Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hög genomströmning parallella sekvensering att mäta konditionen av Leptospira interrogans Transposon införande mutanter under gyllene syriska Hamster infektion

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Här beskriver vi en teknik som kombinerar transposon mutagenes med hög genomströmning sekvensering att identifiera och kvantifiera transposon leptospiral mutanter i vävnader efter en utmaning av hamstrar. Detta protokoll kan användas till skärmen mutanter för överlevnad och spridning i djur och kan också tillämpas på in vitro- studier.

Abstract

I detta manuskript beskriver vi en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknik för att identifiera och kvantifiera Leptospira interrogans mutanter ändras i fitness under infektion i gyllene syriska hamstrar. TN-Seq kombinerar slumpmässiga transposon mutagenes med kraften av hög genomströmning sekvenseringsteknologi. Djur utmanas med en pool av transposon mutanter (ingång pool), följt av upptagning av blod och vävnader några dagar senare för att identifiera och kvantifiera antalet mutanter i varje organ (utdata pooler). Utdata poolerna jämförs ingående poolen att utvärdera i vivo lämplighet varje mutant. Denna metod gör det möjligt för screening av en stor pool av mutanter i ett begränsat antal djur. Med smärre ändringar, kan detta protokoll utföras med någon djurmodell av leptospiros, reservoar värd modeller såsom råttor och akut infektion såsom hamstrar som in vitro- studier. TN-Seq erbjuder ett kraftfullt verktyg till skärmen för mutanter med i vivo och in vitro- fitness defekter.

Introduction

Identifiering av virulensgener för vissa bakterier, såsom Leptospira spp., är svårt på grund av det begränsade antalet genetiska verktyg tillgängliga. En vanligt förekommande metod är skapandet av en samling av mutanter av slumpmässiga transposon mutagenes följt av identifiering av insticksstället i varje mutant och virulens provning av enskilda transposon mutanter i en djurmodell. Denna metod är tidskrävande, dyra och kräver ett stort antal djur.

När slumpmässig mutagenes utvecklades först för patogen Leptospira interrogans, identifierades genernas virulens genom att testa enskilda mutanter i en djurmodell1. Mutanter valdes utifrån kriterier som deras potentiella roller i signalering eller motilitet eller deras förväntade yttre membran eller markrättigheter. Eftersom flesta leptospiral gener koda hypotetiska proteiner av okänd funktion2, välja mutanter baserat på dessa kriterier begränsar förmågan att upptäcka roman leptospiral virulensgener.

Mer nyligen, pooler av L. interrogans transposon mutanter som screenades för smittsamhet i hamster och mus modeller3. Varje djur ifrågasattes med en pool av upp till 10 mutanter. Smittsamhet av en mutant gjorde var så positiv om det upptäcktes av PCR av kulturer som erhållits från blod och njure. PCR-test var arbetskrävande eftersom det krävs en individuell PCR-reaktion för varje mutant i poolen. Eftersom frekvensen av varje mutant i kulturer inte kvantifierades, var metoden partisk mot identifiering av mycket försvagat mutanter.

Vi beskriver en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknik, som en strategi för att mer effektivt skärmen för virulensgener. TN-seq består av skapandet av ett bibliotek av mutanter av transposon mutagenes följt av massiva parallella sekvensering4,5,6. Transposon mutanter är kort, poolade, inokuleras i djur och senare återhämtat sig från olika organ (utdata pooler). DNA från utdata poolerna är extraherade och smält med restriktionsenzym eller klippt av ultraljudsbehandling. Två omgångar av PCR inriktning korsningar av transposon införande platserna utförs. Detta steg kan tillägg av adaptrarna som behövs för sekvenseringen. De resulterande PCR-produkterna analyseras av hög genomströmning sekvensering att identifiera insättningsstället transposon på varje mutant av poolen tillsammans med deras relativa överflöd, som jämfört med den ursprungliga sammansättningen av av mutant.

Den främsta fördelen med denna metod är möjligheten att samtidigt visa ett stort antal mutanter med ett litet antal djur. TN-Seq kräver inte den tidigare kunskap av transposon införande platser vilket ökar chanserna att upptäcka nya Leptospira-specifika gener inblandade i virulens med mindre tid och större effektivitet. Eftersom leptospiral börda i vävnader är relativt hög i gnagare modeller mottagliga för dödliga infektion (vanligtvis 104 till 108 bakterier/g vävnad)7,8,9 samt för liksom i reservoaren värdar 10,11, vävnader kan analyseras direkt utan att behöva kultur, minska fördomar på grund av in vitro- tillväxt.

I Tn-Seq studier med de flesta bakteriella patogener beskrivs hittills, den höga frekvensen av insertionsmutationer tillåtna infektion med stora pooler som innehåller mutanter kollektivt med flera tätt radavstånd transposon infogningar inom varje gen4 ,12,13,14. TN-Seq har också utvecklats för en bakterie som mutagenes frekvensen är mycket lägre6. Med Leptospira, kan ett bibliotek av transposon mutanter genereras genom att införa transposon på en mobilizable plasmid av konjugering som beskrivs av Slamti et al15. Frekvensen av transposon mutagenes av L. interrogans är dock låg. När den Himar1 transposon introducerades på en konjugering plasmid, rapporterades transconjugant frekvensen vara bara 8,5 x 10-8 per mottagare cell med Lai stam L. interrogans16 och sannolikt är Likaså fattiga med de flesta andra stammar av L. interrogans. Protokollet beskrivs här är delvis baserat på som utvecklats för Borrelia burgdorferi, där frekvensen av transposon insertionsmutationer är också låg6.

För vår pilot experiment med de protokoll17genomförde vi transposon mutagenes med L. interrogans serovar Manilae stam L495 på grund av framgången för andra grupper i isolera transposon införande mutanter i stam tillsammans med dess låga LD50 (dödlig dos) för virulens1. Vi visades 42 mutanter av Tn-Seq och identifierat flera mutant kandidater defekt i virulens, varav två med infogningar i en kandidat adenylatcyklas gen. Individuell testning av två mutanter i hamstrar bekräftade att de var bristfällig i virulens17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: Patogena stammar av Leptospira spp. måste hanteras under biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) inneslutning förfaranden. Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) måste bäras. En klass II biosäkerhet skåp måste användas för alla manipulationer av patogena Leptospira spp.

1. skapande av Transposon Mutant bibliotek15

  1. Överföring av transposon till Leptospira spp. av konjugering (figur 1)
    1. Inokulera en volym av exponentiell fas kultur av patogena Leptospira spp. motsvarar 107 celler i 10 mL Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris medium (EMJH)18,19. Inkubera vid 30 ° C med 150 rpm skakar tills densitet når 2-8 x 108 celler/mL.
      Obs: Den fördubbling tid av patogena Leptospira är 12 till 24 h, beroende på belastningen.
    2. Inokulera 50 µL av givare Escherichia coli stam β216320 bära mobilizable transposon plasmid (pCjTKS2)16 i 5 mL av Luria buljong (LB) kompletteras med 0,3 mM av 2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL kanamycin (Km) och 50 µg/mL spectinomycin (Spc) och plats över natten i en 37 ° C inkubator på 255 rpm.
    3. Inokulera 60 µL av E. coli celler i 3 mL EMJH kompletteras med 0,3 mM av DAP (EMJH + DAP). Inkubera vid 37 ° C 255 rpm agitation för 3-4 h upp till en OD600nm≈ 0,3.
    4. För att montera enheten filtrering (figur 1), placera basen på en 125 mL sida-arm Erlenmeyerkolv, placera ett acetat-cellulosa filter (porstorlek 0,1 mm, diameter 25 mm) på bas och klämma tratten på basen. Anslut den filtrering enheten till ett vakuumsystem.
    5. Tillsätt 5 mL av Leptospira spp.. kultur och 0,5 mL av E. coli kultur till tratten. Vakuum vätskan genom filtret.
    6. Överföra filtret med ytan av bakterier vetter mot en EMJH + DAPplate. Inkubera vid 30 ° C över natten med filtret uppåt.
    7. Placera filtret i en 15 mL tub innehållande 1 mL EMJH och virvel för 10 s att släppa bakterier i media. Sprida 200 µL av upphängning på 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL Km med 10-15 1 mm steril glaspärlor eller en steril engångs spridare. Wrap plattorna med parafilm och inkubera dem upp och ner vid 30 ° C i 3 till 4 veckor tills kolonierna är synliga.
    8. Överföra kolonier individuellt i 3 mL EMJH innehållande 50 µg/mL Km (EMJH + Km) vid 30° C under 150 rpm agitation för 7-10 dagar tills kulturen når en täthet av ≈ 108/ml.
      Obs: Kulturer kan lagras vid-80 ° C eller i flytande kväve (med 4% glycerol).
  2. Identifiering av transposon insättningsstället med nästlade PCR (figur 2)
    1. Lysera 50 µL av varje transposon mutant i PCR-rören genom inkubation vid 95 ° C i 15 min.
      Obs: DNA kan renas i stället använda ett kit för DNA-extraktion.
    2. Förbered PCR-mixen med Deg1 och Tnk1 grundfärger (tabell 3) enligt tabell 1. Överför 23,7 µL av mixen till varje PCR-röret och tillsätt 1,3 µL av lyserat celler. Kör programmet: 95° C i 5 min; 40 cykler: 95 ° C under 15 s, 40 ° C i 1 min, 72 ° C under 2 min; 72 ° C i 10 min.
    3. Gör PCR-mixen med tagg och TnkN1 grundfärger (tabell 3) enligt tabell 2. Överför 24,2 µL av mixen till varje PCR-röret och tillsätt 0,8 µL av PCR-#1 reaktion. Kör programmet: 95 ° C i 5 min; 35 cykler: 95 ° C under 15 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C under 2 min; 72 ° C i 10 min.
    4. Kör 3 µL av PCR-produkter på en 1% agarosgel med 1 X Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert på 10-15 V/cm (figur 2B).
    5. Rena PCR-produkter av positiva prover med en PCR-rening kit. Eluera DNA med den lägsta volymen som tillåts av satsen att maximera koncentrationen av DNA som återvinns.
    6. Skicka renat PCR-produkter för Sanger sekvensering med TnkN1 primer (tabell 3).
    7. Identifiera införande webbplatserna genom att jämföra den resulterande sekvensen med föräldrarnas stammens genomsekvens av BLASTN analys (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) eller använda SpiroScope databas (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21.
    8. Bekräfta insticksstället av transposon med PCR med primers glödgning till de kompletterande värd sekvenserna.
      Obs: Transposon ökar storleken på den wild-type-sekvensen av ≈ 2 kb.

2. djurförsök (figur 3)

  1. Kultur av Leptospira mutanter
    1. Växa individuellt varje valda transposon mutant i 10 mL EMJH + Km på 30 ° C vid 150 rpm agitation till densitet av 107-108 Leptospira/mL.
    2. Räkna Leptospira av mörkt-fält mikroskopi med en Petroff-Hausser räknare eller som beskrivs av Miller23.
    3. Späd varje kultur i EMJH till samma densitet, till exempel 106 celler/mL.
    4. För att montera in poolen, blanda de utspädda kulturerna i lika volymer.
      Obs: Inkludera kontroller i ingående poolen genom att lägga till mutanter med kända fitness defekter såsom loa2217,24 och mutanter med oförändrat fitness såsom ligB17,25, respektive. Pooler av mutanter kan lagras med 4% glycerol vid-80 ° C eller i flytande kväve.
  2. Utmaning
    Obs: De metoder som beskrivs här godkändes av veteraner frågor större Los Angeles institutionella djur vård och användning kommittén (protokoll #09018-14).
    1. Injicera intraperitonealt 1 mL av ingående poolen till varje djur en insulinspruta U-100 med 26G x ½ ”nål.
      Obs: I pilot experimentet utmanades 8 djur med 1 mL av ingående poolen, dvs 106 bakterier totalt17. Infektionen tilläts fortsätta i fyra dagar innan eutanasi.
    2. Samla 10 mL av ingående poolen, och snurra för 20 min vid 3 220 x g. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Lagra cellpelleten på - 80˚C fram till användning (steg 3.1.3).
    3. Övervaka djuren dagligen tills de avslutas vid förutbestämda slutpunkten. Väga hamstrar dagligen och leta efter endpoint kriterier: aptitlöshet, gånganalys eller andas svårigheten, utmattning, ruggig päls, eller förlust av > 10% av den maximala vikten uppnås.
  3. In vitro experiment
    1. På dagen för utmaningen, Inokulera 3 flaskor med 25 mL EMJH + Km med 5 mL av ingående poolen. Odla kulturer vid 30 ° C under 150 rpm agitation.
    2. Räkna Leptospira dagligen med någon av metoderna i avsnitt 2.1.2. När densiteten når ≈ 1 x 108/ml, snurra ner varje suspension för 20 min vid 3 220 x g.
    3. Lagra cell pellets vid-80 ° C fram till användning.
  4. Skörd och förvaring av vävnader
    1. Euthanize djuren av isofluran inandning följt av bilaterala torakotomi26.
    2. Omedelbart samla 1 till 2 mL blod genom hjärt punktering med en 3 mL spruta och injektionsnål 25G x 5/8 ”. Överföra blod i rör som innehåller EDTA. Blanda genom inversion, 5 till 6 gånger.
    3. Samla ihop en njure och ⅓ till ½ av den ventrala median LOB i levern till frysrör.
    4. Lagra vävnader vid-80 ° C fram till användning.

3. konstruktion av Genomic Libraries for High-throughput sekvensering (figur 4)

  1. DNA-extraktion
    1. DNA-extraktion från blodet.
      1. Över 100 µL blod från EDTA röret i en mikrocentrifug rör.
      2. Rena DNA med hjälp av ett DNA extraktion kit. Följ tillverkarens instruktioner.
    2. DNA-extraktion från vävnader.
      1. Använda skalpeller och sax, tärna mellan 50 till 80 mg varje organs i små bitar (1 x 1 mm) och överföra dem till en steril skruvkork torrt rör. Mäta vikten av vävnad med en precision balans.
      2. Tillsätt 500 µL sterilt PBS i röret.
      3. Homogenisera prover genom disruptor för 1 min på 5 rörelser per sekund.
      4. Beräkna volymen motsvarar 25 mg av vävnad med hjälp av följande ekvation:
        Equation 1
      5. Över den beräknade volymen till DNA extraktion kit. Fortsätt med DNA-rening efter tillverkarens anvisningar.
    3. DNA-extraktion från de ingående pool och in vitro- kulturerna.
      1. Tina bakteriell pellets i rumstemperatur i 5-10 min.
      2. Fortsätt med DNA-extraktion som följer de anvisningar som medföljer kitet.
    4. Butiken DNA vid-80 ° C fram till användning.
  2. Klippning DNA (figur 5)
    1. Över 50 µL av extraherat DNA på ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
    2. Placera rören i racket av någon sonikator cup horn fylld med kallt vatten (4 ° C).
    3. Köra den någon sonikator för 3 min på 80% intensitet med 10 s på puls och 5 av puls.
      FÖRSIKTIGHET: Bära hörselkåpor eller öronproppar att skydda hörsel.
    4. Kör 2,5 µL av de klippt DNA på en 2% agarosgel att bekräfta att de flesta av DNA är < 600 bp i storlek.
  3. Tillägg av C-tail
    1. Mäter DNA-koncentration med en liten volym spektrofotometer.
    2. Beräkna volymen motsvarar 500 ng DNA med hjälp av följande ekvation:
      Equation 2
    3. Förbereda tailing reaktion (tabell 4). Inkubera vid 37 ° C, 1 h Inaktivera vid 75 ° C i 20 min.
      Obs: För prover som kräver justering till en volym som är större än 14,5 µL, öka den avslutande volymen i reaktion till 40 µL och skala upp de återstående delarna med detta.
    4. Ren av prov med en PCR-rening kit. Eluera DNA med 12 µL av eluering buffert.
  4. Nästlade PCR
    1. PCR #1
      1. Förbered PCR blandar enligt tabellerna 3 och 5. Överför 22 µL av bibliotek mixen till varje PCR-röret och tillsätt 3 µL av renade DNA. Fortsätt på samma sätt med kontroll mix.
        Obs: Primer TnkN317 är specifika för transposon och primer olj3766 är specifika för C-svansen. Kontroll mixen saknas den TnkN3 primer, som specifikt riktar transposon.
      2. Kör följande program: 95 ° C under 2 min; 24 cykler: 95 ° C i 30 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 2 min; 72 ° C under 2 minuter.
    2. PCR #2.
      1. Förbereda andra PCR-mixar enligt tabellerna 3 och 6. Över 49 µL av bibliotek mixen till varje PCR-röret och tillsätt 1 µL av PCR-#1 bibliotek reaktion. Överför 24,5 µL av kontroll mixen till varje PCR-röret och tillsätt 0,5 µL av PCR-#1 kontroll reaktion.
        Obs: Primer pMargent2 är specifika för transposon och den IP-primers6 innehåller sex-base-par streckkod och specifika sekvenser identifieras av nästa generations sekvensering plattformen.
      2. Kör följande program: 95 ° C under 2 min; 18 cykler: 95 ° C i 30 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 2 min; 72 ° C under 2 minuter.
    3. Kör 3 µL på en 2% agarosgel. Biblioteket ska visa ett utstryk med majoriteten av signalen mellan 200 till 600 bp (figur 6) och ingen amplifiering för kontrollreaktionen.
  5. Rening av PCR-produkter.
    Obs: Ren genomisk biblioteken med en PCR-rening kit följa tillverkarens instruktioner. Eluera DNA med 30 µL av eluering buffert.
  6. Mätning av DNA koncentrationen använder en fluorometer. Genomsnitt 2 till 3 läsningar.
  7. Beräkna volymen av varje bibliotek som motsvarar 15 eller 20 ng med hjälp av ekvationen nedan:
    Equation 3
  8. Blanda alla bibliotek tillsammans enligt tidigare beräkningar. Avgöra den molära koncentrationen av DNA med webbplatsen följande ekvation:
    http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
    FÖRSIKTIGHET: DNA koncentrationen och volym kraven beror på sekvensering plattformen.

4. high-throughput sekvensering och dataanalys

  1. Sekvensering
    1. Sekvens bibliotek som 64 bp single-end läser med hjälp av den anpassade sekvensering primer pMargent3 och standard kommersiella sekvensering primer. Sekvensering plattformen får du FastQ filer med alla sekvensering läsningar.
  2. Analys med Galaxy programvara
    1. Hämta filen genome sequence
      1. I SpiroScope databasstartsidan (se punkt 1.2.7 för länk), Välj den organism som används för experiment och klicka på ”LOAD i genomet BROWSER”.
      2. I verktygsfältet (högt upp på hemsidan), Välj ”Sök/Export > Hämta data”, i raden ”Sequence (fasta)”, klicka ”genomet” för att ladda ner sekvensen.
      3. Öppna filen med Notepad (PC) eller TextEdit (Mac) och döp kromosomen (till exempel ”ChrI”). Upprätthålla den fasta formatet.
      4. Följ samma steg för att hämta sekvensen av kromosom II. Kombinera båda kromosom sekvenser i en enda .txt-fil genom att kopiera och klistra in.
        Obs: Kromosom sekvenser kan också hämtas från NCBI webbplats (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) och kombineras till en enda .txt-fil.
    2. Ladda upp filer till servern Galaxy
      Obs: Galaxy är en öppen källkod, web-baserad plattform för att hantera data intensiv bioinformatik arbetsflöden27,28,29,30 och kan nås på https://usegalaxy.org/.
      1. I Verktyg-menyn, välj ”Hämta data > överföra filen från din dator”. Dra och släppa den .fastq fil(er) som genereras av sekvensering plattformen i fönstret och klicka på ”Start”.
      2. Följ samma steg för att ladda upp Leptospira genome sequence txt-filen.
    3. Brudgummen läser
      1. Välj ”NGS: QC och manipulation > FASTQ Groomer” från menyn verktyg.
      2. Laddat upp i steg 4.2.2 bredvid filen till brudgummen, Välj bibliotek. I Input FASTQ kvalitet noter typ, Välj lämplig sekvensering systemet. Lämna Dölj avancerad Office valts för avancerade alternativ.
      3. Klicka på ”Kör”.
    4. Ta bort sekvensering artefakter
      1. Välj ”NGS: QC och manipulation > Ta bort sekvensering artefakter”. Bredvid bibliotek för att filtrera, väljer du de preparerade filer som genereras i steg 4.2.3. Klicka på ”Kör”.
    5. Ta bort C-tail sekvenser
      Anm: Upprepa dessa åtgärder för en eller två gånger för att säkerställa alla C-svansar tas bort.
      1. Välj ”NGS: QC och manipulation > klipp adapter sekvenser”.
      2. Välj eller ange följande:
        Biblioteket till klipp: Välj de filer som genereras i steg 4.2.4.
        Minsta sekvens längd: 15
        Källa: ange anpassad sekvens
        Ange anpassade klippning sekvens: CCCCCCC
        Ange noll värde för att hålla adapter sekvenser och x baser som följer den: 0
        Kassera sekvenser med okänd (N) baser: Ja
        Utdataalternativ: utgång både klippta och icke-klippt sekvenser
      3. Klicka på ”Kör”.
    6. Ta bort adaptern sekvenser
      1. Välj ”NGS: QC och manipulation > klipp adapter sekvenser”.
      2. Välj eller ange följande:
      3. Biblioteket till klipp: Välj filer som genereras i steg 4.2.5.
      4. Minsta sekvens längd: 15
      5. Källa: ange anpassad sekvens
      6. Ange anpassade klippning sekvens: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Ange noll värde för att hålla adapter sekvenser och x baser som följer den: 0
      8. Kassera sekvenser med okänd (N) baser: Ja
      9. Utdataalternativ: utgång både klippta och icke-klippt sekvenser
      10. Klicka på ”Kör”.
    7. Filter läsningar utifrån deras kvalitet
      1. Välj ”NGS: QC och manipulation > Filtrera efter kvalitet”.
        Obs: Detta verktyg väljer läser baserat på kvalitetsresultat.
      2. Välj följande:
        Bibliotek för att filtrera: Välj de filer som genereras i steg 4.2.6.
        Kvalitet cut-off värde: 20
        Procent av baser i sekvens som måste ha kvalitet lika till/högre än frånslagsvärdet: 95
      3. Klicka på ”Kör”.
        Obs: Med de här inställningarna ignoreras läser kortare än 20 nukleotider eller med en kvalitet poäng av 20 eller mindre för 95% av cykler. Anpassa stringens inställningarna till ditt experiment.
    8. Karta läser32
      1. Välj ”NGS: kartläggning > Bowtie2”32.
      2. Välj följande i fälten i huvudfönstret:
        Är detta enda eller parkopplade bibliotek: single-end
        FASTQ-fil: Välj biblioteket filtreras för kvalitet från steg 4.2.7.
        Skriva rundbordsvridning (i fastq format) läser för att separera fil(er): ingen
        Skriva anpassade (i fastq format) läser för att separera fil(er): ingen
        Kommer du att välja en referens arvsmassa från historiken eller använda en inbyggd index?: Använd en arvsmassa från historien och bygga index
        Välj referens genomet: Välj Leptospira genome.txt filen laddas upp i steg 4.2.2.
        Uppsättning Läs grupper information?: Ange inte
        Välj Analysläge: 1: standardinställningen endast
        Vill du använda förinställningar?: Nej, bara använda defaults
        Spara bowtie2 mappning statistiken till historien: Nej
        Jobb resurs parametrar: Använd standard resurs jobbparametrar
      3. Klicka på ”Kör” om du vill justera läsningar till genomet.
    9. Konvertera filer
      1. Välj ”NGS: SAMtools > BAM-till-SAM konvertera BAM till SAM”.
      2. Välj följande:
        BAM-fil att konvertera: Välj mappad bibliotek från steg 4.2.8.
        Alternativ för sidhuvud: inkludera rubrik i SAM utdata (-h)
      3. Klicka på ”Kör”.
    10. Konvertera filer
      1. Välj ”NGS: SAMtools > Konvertera SAM till intervall”.
      2. Välj följande:
        Välj datamängd att konvertera: Välj den SAM mappade biblioteksfil som genereras i steg 4.2.9.
        Skriva ut alla?: Ja
      3. Klicka på ”Kör”.
    11. Sortera läsningar
      1. Välj ”filtrera och sortera > Sortera data i stigande eller fallande ordning”.
      2. Välj följande:
        Sortera datamängden: Välj den intervall-fil som genereras i steg 4.2.10.
        på kolumn: 2
        med smak: nummerordning
        allt i: stigande ordning
      3. Klicka på ”Kör”.
    12. Välj läsningar på kromosom jag
      1. Välj ”filtrera och sortera > Välj rader som matchar ett uttryck”.
      2. Välj följande:
        Välj rader från: Välj fil med sorterade läser som genereras i steg 4.2.11.
        som: matchande
        mönstret: Ange namnet på kromosom som bestäms i steg 4.2.1.3 (t.ex., ”ChrI”).
      3. Klicka på ”Kör”.
    13. Välj läser matchande kromosom II
      Fortsätta efter steg 4.2.12.
    14. Gruppen som läser enligt infogningar platserna i kromosom jag
      1. Välj ”Gå med i, subtrahera och grupp > gruppera data efter en kolumn och sammanlagda manövrering på andra kolumner”.
      2. Välj följande:
        Välj data: Välj resulterande filen från steg 4.2.12.
        Gruppera efter kolumn: 2
        Ignorera skiftläge samtidigt som du grupperar?: Nej
        Ignorera rader som börjar med dessa tecken: Ø
        Drift > + Infoga funktion
        Typ: räkna
        På kolumn: 2
        Avrunda resultatet till närmaste heltal: Nej
      3. Klicka på ”Kör”.
    15. Grupp läser enligt införande platserna i kromosom II
      Fortsätta efter steg 4.2.14.
    16. Sortera införande platser på kromosom jag
      1. Välj ”filtrera och sortera > Sortera data i stigande eller fallande ordning”.
      2. Välj följande:
        Sortera Dataset: Välj filen från steg 4.2.14.
        på kolumn: 1
        med smak: nummerordning
        allt i: stigande ordning
      3. Klicka på ”Kör”.
    17. Sortera införande platser på kromosom II
      Fortsätta efter steg 4.2.16.
  3. Statistisk analys
    1. Överföra Galaxy data till kalkylbladsfiler genom att kopiera och klistra in de två kolumnerna från trappan 4.2.16. och 4.2.17. i en Excel-fil.
      Obs: Den första kolumnen är nukleotid koordinat transposon insticksstället, och den andra kolumnen är antalet läsningar på varje insticksstället.
    2. Identifiera den gen som härbärgerat den transposon använder nukleotid koordinaten anges i tabellen.
      Obs: till exempel en transposon infogas vid nukleotid #30718 med kromosomen jag är ligger i genen LIC10024 , som sträcker sig över nukleotider 29263-31539 i kromosom I.
    3. Beräkna relativa frekvenser (F) för varje mutant i varje vävnad och ingående poolen efter ekvationen nedan:
      Equation 4
    4. Beräkna in/ut nyckeltal (R) för varje mutant och vävnad med hjälp av ekvationen nedan:
      Equation 5
    5. Wilcoxon undertecknat-rank-test
      1. Normalisera alla in/ut nyckeltal genom att ange förhållandet medianvärdet för varje vävnad i varje djur till 1.0. Ett förhållande på 1.0 är neutral, > 1.0 är ofördelaktigt, och < 1.0 är fördelaktiga33.
      2. Jämföra in/ut nyckeltal till 1.0 (neutral lämplighet) med hjälp av Wilcoxon rank-test med P värden < 0,05 anses statistiskt signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skapandet av ett bibliotek av transposon mutanter i L. interrogans av konjugering kräver en filtrering enhet, som visas i figur 1. Vi återhämtade sig 100-200 transconjugants från varje parning.

Transposon insticksstället identifieras i varje mutant av sekvensering av PCR-produkten genereras av semi-slumpmässigt PCR som mål i slutet av transposon och intilliggande värd sekvenser15 (figur 2A). Ett exempel på resultat av semi-slumpmässigt PCR visas i figur 2B. I de flesta fall observeras en dominerande amplikon när Deg1 och Tnk1 primers används för den första omgången av PCR och Tag och TnkN1 för den andra omgången. På grund av låg specificitet pentamer sekvensen (... N10GATAT-3') på 3' ände Deg1 primer, kommer denna primer glödga på flera platser i hela leptospiral genomet. Om dessa platser finns nära transposon slutet, kan flera PCR-produkter erhållas. När flera amplikoner genereras, kan de renas tillsammans från PCR-mixen och sekvenserade direkt; gel rening varje Restriktionsenzymanalys av kopian är inte nödvändigt eftersom de alla innehåller samma sekvens nedströms av där TnkN1 primer anneals. Däremot, kan PCR misslyckas om den närmaste kopian av sekvensen riktade av Deg1 primern ligger på stort avstånd från transposon slutet. Om ingen PCR-produkter upptäcks, kan den första omgången av semi-slumpmässigt PCR upprepas med Deg1 primer och Tnk2 primer, som riktar sig till den motsatta änden av transposon. I detta fall skulle TnkN2 och Tag användas för den andra omgången; ospädd skulle sekvenseras med TnkN2 primer (figur 2B). Alternativt, den första omgången av PCR kan göras med den ° 2 primern, vars 3' slut (... N10TCTT-3') riktar en fyra - snarare än en fem-nukleotidsekvensen. Fyra olika uppsättningar av primers kan användas för den första omgången av PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1, Tnk1 + ° 2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + grader 2. När en uppsättning primers inte fungerar, använda en annan uppsättning. Om denna andra uppsättningen också misslyckas, använda en annan och så vidare. Spontan kanamycin resistenta mutanter är mycket sällsynta, och uppstå med en frekvens som < 10-10 34.

Under beredningen av genomisk bibliotek (figur 4), kan ett par steg verifieras. Klippning DNA av ultraljudsbehandling bör bekräftas genom elektrofores av en alikvot i en agarosgel (figur 5). När DNA är klippt korrekt, bildar DNA-fragment som sträcker sig från 200 till 600 bp kommer ett utstryk i en 2% agarosgel. Innan du skickar bibliotek för hög genomströmning sekvensering, måste generering av PCR-produkter av nästlade PCR-reaktioner bekräftas av agaros gel-elektrofores (figur 6).

Efter bearbetning den sekvensering läser efter protokollet beskrivs här (avsnitt 4.2), bestäms frekvensen av varje mutant i ingående poolen och i alla vävnader med hjälp av ekvation i avsnitt 4.3.3. Förhållandet utgång/ingång för varje mutant i varje vävnad beräknas med ekvation i avsnitt 4.3.4. Figur 7 visar ett exempel på resultat som erhållits med Tn-Seq inställning. Alternativt kan verktyget MAGenTA användas för att bearbeta och analysera sekvensering data 31. Mutanter med statistiskt signifikant minskad och ökad fitness identifierades. Mutationer i kända leptospiral virulensgener orsakade nedsatt kondition, validera metoden Tn-Seq.

Figure 1
Figur 1: filtrering enhet som används för konjugation. Den filtrering enheten monteras genom att infoga proppen filter stöd i en side-arm Erlenmeyerkolv positionering acetat-cellulosa filtret på basen med steril pincett, och sedan placera tratten på basen och säkra systemet med en klämma . Den filtrering enheten ansluts sedan till vakuum systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: identifiering av transposon införande webbplatser. (A) systemet visar glödgning platser av semi-slumpmässigt PCR primers. Tnk1 och Tnk2 primers glödga nära de motsatta ändarna av transposon (Tn). Deg1 är en 35-nukleotid primer som innehåller en sträcka av 10 degenererade nukleotider följt av en sekvens GATAT i 3' slutet. Den första omgången av PCR (PCR #1) bedrivs med Deg1 och Tnk1 eller med Deg1 och Tnk2. TnkN1 och TnkN2 primrar, används för PCR #2, glödga mellan transposon ändar och Tnk1 och Tnk2, respektive. Sekvensen av taggen primern är identisk med 5' slutet av Deg1 primer. (B) exempel på agarosgel erhålls efter den andra omgången av PCR med 14 transposon mutanter (körfält 1 till 14). Den första omgången av PCR utfördes med Deg1 och Tnk1; andra rundan var klar med tagg och TnkN1. positiv PCR representeras av ”+” och en negativ PCR av ”-”. ”KmR” representerar kanamycin motstånd kassett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödesschema för att erhålla produktionen poolen. På dagen för utmaning (dag 0), är varje leptospiral mutant räknas av darkfield mikroskopi, utspädd till samma densitet och kombineras för att bilda den ingående poolen (kontaktuppgifter finns i avsnitt 2.1). Hamstrar utmanas intraperitonealt med ingående poolen. Dessutom startades tre kulturer med ingående poolen. På dagen av inympningen (dag 0) och när kulturerna når en täthet av ≈ 108/ml, ingång poolen och kulturer insamlas genom centrifugering och sparas som pellets vid-80 ° C fram till användning (se avsnitt 2.3). På den endpoint (dag förvald för att avsluta de djur, t.ex., dag 4 efter utmaning), är djur euthanized; blodet, njurarna och levern är samlas in och lagras vid-80 ° C fram till användning (se avsnitt 2.4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: flödesschema av genombibliotek preparatet. (A) DNA utvinns ur blod-, vävnads- eller kulturer efter protokollet beskrivs i avsnitt 3.1. Den röda rutan representerar transposon (Tn). (B) The DNA är klippt av ultraljudsbehandling i fragment mellan 200 och 600 bp. Ytterligare detaljer finns i avsnitt 3.2. (C) C-svansar (gula rutor) läggs till alla DNA-fragment med terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT) som beskrivs i avsnitt 3.3 och tabell 4. Genombibliotek förbereds för sekvensering av nästlade PCR (D-E). Den första omgången av PCR utförs med TnkN3 och olj376 primers som är specifika för transposon och C-svansen, respektive. Se tabell 3 och 5. Endast fragment som innehåller transposon ändarna (röd ruta) förstärks. Obs: Använd 3 gånger mer olj376 primer än TnkN3 eftersom alla DNA-fragment har C-svansar. Den andra omgången av PCR utförs med pMargent2, specifika för transposon slutet och en indexering primer, innehållande en sex-base-par streckkod sekvens (i rosa) så att alla prover att vara multiplexed i ett enda sekvensering körfält. Se tabell 3 och 6. Båda primers innehåller sekvenser som är nödvändiga för bindande cellen flöde under Illumina sekvensering (gröna och lila box). (F), resulterande PCR produkter rengörs och sedan deras koncentration mäts enligt beskrivningen i avsnitt 3.6. (G) alla genomisk bibliotek sammanförs tillsammans; varje bibliotek har en annan streckkod och (H) poolen skickas till sekvensering plattformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: ultraljudsbehandling av DNA. DNA renades ur lever från åtta infekterade hamster (körfält 1 till 8), sonicated, och granskas av elektrofores i en 2% agarosgel. Klippt DNA kännetecknas av ett utstryk där storleken på de flesta fragmenten är mellan 200 och 600 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: genomisk bibliotek för hög genomströmning sekvensering. Genomisk bibliotek var beredd av serade PCR med DNA från blodet av åtta infekterade hamstrar (körfält 1 till 8) och granskas av elektrofores i en 2% agarosgel. Storleken på de flesta PCR-produkterna är mellan 200 och 600bp. negativ kontroll (ingen TnkN3 primer i PCR-#1 mix, se tabell 5) visar ingen amplifiering (visas inte). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Fitness av mutanter från Tn-Seq experiment. Fitness i en pool av mutanter i hamster's njure 4 dagar efter utmaning (anpassad från Lourdaults studie17). In/ut förhållandet mellan alla 42 mutanter fastställdes för varje djur. Varje mutant namnges av genen (lic) eller regionen intergenic (inter) transposon infogas eller namnet vanligen används i litteraturen. Varje baserat representeras av en svart diamant. Medianen av nyckeltal (röda linjen) var bestäms för varje mutant och jämfört med 1,0 i Wilcoxon rank test. Den streckade linjen representerar fitness 1.0, vilket motsvarar neutral fitness. Mutanter vars lämplighet påverkas signifikant markeras med asterisker: * P < 0,05; ** P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagenser Volymen för en reaktion
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Primer 1, 10 mM (TnK1 eller TnK2) * 1,2 ΜL
Primer 2, 10 mM (Deg1 eller ° 2) * 1,2 ΜL
Vatten 8,8 ΜL
Mall (celler lysat eller DNA) 1.3 ΜL
Slutlig volym 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 1: Identifiering av transposon insticksstället, semi-slumpmässigt PCR #1 mix.

Reagenser Volymen för en reaktion
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Primer 1, 100 mM (TnKN1 eller TnKN2) * 0.2 ΜL
Primer 2, 100 mM (Tag) * 0.2 ΜL
Vatten 10.1 ΜL
PCR-produkter från PCR-#1 0.8 ΜL
Slutlig volym 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 2: Identifiering av transposon insticksstället, semi-slumpmässigt PCR #2 mix.

Namn Sekvens (5' - 3') Referens
Primers används för semi-slumpmässigt PCR
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
° 2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Tag GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Primers används för Illumina sekvensering
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina sekvensering (streckkoder i fetstil)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP-seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tabell 3: Primer sekvenser.

Reagenser Volymen för en reaktion
Klippt DNA 500 ng (se ekvation i 3.3.2.)
Vatten Upp till 14,5 µL
5 x TdT buffert 4 ΜL
(9,5 mM dCTP + 0,5 mM ddCTP) mix * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0,5 ΜL
Slutlig volym 20 µL
* Blanda 3 µLof 10 mM ddCTP, 5,7 µL av 100 mM dCTP och 51,3 µL av vatten

Tabell 4: C-tailing reaktion med terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT).

Reagenser Volymen för en reaktion
Bibliotek reaktion Kontrollreaktionen
Master mix 2 x 12.5 ΜL 12.5 ΜL
Primer 1, 30 µM (TnkN3) * 0,5 ΜL -
Primer 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Vatten 7.5 ΜL 8 ΜL
C-tailed DNA 3 ΜL 3 ΜL
Slutlig volym 25 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 5: Konstruktion av genombibliotek, PCR #1 mix.

Reagenser Volymen för en reaktion
Bibliotek reaktion Kontrollreaktionen
Master mix 2 x 25 ΜL 12.5 ΜL
Primer 1, 30 µM (pMargent2) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Primer 2, 30 µM (indexering primer) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Vatten 23 ΜL 11.5 ΜL
PCR-produkter från PCR-#1 1 ΜL 0,5 ΜL
Slutlig volym 50 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 6: Konstruktion av genombibliotek, PCR #2 mix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om resultaten från vår pilot experiment för hamster utmanas intraperitonealt med 42 L. interrogans mutanter presenteras17, förväntar vi oss att större pooler av mutanter kan kontrolleras av Tn-följande punkter Eftersom frekvensen av transconjugants är låg (100-200 transconjugants/parning), flera parningar är nödvändiga för att generera ett tillräckligt antal mutanter för stora Tn-Seq experiment. Att upprätthålla ett stort antal mutanter i flytande kulturer presenterar logistiska utmaningar som måste lösas. Kulturer kan inkuberas i djup 96 brunnar. Kultur tätheter kan övervakas av Absorbansavläsningar i en spektrofotometer inställd på 420 nm. Fastställande av antalen djur som använder beror delvis på storleken på de ingående poolen och måste fastställas av power analys. För storskaliga experiment rekommenderar vi att den power-analysen utförs i samråd med en biostatistiker.

Flaskhalsar kan påverka återvinning av slumpmässiga mutanter från utdata poolen. Även om allvarliga flaskhalsar inte observerades i vår pilotstudie17 (figur 7), påverkas storskaliga experiment av slumpmässig förlust av mutanter. Dosökning utmaning genom att öka antalet celler per mutant i ingående poolen kommer att minimera risken för flaskhalsar35. Verktyget för nyutkomna Galaxy MAGenTA ger den nödvändiga verktyget för att bedöma flaskhalsar och fitness31.

TN-Seq experiment planeras för en alternativ väg för infektion, andra Leptospira stammar eller andra gnagare modeller kräver ytterligare överväganden. Om kinetiken för infektion i värdarter inte är känd eller inte är kontinuerligt exponentiell under infektion inom varje vävnad undersökas, bör DNA erhållas från odling av vävnader i stället för direkt från vävnaderna. Detta ytterligare steg kommer att minimera överskattningar av muterade kondition på grund av upptäckten av DNA från döda spiroketer. Om utdata poolen erhålls från odla vävnader, bör ingång poolen vara odlade till adress effekter av in vitro- tillväxt. Vi rekommenderar också ett pilotprojekt experiment med ett litet antal mutanter att avgöra huruvida flaskhalsar blir ett bekymmer och att hjälpa makt analysen för storskaliga experiment.

Bekräftelse av förändrad fitness som bestäms av Tn-Seq kommer att kräva provning av enskilda mutanter i en djurmodell. För närvarande måste varje mutant sekvenseras individuellt före Tn-Seq att identifiera den muterade transporterar insättningspunkten i genen av intresse. Dock om allel ersättare i patogena Leptospira blir lätt, blir sekvensering av enskilda mutanter inte längre nödvändigt. Alternativt, transkription aktivator-liknande effektorer har framgångsrikt använts för att minska lig gener uttryck i L. interrogans36. Denna teknik kan användas för att ned-reglera gener störs i mutanter med förändrad fitness identifieras av Tn-följande punkter

När tolkning av Tn-Seq data, bör interaktioner mellan bakterier beaktas. Det är teoretiskt möjligt att en minskning av fitness kan bero på konkurrens mellan mutanter i stället för en direkt effekt av transposon insättningspunkten. Dessutom kan en avsaknad av förändring i vivo konditionen av en mutant i en pool bero på samarbete mellan mutanter. Exempelvis skulle en mutant som misslyckas med att producera en väsentlig faktor kunna kompletteras intercellularly med produktion av faktorn av andra mutanter i poolen. Vi observerat en ökning i lämplighet för flera mutanter, som kan vara en följd av nedsatt metabolisk bevisbördan längre syntetisera proteiner som inte är väsentliga för tillväxt, som visas för Salmonella enterica37.

Detta protokoll kan användas för att identifiera gener som är involverade i metabolismen eller överlevnad under påfrestande förhållanden in vitro- 38,39. Växande Leptospira i olika förhållanden som höga natriumklorid koncentration, begränsad järn och sura pH kan till exempel identifiera gener som ansvarar för sura överlevnad eller stress motstånd. Dessa i vitro experiment kan även utföras med saprofytiska stammar såsom L. biflexa stam Patoc jag eftersom detta Tn-Seq-metoden kan tillämpas på alla sekvenserade Leptospira stammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en veteraner frågor Merit Award (till D.A.H.) och en National Institute of Health bevilja R01 AI 034431 (D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

Immunologi fråga 130 High-throughput sekvensering slumpmässig mutagenes nästlade PCR konjugation Leptospira fitness mutanter bibliotek
Hög genomströmning parallella sekvensering att mäta konditionen av <em>Leptospira interrogans</em> Transposon införande mutanter under gyllene syriska Hamster infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter