Summary
Обычные методы использование вирусного генома амплификации ограничены, их неспособность различать инфекционных от неинфекционных частиц. Цель этой статьи — предоставить подробные протоколы для альтернативных методов для оказания помощи в дискриминации инфекционных норовирус частиц с помощью привязки aptamer, Динамическое рассеяние света и просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Человека норовирус виктимизацией значительного общественного здравоохранения и экономических потерь во всем мире. Возникающие в vitro успехи выращивания еще не применимы для рутинной обнаружения вируса. Текущий обнаружения и количественного определения методов, которые полагаются главным образом на амплификации нуклеиновых кислот, не допускали дискриминации инфекционных от неинфекционных вирусных частиц. Цель этой статьи – представить конкретные сведения о последних достижениях в методы, используемые вместе, для того чтобы получить также информацию о статусе инфективности вирусных частиц. Один метод предполагает оценки привязки норовирус ssDNA aptamer к capsids. Аптамеры имеют преимущество быть легко синтезируется и изменения и недорогой и стабильной. Другой метод, динамического рассеяния света (DLS), имеет преимущество наблюдения за поведением капсида в растворе. Электронная микроскопия позволяет для визуализации структурной целостности вирусных capsids. Хотя перспективные, есть некоторые недостатки каждого метода, например неспецифические aptamer привязку положительно заряженные молекулы из Образец матрицы, требование очищенный капсид для DLS и плохой чувствительностью для электронной микроскопии. Тем не менее когда эти методы используются в сочетании, тело получаемых данных обеспечивает более полную информацию о целостности норовирус капсида, который может использоваться для выведения инфективности, информация, которая имеет важное значение для точной оценки методы инактивации или интерпретации обнаружения вирусов. Эта статья обеспечивает протоколы для использования этих методов дискриминации инфекционных человека норовирус частиц.
Introduction
Человека норовирус отвечает за бремя значительного общественного здравоохранения во всем мире, вызывая около 685 миллионов заболеваний и 212 000 смертей ежегодно1, стоимостью в миллиарды долларов2,3. Сегодня норовирус обнаружения и количественного определения включает амплификацию генома и/или лиганд-платформ. Первый обычно предпочтительным, как он является более чувствительным, обеспечивает количественную информацию и имеет обычно более низкий риск4ложных положительных результатов. Наиболее распространенными норовирус обнаружения и количественного определения генома усиления техники является обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Потому что она направлена и усиливает небольшой сегмент генома человека норовирус, RT-ПЦР в одиночку не способны проводить дискриминацию между инфекционных и неинфекционных частицы, как свободный геномной РНК, повреждения capsids, содержащие геномов и capsids с смертельно мутировал/усечен геномов могут по-прежнему усиливается RT-ПЦР. Хотя недавно поступили два новых в vitro культивирования методов для человека норовирус5,6 , оба по-прежнему полагаются на RT-ПЦР для количественного определения вирусов и еще не являются возможные методы для рутинных клинических и экологические тестирование для человека норовирусы. Таким образом RT-ПЦР остается золотым стандартом для клинических/окружающей среды тестирования.
В попытке лучше оценить состояние инфективности норовирус частиц были разработаны другие методы в пробирке . Эти методы могут быть вообще отнесены те, которые касаются целостность норовирус капсида и те оценки целостности генома. Первый подход является более популярным. Часто используемым методом является РНКазы предварительной обработки до извлечения вирусного геномной РНК, однако это не учитывает вирусные частицы, которые остаются нетронутыми, но не имеют возможности привязки узла рецепторов/co факторов, а также вирусные частицы, которые мутировали смертельно или обрезать или незначительно повреждены геномов7. Капсид целостность может также оцениваться основано на способности вируса для привязки к человека норовирус co-receptor/co факторов, которые являются углеводы известен как группа крови histo антигены (HBGAs). HBGAs присутствуют в кишечной эпителиальных клеток хозяина в составе гликопротеинов или гликолипидов (среди нескольких других тканях) и может быть сделано секретным в телесных жидкостей, таких как слюна. Также было показано кишечные бактерии, содержащие HBGA-подобных веществ на их поверхности, привязать человека норовирус8,9,10, и такого взаимодействия может способствовать норовирус инфекции5. Основная концепция использования HBGA привязки является, что только вирусные частицы способны привязки предполагаемого рецептор/co-factor будет способен заражать клетки. Множественные исследования показывают, что шарик-привязку на основе HBGA предшествующего амплификация нуклеиновой кислоты является перспективным методом инфективности дискриминации11,12,13,14, 15,16. Одной из основных задач относительно HBGAs является, что без одного HBGA типа можно привязать все человеческие норовирус генотипов. Для решения этой проблемы, свиного желудка муцина, который содержит HBGAs, был использован вместо очищенный HBGA углеводы в интересах простоты синтеза, последовательность и снижение стоимости.
В недавно опубликованном Мур и др. 17 представил набор новых методов для оценки целостности человека норовирус капсида. Вместо HBGAs, Мур и др. 17 расследование привязки широко реактивной нуклеиновой кислоты aptamer (M6-2)18 и19 широко реактивной моноклональных антител (NS14) – термически capsids GII.4 Сидней норовирус (вирус типа частиц или VLP) и сравнил это для привязки к синтетическим HBGAs. Нуклеиновые кислоты аптамеры являются короткие (~ 20-80 nt) одного мель нуклеиновые кислоты (ssDNA или РНК), сложить в уникальных трехмерных структур вследствие их последовательности и связывающие цели. Потому что они нуклеиновых кислот, они являются менее дорогостоящими; легко химически синтезированных, очищенная и изменение; и стабильной для тепла. Существует несколько сообщений о аптамеры генерируется против норовирусов, с некоторыми из них показаны широкий реактивности в различных штаммов18,20,21,22. В качестве примера, Мур и др. 17 показали что aptamer M6-2 привязан к capsids очищенный, собранных человека норовирус (VLP) и аналогичным образом относились к HBGA в зависимость от вирусного капсида поддерживать высшего порядка (например, среднее и высшее) структуры белков для Привязка к произойти. С другой стороны значительная доля норовирус VLP Связывание антитела к NS14 остались после того, как были полностью денатурированный capsids. Оценка норовирус привязки в исследовании Мур и др. 17 было сделано с помощью простой, основанного на пластину метода аналогичны ELISA, за исключением, что вместо антитела используются аптамеры (отсюда был вызван метод ELASA). Этот экспериментальный метод высокой пропускной способности использовался для оценки влияния различных методов лечения на норовирус капсида, работу, которая является ценной для понимания механизма вирусной инактивации после воздействия на физические или химические раздражители. Однако один из недостатков этого метода является нижней чувствительность и отсутствие терпимости для матрицы связанные загрязняющих веществ на более высоких уровнях, которые вызывают неспецифической привязки путем аптамеры.
Мур и др. 17 используется другой метод, динамического рассеяния света (DLS), для мониторинга агрегации вирусных частиц в ответ термической обработки. DLS часто используется для оценки размера наночастиц суспензий и был продлен до23,белки вирусов и24 26,-25,27. Интенсивность света, рассеянного частиц в растворе колеблется в зависимости от размера частиц, позволяя для расчета коэффициента диффузии и затем диаметр частиц, устоявшихся формулам. DLS технику можно отличить гидродинамические диаметр дисперсных частиц вплоть до наноразмерных, который позволяет обнаружения рассредоточенных вирусов, отдельных капсульных белков или димеры и вирус статистическими выражениями, основанными на размер27. Вирус агрегации, представленный увеличение размера частиц, свидетельствует о потери целостности капсида. Как денатурировано капсида и нарушается его структуры, гидрофобные остатки подвергаются и вызывают частицы слипаются и образуют агрегаты. DLS может использоваться для измерения размера частиц после указанного обращения или кинетика агрегации в реальном времени17,28. Этот метод имеет преимущество, позволяя наблюдения поведения капсида в растворе, но требует высокой концентрации очищенный капсида, которые не могут быть полностью представительным вируса в своем естественном состоянии.
Последний метод, используемые Мур и др. 17 был просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Хотя этот метод не хватает чувствительности и не производят количественных данных, он позволяет для визуализации эффектов различных обработок вирусного капсида структуры. Хотя не еще идеально подходит для клинических и экологические параметры, использование этих методов в сочетании ценные в понимании человека норовирус инактивации. Цель этой статьи — предоставить углубленные протоколы для привязки на основе плиты assay (ELASA), DLS, и методы подготовки ТЕА используется для исследовать влияние термообработки на норовирус капсида в контексте лечения последствий капсид целостность, представленные в Moore et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. основанного на пластину Assay привязки для оценки потери выше порядок норовирус капсид структура
Примечание: весьма аналогичный протокол ELASA к тому, что представленные здесь был Опубликовано 29, и аналогичные ELASA анализов ранее сообщалось как часть исследования других статьях 17 , 18 , 22.
- Термической обработки человека норовирус Сидней GII.4 capsids
- получения очищенного человека норовирус основных капсид белка (VP1) GII.4 Сидней (присоединение: JX459908) собрались в capsids.
Примечание: Capsids в исследовании были получены любезно Атмар р. (колледж Бейлор, Хьюстон, TX).
Capsids - развести в 50 мкг/мл в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,2) максимальный объем 15 мкл в отдельных ограничен пробирках, ПЦР. Убедитесь, что трубка содержит по крайней мере 600 нг капсида. Убедитесь, что 600 нг капсида в сочетании лечения лиганд.
- Разогреть тепловой cycler для желаемого термообработки.
Примечание: для целей настоящего Протокола, лечение на 68 ° C для разных времен (0 - 25 мин) был выбран. - Разогреть дополнительной тепловой циклователь до 4 ° C для немедленного охлаждения. Добавьте трубы с решением капсид тепловой циклователь на требуемое время. Немедленно передать циклователь предварительно охлажденным 4 ° C за 5 мин после нагрева.
Лечение
- включают 95 ° C за 5 мин как элемент денатурированного капсида. Включают необработанные (23 ° C) капсид решение как позитивный элемент управления. Включать PBS с не капсид как элемент дополнительные негативные.
- Кратко вращаться вниз в центрифуге получить все капельки в нижней части трубки и разбавить обработанных капсид решения в PBS 3 мкг/мл. Убедитесь, что имеется по крайней мере 200 мкл разбавленным, обработанного капсид (100 мкл/а).
- получения очищенного человека норовирус основных капсид белка (VP1) GII.4 Сидней (присоединение: JX459908) собрались в capsids.
- Применить 100 мкл капсид решения для каждой скважины, обеспечение, есть по крайней мере две скважины за лечение. Кроме того включают в себя 2 контроль скважины с 100 мкл PBS для каждого лиганда; Это обеспечивает фон поглощения assay. Крышка с крышкой, уплотнение края с парафином фильм для уменьшения испарения и оставить на ночь на тряску инкубатор на 4 ° C или за 2 ч при комнатной температуре.
- Подготовить блокирующий буфер, сделав 5% обезжиренное молоко твердых (w/v) в PBS с 0,05% 20 анимации (PBST).
- Удалять обработанные капсид решения от пластины. Добавьте 200 мкл/хорошо блокировки буфера. Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре или на ночь, опечатали на 4 ° C.
- Подготовка лигандом привязки решения для биотинилированным aptamer M6-2 18 , 29 и биотинилированным синтетических HBGA крови типа A или биотинилированным типа H.
- Развести биотинилированным aptamer до 1 мкм в нуклеиназы свободной воды. Убедитесь, что имеется достаточно решение для 200 мкл суммарной величины для каждого обращения. Разбавьте выбранной биотинилированным HBGA 30 мкг/мл в блокирующем буфере. Убедитесь, что есть достаточно решение для 200 мкл суммарный объем для каждого лечения.
Примечание: Чтобы использовать меньше HBGA, может быть заменен 10 мкг/мл HBGA в 0,25% обезжиренное молоко PBST. Концентрации для биотинилированным M6-2 и HBGA были ранее оптимизированы и сообщил.
- Развести биотинилированным aptamer до 1 мкм в нуклеиназы свободной воды. Убедитесь, что имеется достаточно решение для 200 мкл суммарной величины для каждого обращения. Разбавьте выбранной биотинилированным HBGA 30 мкг/мл в блокирующем буфере. Убедитесь, что есть достаточно решение для 200 мкл суммарный объем для каждого лечения.
- Удалить блокирующий буфер и мыть тарелки 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для сухой остаточной влаги.
- Добавить 100 мкл/колодец лигандом привязки решения, обеспечивая, что есть 2 скважин в сочетании термической обработки лиганд. Инкубировать пластину покрытый крышкой на орбитальный шейкер на около 60 об/мин за 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Не забудьте включить 2 скважины необработанных capsids и полностью денатурированного capsids для каждого лиганда как позитивные и негативные элементы управления, соответственно. Кроме того, включают в себя 2 " не капсид " скважин для каждого лиганда как пластины фон управления. - Удалять решения лиганда и Промыть лунки 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для просушки остаточной влаги.
- Добавить 100 мкл/хорошо раствора 0,2 мкг/мл стрептавидина-пероксидаза в PBS. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания на орбитальный шейкер.
Примечание: Различные стрептавидина хрен пероксидазных конъюгатов будет иметь различные концентрации. Консультации пользователя ' руководство для идеального диапазон концентраций для ELISA приложений фермента и убедитесь, что это оптимальное. - Удалить раствор конъюгата. Вымойте 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для просушки остаточной влаги.
- Добавить 100 мкл/хорошо 3,3 ', 5,5 '-тетраметилбензидина (ТМБ) субстрат и разрешить цвет развивать в 5-15 мин наблюдать отрицательный контроль скважины для любого цвета и не забудьте последовательно развивать за то же время между реплицировать пластинами. Помните, спектра поглощения читателя пластины, используемые, а также.
Примечание: Развивающихся раз могут различаться в зависимости от качество лигандов/реагенты используемые. - Остановить развитие реакции с 100 мкл/ну 1M фосфорной кислоты. Сразу читать пластины на 450 Нм. Сохранить данные.
Примечание: Введение кислоты обычно замедляется реакция резко, но не полностью остановить его. Не оставляйте остановился пластины для расширенной количество времени перед чтением поглощения.
2. Анализ результатов на основе плиты Assay
- сохранить сырье поглощения данные в программу электронных таблиц. Производят средняя absorbances для каждой пары хорошо с специфического лечения и лиганда. Используйте эти средние показатели для всех последующих анализов.
Примечание: Сравнить оба хорошо absorbances, чтобы убедиться, что не пар скважин имеют значительно значения. - Для анализа абсолютного капсид целостности (все привязки), вычесть сырья поглощения из " не капсид " управления от всех других значения поглощения образцов.
Примечание: в качестве альтернативы, потере привязки из-за потери структуры высшего порядка (среднего, высшего, четвертичные) могут непосредственно быть проанализированы. Вместо вычитания поглощения отрицательный (не капсид) управления, вычтите значение элемента управления полностью денатурированного капсида. Это удаляет все привязки сигнала за счет неспецифического привязки к аппарату, а также обязательную силу из-за последовательности капсида. HBGA и aptamer M6-2 дисплей мало привязки полностью денатурированного капсида, поэтому либо метод дает аналогичные результаты. Ложных положительный сигнал, приписываемых aptamer неспецифического связывания необходимо учитывать при выборе какой анализ использования. - С отрицательным или денатурированного регулировать absorbances деления для лечения absorbances, их соответствующие положительные (без лечения) управления absorbances и умножить на 100. Это обеспечивает процент сигнала обработанных капсид относительно управления необработанными.
- Для оценки степени связывания сигнала для каждого лиганда объясняется к капсидному последовательности, вычесть " не капсид " отрицательный контроль от первоначального absorbances и принять скорректированные поглощения денатурированного капсида. Разделите это на скорректированные поглощения позитивный сигнал и умножить его на 100. Это дает явное процент сигнала благодаря лигандом привязки к последовательности денатурированного капсид/капсида.
3. DLS для обнаружения вируса агрегации после термической обработки
Примечание: Ниже шаги могут быть специфическими для программного обеспечения и инструмент используется, но могут быть адаптированы и аналогичных устройств.
- Создать новый размер СОП в DLS инструмент программного обеспечения с помощью: материал = белка, диспергаторы = PBS, температура = 25 ° C, время уравновешивания = 0 сек, тип ячейки = одноразовых кювет (малый объем, ZEN0040), измерение угла = 173° обратного рассеяния, Длительность измерения = автоматический, количество измерений = 3, задержка между измерениями = 0 сек, обработка данных: модель анализа = общего назначения (нормальный режим). Использовать параметры по умолчанию для всех остальных параметров.
- Выберите зеленую стрелку запуска в рамках программного обеспечения и имя образца.
- Выполните шаги 1.1.1 через 1.1.4 для термической обработки VLP.
- Развести тепло относились VLP 1:10 в 1 x PBS для конечной концентрации 5 мкг/мл. (Необязательно) Фильтр образец с размером пор 1 мкм, чтобы удалить частицы пыли; DLS очень чувствителен к пыли, как крупные частицы рассеивают гораздо больше света, чем небольшие частицы.
- Передачи 50 мкл разбавленного VLP в небольшом объеме одноразовые кюветы. Вставьте кювета в палате образец документа.
- Запустить запустить и использовать ' Correlogram ', ' кумулянтов Fit ', и ' эксперт советы ' вкладки для оценки качества данных.
- Во время выполнения, убедитесь, что значение индекса полиизопрена меньше чем 0,3, представляющие качества измерения. В ‘ нескольких ’ вкладка, убедитесь, что коэффициент корреляции является постоянная и близко к, но не более чем 1, на короткое время, и капель покинуть резко 0 на более позднее время, характерные для размера частиц. Использование ‘ эксперт советы ’ вкладка для обратной связи по вопросам качества данных во время измерений.
- После завершения измерения снова проверьте, что значение индекса полиизопрена меньше чем 0,3. Убедитесь, что кумулянтов подходят следующие линии, точки данных тесно в ‘ кумулянтов подходят ’ таб
- Взять среднее Z-средний диаметр частиц для каждого измерения, как размер частиц каждого образца. Участок диаметром в Нм против температура в ° C.
4. DLS для обнаружения вируса агрегата в режиме реального времени
Примечание: следующие действия могут быть специфическими для программного обеспечения и инструмент используется, но могут быть адаптированы и аналогичных устройств.
- Создать новый размер СОП в DLS инструмент программного обеспечения с помощью: материал = белка, диспергаторы = PBS, температура = как желаемое, время уравновешивания = 0 сек, тип ячейки = кварцевые кюветы, измерения угла = 173° обратного рассеяния, продолжительность измерения = автоматический, Количество измерений = 50 (возможно увеличение или уменьшение зависимости агрегации ставка), задержка между измерениями = 0 сек, обработка данных: модель анализа = несколько узких режимов (высокое разрешение). Использовать параметры по умолчанию для всех остальных параметров.
- Выберите стрелку запуска в программное обеспечение для открытия и имя нового образца и позволить инструмент для достижения равновесной температуры.
- Приостановить VLP ПБС в пробки microcentrifuge в концентрации 5 мкг/мл и тома между 200-500 мкл. Vortex подвеска.
- Спина вниз VLP подвеска для 5-10 s в настольная центрифуга для удаления газа. Это помогает предотвратить образование пузыря во время термической обработки, что мешает размеры.
- Передачи VLP подвеска для небольшой объем кварц кювет избежать пузырей и Пипетка медленно к стене кювет. После того, как инструмент достигла температуры равновесия, вставьте в камеру образец кювета.
- Ждать 10 s для температуры образца сбалансировать, затем начать запуск. Запуск таймера в начале выполнения. Остановка таймера в конце первого измерения. Возьмите этот раз в качестве первой точки время. Получить точек последующее время от времени измерения, записано программное обеспечение.
- Начать запуск и контролировать некотором, распределение подходят и экспертные консультации для оценки качества данных.
Примечание: PDI не будет обязательно, что меньше чем 0,3 для этих измерений как образца предполагается полидисперсных во время агрегации.- Убедитесь, что коэффициент корреляции является постоянная и близко к, но не более чем 1 на короткое время и резко падает в один или более позднее время, характерный размер частиц.
- Убедитесь, что распределение подходят следующие линии, точки данных тесно.
- Анализ данных размер.
- Определить каждый раз, когда точка от разницы во времени между каждым измерением и точкой начальное время. Измерения длительности являются не все ровно то же самое.
- С помощью распределения интенсивности, запишите размер вершины с крупнейших областей для каждой точки времени измерения.
- Участок пик диаметров в Нм против раз в мин.
5. Подготовка образца ТЕА
- получить углерода поддержки фильм (никель) сетки для ТЕА.
Примечание: Консультации с Фондом основные рекомендованные реагентов и их обработки для использования с микроскопом объекта. Будьте уверены, чтобы хранить сетки в поле, содержащее влагопоглотителя или вакуумной камере для сведения к минимуму воздействия влаги. - Слезу примерно 5 х 5 см кусочки фильтровальной бумаги. Получения стекла Петри и надлежащего самозакрывающиеся обратный пинцет предназначен для использования в микроскопии.
- Сократить примерно 2,5 см х 5 см кусок парафина фильма. Место на benchtop.
- Термообработки норовирус Сидней GII.4 capsids
- процедура термической обработки точно так, как описано выше 1.1.1 - 1.1.5 за исключением: 10 мм HEPES (рН 7,4) для лечения вместо PBS и далее не разбавить capsids После лечения (держать раствор в 50 мкг/мл). Пипетка падение всего ~ 15 мкл лечение капсид раствор на парафин фильм.
- Захватить край сетки с помощью пинцета, позволяя им закрыть на краю провести сетки и место сетки углерода сторона вниз поверх падение лечение решения. Пусть Проинкубируйте втечение 10 мин позволить капсид приложить к сетке.
- В зависимости от чистоты подготовки капсида, моет 10 мм HEPES раствора при необходимости добавить в виде 10-15 капель мкл помещены в линии после обработанных капсид капелька.
- После 10 мин, Подберите сетку с капли. Место сетки почти перпендикулярно кусок фильтровальной бумаги, чтобы фитиль от капли. Подобрать капли 10-15 мкл HEPES буфера с сеткой, провести 30 s, то фитиль прочь с другой кусок фильтровальной бумаги в Вашингтон
- Место капельку 15 мкл раствора ацетата 2% уранила на пленке парафина в пустой области.
- Подобрать капли уранила винилацетата с сеткой и удерживайте 45 s. фитиль от уранила ацетат, будучи уверенным, чтобы удалить большую часть решения. Поместите сетку углеродные стороне вверх на кусок фильтровальной бумаги, стараясь, чтобы сетка не " палку " влаги на пинцетом. Место фильтр бумага с сеткой на него в открытой стеклянной чашке Петри.
Примечание: Не используйте пластиковые чашки Петри, как сетки будет электростатически привлекли к ним и стать застрял блюдо.
- Подобрать капли уранила винилацетата с сеткой и удерживайте 45 s. фитиль от уранила ацетат, будучи уверенным, чтобы удалить большую часть решения. Поместите сетку углеродные стороне вверх на кусок фильтровальной бумаги, стараясь, чтобы сетка не " палку " влаги на пинцетом. Место фильтр бумага с сеткой на него в открытой стеклянной чашке Петри.
- Повторить для всех процедур. Поместите половинки Петри с сетками в эксикатор ночь высохнуть до наблюдения с ТЕА.
- Консультации микроскопии фонда в соответствующие учреждения в отношении наблюдения за подготовленный сетки. Некоторые объекты позволяют пользователю пройти подготовку по эксплуатации их объекта ' s инструмент. Конкретные подробности, касающиеся установки и наблюдение за конкретным микроскопа-bсферу действия этой статьи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Структурная целостность человека норовирус Сидней GII.4 capsids (VLP) была оценена с помощью нескольких новых методов, представленный Moore et al. 17. Во-первых, эксперимент было сделано в котором целостности capsids как функция их способности связать предполагаемого рецептор/co-factor (HBGA) или на ssDNA aptamer (M6-2) были сравнению (рис. 1). Отобразятся результаты были ранее представлены Мур и др. 17и продемонстрировать, что поведение привязки aptamer M6-2-капсид был похож на вирус HBGA обязательную подверженности 68 ° C тепловой обработки для различных выдержек. В то время как HBGA привязки сигнал был потерян немного раньше чем что из aptamer M6-2, M6-2 отображается аналогичные темпы потери сигнала, рассчитывается после VLP подвергаются до 65 ° C и 68 ° C для различных время очка (Таблица 1)17. Это свидетельствует о том, что HBGA и aptamer M6-2 Привязка была упразднена в подобной манере.
DLS измерения показали, что агрегации благодаря денатурации белков вероятно переписывался с потерей сигнала Связывание лиганда (рис. 2), как гидродинамическая диаметром более 100 Нм наблюдалось после около 18 минут лечения на 68 ° C. Это были условия в которых полной потере привязки HBGA и почти все потери сигнала привязку для aptamer M6-2 (> 80%) произошло17(рис. 1). Результаты ТЕА поддерживает эти замечания как морфологические изменения и слипания capsids стали все более очевидными, как температура была увеличена постепенно от 60 ° C до 80 ° C в течение 1 мин (рис. 3a). Аналогичное явление наблюдалось после Отопление capsids на 68 ° C до 25 мин, но резолюции ТЕА было менее выраженным (рис. 3b)17.
Рисунок 1: конформации зависимые привязки двух различных лигандов для capsids GII.4 Сидней норовирус подвергается термообработке. Очищенный GII.4 Сидней capsids (VLP) были подвергнуты термической обработке в 68 ° C для различное количество времени, и привязка к крови типа HBGA и aptamer M6-2 оценивалась с использованием на основе плиты пробирного привязки ELASA. Ось y отображает сигнала поглощения, наблюдается для лечения (время экспозиции) в процентах от элемента управления необработанными капсида. Эта цифра была ранее представлена и эта цифра была изменена с Moore et al. 17 погрешностей представляют собой стандартное отклонение ± 1% сигнала. Данные, по крайней мере три реплицировать пластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: пример DLS данные для термически норовирус Сидней GII.4 capsids идеально и двусмысленным/низкое качество результаты. Capsids (VLP) были подвергнуты термической обработке при температуре 65 ° C и 68 ° C, и их размер был мониторинг в режиме реального времени. Группа () соответствует высоким качеством, ясно коэффициент корреляции измерения; и (b) до низкого качества, неоднозначные коэффициент корреляции измерения. (C) панель данных размер частиц, показаны четкие агрегации профиль для capsids лечение в 68 ° C; и (d) показывает неоднозначные частиц размер данных для термически capsids. Представлены некоторые из этих данных, и таким образом это изображение изменяется от Мур и др. 17 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ТЕА норовирус Сидней GII.4 capsids подвергается различным термообработок. Очищенный capsids (VLP) были подвергнуты различным термообработки и наблюдается с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Дискуссионный форум (a) показывает данные для capsids, нагревают при различных температурах (60, 65, 70, 75 и 80 ° C) 1 мин панель (b) показывает capsids, 68 ° C обращению для 0 - 25 мин шкалы (бар) на правой фотографии представляет 100 Нм. Эти изображения представлены в Мур и др. 17 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Скорость экспоненциального распада (% сигнала/мин) | |||
| Температура | 65 ° C | 68 ° C | |
| Лиганд | |||
| HBGA тип A | 2,50 ± 0,24 | 13.30 ± 1.15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13,18 ± 0,47 | |
Таблица 1: экспоненциального распада тарифы за норовирус Сидней GII.4 capsids лечение в 65 ° C и 68 ° C. Capsids были подвергнуты термообработки для различных раз при 65 ° C и 68 ° C, охлаждение на 4 ° C и их способность связывать синтетических HBGA или aptamer оценены. Потери сигнала с течением времени (скорость распада) был затем рассчитывается с каждым лигандом для каждой температуры. Эти данные были представлены ранее в Moore et al. 17 данные представлены в виде % сигнала/мин ± 1 стандартное отклонение сигнала %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол и описанные здесь методы предоставляют средства оценки человека норовирус капсид целостности/функциональность. Эти методы могут быть использованы для получения механистический понимание последствий инактивации препаратов против вируса и потенциально могут дополнять более традиционные методы оценки инактивации например RT-ПЦР или доска пробирного. Например оценки химических или физических инактивации, assay металлической пластинкы только обеспечивает определенную степень инактивации вирусов, но не основной механизм этого инактивации. Кроме того вирус агрегирование может привести к недооценке титра антител и поэтому переоценить эффективность лечения30. Эти методы можно далее сообщить такое исследование, предоставляя информацию о последствиях лечения на целостность норовирус капсида. Недавно два в пробирке (клеточной культуры) методов культивации для человека норовирус были сообщил5,6; Эти по-прежнему полагаются на ПЦР для перечисления вирус, хотя теоретически представленная модель enteroid могут быть использованы для TCID50 используя антитело пятная для определения относительного сокращения. Представленные здесь методы могут иметь утилита для понимания полный механизм вирусной инактивации для нескольких различных видов лечения за пределами просто термической обработки. Например на основе плиты лигандом привязки и ТЕА были использованы в качестве инструментов в дополнение к данным Пробирной RT-ПЦР и налета в определении механизм инактивации норовирус на поверхности меди31,32, под воздействием Серебряный дигидроген цитрат33и высокого гидростатического давления лечения14.
Есть многочисленные шаги в эти протоколы, в которых внимание к деталям, методологии имеет решающее значение. В частности для assay пластины, большое внимание должно уделяться буфера, используемого для разбавления лигандом для привязки. Aptamer M6-2 и ssDNA аптамеры в целом, чувствительны к концентрации и буфера условий соли. С помощью неоптимальные буфера с aptamer может удалять привязки. Хотя aptamer, которую M6-2 успешно использовалась в разбавленной человека табурет, слишком много помех табурет/матрица может помешать с привязкой, которая согласуется с замечаниями других человека норовирус аптамеры18,22. Одним из основных факторов, причиной этого является, что аптамеры могут exhibit степенью неспецифического связывания положительно заряженные молекулы. Таким образом это может привести к некоторой степени ложных положительный сигнал в assay, описанных здесь. Это можно объяснить, выбрав отрицательный контроль, либо сложную матрицу без вируса или несвязанных белка. Аналогично концентрации HBGA и количество обезжиренного молока твердых веществ, используемых в буфере привязки могут значительно влиять на позитивные и фон сигналов. Обратите внимание, что разные HBGAs разной степени сродства к различных штаммов человека норовирус, поэтому привязки буферов может должны быть оптимизированы в зависимости от HBGA типа,1431,33. Подобные следует рассмотреть в буфер, используемый для конъюгата пероксидазы хрена стрептавидина, как концентрации от разных производителей могут различаться; Однако гораздо меньше изменчивости будет ожидать учитывая высокое сродство стрептавидина биотин взаимодействие34. Из-за высокой степенью адаптируемости данного метода, основанного на пластину устранение неполадок субоптимальные результаты относительно проста. Например, в случае высокой фонового сигнала, оптимизация, увеличение концентрации обезжиренного молока и снижение концентрации лиганд может расследоваться и наоборот для пластин с низкой позитивные сигналы. Для ТЕА, одним из наиболее важных соображений является использование нестатических материалов (как стекло) при хранении/обработке сеток, как сетки являются чрезвычайно трудно обрабатывать вокруг материалы, такие как одноразовые чашки Петри. Если используются такие материалы, сетки будут склонны «прыжок» и придерживаться материала. Кроме того много осторожность для обеспечения того, чтобы без остаточной влаги сетки. В идеале вакуумного эксикатора должны использоваться, если доступно.
При выполнении экспериментов с использованием DLS, чистоты образца является очень важным фактором. Функции, используемые для корреляции изменений в интенсивности светорассеяния в диаметре полагаются на наличие monomodal или сузить распределения смешанных частиц. Примесей до наноразмерных, включая белки, ввести полиизопрена и изменить размер расчетов. Кроме того интенсивность света разбросаны пропорциональна диаметр, возведенное в степень 6, поэтому крупные частицы пыли существенно мешать измерения. Пузырь формирования во время реального времени термообработки результаты в бессмысленные результаты из-за света, рассеянного колебания пузыри. Капсид (VLP) концентрации должны также рассматриваться при использовании DLS. Концентрации образца должна быть достаточно высокой, чтобы производить достаточно сигнал и достаточно низкой, чтобы избежать многократного рассеяния. Это также жизненно важное значение для ввода правильный материал и диспергирующими свойствами, как эти значения используются программой для вычисления размера. В частности, диспергаторы вязкость является функцией температуры и должны быть скорректированы соответствующим образом во время термообработки (программное обеспечение, используемое имеет вязкости зависит от температуры воды, построенный в).
Хотя методы описанные здесь предлагают многочисленные возможности для улучшения способов оценить целостность капсида, они не совершенны. Потому что эти методы требуют очень высокой концентрации вируса, они должны использоваться с очищенной, собрал capsids вместо родной инфекционных вирусов. VLP, используемый здесь состоят из крупных капсид белков человека норовирус (VP1), который собирает в норовирус капсид без нуклеиновой кислоты вируса. Хотя эти VLP антигенно подобное поведение для инфекционных вирусных capsids, они могут быть более восприимчивы к инактивации. Кроме того VLP трудно производить и очищают и не доступны для многих детективов. Использование очищенной человека норовирус (например, с помощью ultracentrifugation) возможна, но наличие человеческого Кала образцов норовирус позитивных ограничены и даже с очистки, титры вирус не может быть достаточно высокой, чтобы вместить методы описанные здесь. В настоящее время ведется будущей работы на оптимизацию анализов для использования частично очищенный инфекционного вируса в стул. В самом деле это уже было продемонстрировано пластины пробирного18,22, но, несомненно, будет более сложной для DLS. Следует также отметить, что эти методы применялись только для оценки целостности капсид после нанесения физического (тепла) инактивации подход, который известен непосредственно влияют на капсида. Результаты могут быть более неоднозначным были эти методы, используемые для оценки целостности капсида, используя другие инактивации подходы, например химических агентов или методы, которые главным образом цель уничтожения вирусного генома. Однако в некоторых докладах благоприятно продемонстрировали производительность HBGA связывания для оценки химической дезактивации31,33,35,,3637. В настоящее время лучше всего используются протоколы, сообщили здесь в концерте с традиционными методы как RT-ПЦР и plВодный анализов с суррогатной вирусов.
Эти протоколы обеспечивают простой альтернативных средств понять воздействие физической вирус инактивации метода (тепла) на человека норовирус. Эти методы вероятно могут быть расширены для использования с другими-оболочечных вирусов (например, гепатит А и Е вирусы), как общий принцип обнаружения потери белка структуры высшего порядка является то же самое. Кроме того следует оценить поведение и возможности использования других лигандов для индикации потеря целостности капсида. Адаптации протоколов к более сложный пример матрицы и повышение их аналитической чувствительности (пределы обнаружения) также является логическим будущего направления. В целом описанные здесь методы обеспечивают более доступным средством определения целостности человека норовирус капсида и набирает механистический понимание последствий инактивации препаратов против этой важной патогена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана сельского хозяйства и продовольствия исследований инициатива конкурентных Грант № 2011-68003-30395 из Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов, национального института продовольствия и сельского хозяйства в рамках проекта NoroCORE. Финансирование для открытого доступа заряда была предоставлена Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов Америки. Мы хотели бы поблагодарить Роберт Атмар (колледж Бейлор, Хьюстон, Техас) за любезно предоставленную нам очищенный capsids и Валери Lapham за помощь с изображениями ТЕА. Мы также хотели бы поблагодарить Франк н. Барри за помощь нам начать эксперименты представил.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D.
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M.
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
