neuronala vitala färgämnet etikett. Pilarna visar linjära kedjor av cofilin ballast och stavar i regionen i segmentet som innehåller neuriter men några cell organ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den rulle tube metod som beskrivs här ger långsiktig odling och högupplösta levande avbildning av skivad hjärnvävnad. En viktig fråga med slice teknik som tillämpas här är i montering och underhåll av skivor. Täckglas beläggningar som stöder slice vidhäftning, främja slice gallring genom att förbättra utväxten av neuriter och migration av celler ur segmentet; därmed undvek vi användning av dessa substrat. Införandet av aminogrupper på glaset genom behandling med 3-aminopropyltrietoxisilan förbättrat adherencen av skivor, men för lite eller för mycket kyckling plasma på täckglaset kan också orsaka följsamhet problem leder till skiva. Volymen av plasma behövs för korrekt vidhäftning är beroende av storleken på odlade hjärnan slice, och således är större för råtta Hippocampus skivor, som är ca 4 gånger större i området än mus hjärnan skivor. Om för mycket plasma blodproppar under segmentet, celladhesion till täckglaset är nedsatt och behandling med plasmin kommer att lossa skiva så att den antingen ändrar position eller lossnar helt. Dock kan för lite plasma i koagel leda till segment under de första dagarna av rotation i inkubatorn. I en senaste experiment som rör 39 skivor, tre var förlorad men några av dessa förlorade kan ha resulterat från slice skador som inträffat under processen skivning. Dock förbereder vi oftast ca 50% fler skivor än det uppskatta antalet behövs för experimentet. Andra orsakas ledande kultur problem av läckage av medium runt täckglas tätningen. Problemet förvärras när coverslips inte hålls fast i position för minst 1 minut efter anbringande dem till försegla. Värme från tummen används för att utöva påtryckningar sannolikt hjälper slutföra vidhäftningen. Läckage som uppstår är ofta genom små luftkanaler under den täckglas som kan observeras med dissektion Mikroskop. Dessa försvinner vanligtvis när du använder långvarig tumtryck. Förlust av ca 2% av kulturer på grund av långsamma läckage kan förväntas och således är det rekommenderat att vänta 10 dagar efter inställning-upp kulturer innan du utför virusinfektioner. Överdriven tumtryck, kan särskilt om produceras ojämnt över täckglaset, också orsaka täckglaset till spricka. Om brott är ett problem, kan att trycka på rören ner platt på en gummi musmatta värmas i en inkubator hjälpa för att ge jämnare tryck över täckglaset.
Tidigare beskrivna metoder för hjärnan slice kultur på membran på luft-vätska-gränssnittet (open system) eller på ett täckglas inuti ett förseglat plaströr (stängda system) är mycket effektiva för överlevnad på lång sikt slice, men varje metod har sina styrkor och svagheter. Slice kulturer på membran på luft flytande gränssnittet är fördelaktiga för kombinerade elektrofysiologiska studier med nedsänkning mål för högupplösta imaging7, men har nackdelar när det gäller att hitta den exakta field av celler för reimaging över tid och potentiella användare exponering och objektiva kontamination när du använder viral-medierad genuttryck. Användning av virus för uttryck av transgener är säkrare och enklare att utföra i ett slutet system där kontamination av Mikroskop mål är inte en fråga. Vår modifierade rulle tube metod ger tillgång av segmentet för högupplösta imaging, även om det inte är mottaglig för elektrofysiologiska studier.
Slice kultur villkor har fastställts för många regioner av gnagare hjärnan2, men här använder vi endast hippocampus eftersom det är en av de mest studerade hjärnan regionerna och förändringar som sker i hippocampus är av stort intresse i studier av kognitiv svikt. Pyramidal cell lager av regionerna CA och GD upprätthålla sin organisation under flera veckor i kultur och lätt kan observeras morfologiskt. Vi har använt en nyutvecklad fluorescerande neuronala livskraft markör25, som har fluorescens egenskaper som gör det möjligt att användas för att övervaka neuronala livskraft och organisation inom Hippocampus skivor över tidsperioder dagar till månader men också är kompatibel med användning av många andra fluorescerande proteiner och reportrar. Även om inte optimala för NeuO fluorescens25, vi kan excitera på NeuO på 488 nm och mäta utsläpp på > 617 nm. Relaterat märken på den photoetched coverslips hjälpte leta upp samma celler upprepade över många dagar av kultur och tillät oss att bilden identiska regioner i skivor under många veckor. Praktiskt taget inträffade ingen betydande gallring av skivor på modifierade glas coverslips under 5 veckor i kultur, den längsta tidpunkt som vi fått slice tjocklek mätningar.
AV, AAV och rekombinant lentivirus vektorer fungerar bra för att uttrycka exogena gener i skivor. Lentivirus med en neuronal specifika Promotorn är särskilt användbar för att erhålla uttryck i en mycket hög andel (> 85%) av nervceller inom 8 dagar efter infektion. Vi visar dessutom att den cofilin-aktin rod patologi är associerad med utveckling av kognitiva brister i mänskliga AD10,11 och Aβ överuttryck mus AD modeller32 kan övervakas i slice kulturer behandlas med relativt låga koncentrationer (100 nM) av syntetiska mänskliga Aβo. Vi ser framför oss att framtida tillämpningar av denna metod kommer att omfatta kännetecknar nya therapeutics för att vända cofilin-aktin rod patologi eller rätta dendritiska ryggraden avvikelser som förekommer i många neurologiska sjukdomar33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
