Summary
Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.
Abstract
Menschlichen Norovirus fordert erhebliche öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Verluste weltweit. Schwellenländer in Vitro sind Anbau Fortschritte noch nicht anwendbar für routinemäßige Nachweis des Virus. Die aktuelle Erkennung und Quantifizierung Techniken, die in erster Linie auf Nucleinsäureamplifikation angewiesen sind, diskriminieren nicht infektiöse von nicht-infektiöse Viruspartikel. Der Zweck dieses Artikels ist es, spezifische Details über die jüngsten Fortschritte in Techniken zusammen, um weitere Informationen über den Status der Infektiosität der Viruspartikel erwerben zu präsentieren. Eine Technik beinhaltet die Beurteilung der Bindung von einer Norovirus SsDNA Aptamer, Capsids. Aptamere haben den Vorteil des Seins leicht synthetisiert und geändert und sind preiswert und stabil. Eine andere Technik, dynamisches Licht Streuung (DLS), hat den Vorteil der Beobachtung Kapsid Verhalten in Lösung. Elektronen-Mikroskopie ermöglicht eine Visualisierung der strukturellen Integrität der viralen Capsids. Obwohl mit dem Versprechen, gibt es einige Nachteile, jede Technik, wie z. B. Aptamer unspezifische Bindung an positiv geladene Moleküle aus Probe Matrizen, Erfordernis der gereinigten Kapsid für DLS und schlechte Empfindlichkeit für Elektronenmikroskopie. Dennoch, wenn diese Techniken in Kombination verwendet werden, versorgt den Körper der produzierten Daten umfassenderen Informationen auf Norovirus Kapsid Integrität, die verwendet werden, um die Infektiosität, Informationen ableiten, die wesentlich für die genaue Bewertung der Inaktivierungsverfahren oder Auslegung der Virenerkennung. Dieser Artikel enthält Protokolle für den Einsatz dieser Methoden, um menschlichen ansteckenden Norovirus Teilchen zu unterscheiden.
Introduction
Menschlichen Norovirus ist verantwortlich für eine beträchtliche öffentliche Gesundheit Belastung weltweit verursacht ca. 685 Millionen Erkrankungen und 212.000 Todesfälle jährlich1, zu einem Preis in den Milliarden von Dollar2,3. Heute, beinhaltet Norovirus-Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung bzw. Liganden-basierten Plattformen. Ersteres wird in der Regel bevorzugt, da es empfindlicher ist, quantitative Informationen liefert und in der Regel geringere Gefahr von falsch-positive Ergebnisse4 hat. Die am häufigsten verwendete Norovirus Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung Technik ist Reverse Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Denn es richtet sich an und ein kleines Segment des menschlichen Norovirus-Genoms verstärkt, RT-qPCR allein ist nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen dem infektiösen und nicht-infektiöse Partikel als kostenlose genomischen RNA, beschädigt tödlich Capsids mit Genomen und Capsids mit mutiert/abgeschnitten Genome können durch RT-qPCR noch verstärkt werden. Während vor kurzem zwei neue in-vitro- Kultivierung Techniken für menschliche Norovirus5,6 gemeldet wurden, beide noch verlassen sich auf RT-qPCR Virus Quantifizierung und noch nicht machbar Methoden für die routinemäßige klinische/Umwelt Tests für menschliche Noroviren. RT-qPCR bleibt daher den Goldstandard für klinische/Umwelttests.
Andere in-vitro- Methoden entstanden in dem Bemühen, die Infektiosität Status des Norovirus Partikel besser abschätzen zu können. Diese Methoden können in der Regel als diejenigen, die die Integrität der Norovirus Kapsid ansprechen und die Bewertung von Genom Integrität kategorisiert werden. Das erste Verfahren wird immer beliebter. Eine häufig verwendete Methode ist RNase Vorbehandlung vor der Extraktion der viralen genomischen RNA, aber dies nicht berücksichtigt werden, Viruspartikel, die intakt bleiben, aber nicht über die Fähigkeit, Host-Rezeptoren/co-Faktoren zu binden sowie Viruspartikel, die tödlich mutiert haben oder abgeschnitten oder Genome7geringfügig beschädigt haben. Kapsid Integrität kann auch ausgewertet werden, basierend auf die Fähigkeit des Virus binden an menschlichen Norovirus co-receptor/co-Faktoren, die Kohlenhydrate sind bekannt als Histo-Blut Gruppe Antigene (HBGAs). HBGAs sind in intestinalen Epithelzellen Host als Bestandteil von Glykoproteinen oder Glycolipide (unter mehreren anderen Geweben) und in Körperflüssigkeiten wie Speichel abgesondert werden kann. Magensaftresistente Bakterien mit HBGA-ähnlichen Substanzen auf ihrer Oberfläche haben auch gezeigt, dass menschliche Norovirus8,9,10binden und solche Interaktionen können Norovirus Infektion5fördern. Das grundlegende Konzept der Verwendung HBGA Bindung ist, dass nur virale Partikel binden die vermeintliche Rezeptor/co-factor in der Lage wäre, Zellen zu infizieren. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Wulst-basierte HBGA Bindung vor Nucleinsäureamplifikation eine viel versprechende Methode für Infektiosität Diskriminierung11,12,13,14ist, 15,16. Eine große Herausforderung für HBGAs ist, dass kein einziges HBGA Typ alle menschlichen Norovirus Genotypen binden kann. Um dieses Problem anzugehen, hat Schwein Magen Mucin, die HBGAs enthält, anstelle von gereinigten HBGA Kohlenhydrate im Interesse der einfachen Synthese, Konsistenz und reduzierten Kosten eingesetzt.
Einer kürzlich erschienenen Publikation von Moore Et al. 17 führte eine Reihe von neuen Techniken für die Schätzung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität. Anstelle von HBGAs, Moore Et al. 17 Bindung eines weitgehend reaktiven Nukleinsäure-Aptamer (M6-2)18 und im großen und ganzen reaktive monoklonaler Antikörper (NS14)19 , wärmebehandelte GII.4 Sydney Norovirus Capsids (virusähnliche Partikel oder untersuchten) untersucht und verglichen um die Bindung an synthetischen HBGAs. Nukleinsäure-Aptamere sind kurz (~ 20-80 nt) einzelne gestrandeten Nukleinsäuren (SsDNA oder RNA), die Falten zu einzigartigen dreidimensionalen Strukturen als Folge ihrer Sequenz und ein Ziel zu binden. Weil sie Nukleinsäuren sind, sind sie weniger kostspielig; leicht chemisch synthetisiert, gereinigte und modifiziert; und stabil gegen Hitze. Mehrere Berichte von Aptameren generiert gegen Noroviren gibt, mit einigen von ihnen zeigen breite Reaktivität verschiedener Stämme18,20,21,22. Zum Beispiel, Moore Et al. 17 unter Beweis gestellt, dass Aptamer M6-2 verpflichtet, gereinigt, zusammengebauten menschlichen Norovirus Capsids (untersuchten) und verhielt sich ähnlich, HBGA in die Abhängigkeit von der viralen Kapsid zu höherer Ordnung (z. B. sekundäre und tertiäre) Protein-Struktur für verbindliches auftreten. Auf der anderen Seite blieb ein erheblicher Anteil der Norovirus VLP Bindung an Antikörper NS14 nach Capsids völlig denaturiert wurden. Bewertung der Norovirus-Bindung in der Studie von Moore Et al. 17 erfolgte über eine einfache Platte-basierte Methode ähnlich wie ELISA, mit der Ausnahme, dass Aptamere anstelle von Antikörpern verwendet werden (daher ist die Methode ELASA hieß). Diese experimentellen Hochdurchsatz-Methode wurde zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener Therapien auf das Norovirus Kapsid, Arbeit, die für das Verständnis des Mechanismus der viralen Inaktivierung bei Belastung durch physikalische oder chemische Stressoren wertvoll ist. Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch die geringere Empfindlichkeit und Mangel an Toleranz für Matrix-assoziierte Kontaminanten auf höheren Ebenen, die unspezifische Bindung von Aptameren verursachen.
Moore Et al. 17 verwendet eine andere Methode, dynamische Lichtstreuung (DLS), Aggregation der Viruspartikel als Reaktion auf Wärmebehandlung zu überwachen. DLS ist häufig verwendet, um die Größe der Nanopartikel-Suspensionen zu bewerten und auf Proteine23,24 und Viren25,26,27erweitert. Die Intensität des Lichts verstreut durch Partikel in Lösung schwankt in Abhängigkeit von der Partikelgröße, so dass für die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und dann Partikeldurchmesser mit bewährten Formeln. Die DLS-Technik kann den hydrodynamischen Durchmesser der dispergierten Partikel bis in den Nanobereich unterscheiden, die ermöglicht die Erkennung von verteilten Viren, individuelle Kapsid-Proteine oder Dimere und Virus-Aggregate, die anhand der Größe27. Virus-Aggregation, vertreten durch eine Erhöhung der Partikelgröße, zeugt vom Verlust der Integrität Kapsid. Das Kapsid ist denaturiert und seine Struktur gestört, hydrophoben Überreste ausgesetzt werden und dazu führen, dass die Teilchen zusammenhalten und Aggregate zu bilden. DLS kann verwendet werden, zur Messung der Partikelgröße nach einer bestimmten Behandlung oder die Kinetik der Aggregation in Echtzeit17,28. Diese Methode erfordert hohe Konzentrationen von gereinigten Kapsid, die möglicherweise nicht ganz repräsentativ für das Virus in seinem natürlichen Zustand aber hat den Vorteil, dass Beobachtung des Verhaltens Kapsid in Lösung.
Die letzte Methode von Moore Et Al. genutzt 17 Jahre alt war Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM). Obwohl diese Methode Empfindlichkeit fehlt und keine quantitative Daten erzeugt, ermöglicht es für die Visualisierung der Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die virale Kapsid-Struktur. Obwohl nicht noch ideal für klinische/Umgebungseinstellungen, ist der Einsatz dieser Methoden in Kombination wertvolle menschliche Norovirus Inaktivierung zu verstehen. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle für die Platte basierende Bindung-Assay (ELASA), DLS, bieten und TEM Vorbereitung Methoden untersuchen die Auswirkungen der Wärmebehandlungen auf das Norovirus Kapsid im Zusammenhang mit den Behandlungen Auswirkungen auf Kapsid Integrität im Moore Et Al. vorgestellt 17.
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Protocol
1. Platte-basierte verbindlich Test zur Bewertung der Verlust der höheren Norovirus Kapsid Auftragsstruktur
Hinweis: ein sehr ähnliches ELASA Protokoll zu dem hier vorgestellten wurde veröffentlicht 29, und ähnliche ELASA Assays zuvor gemeldet wurden als Teil der Forschung anderswo 17 , 18 , 22 Artikel.
- Wärmebehandlung von menschlichen Norovirus GII.4 Sydney Capsids
- erhalten gereinigte menschlichen Norovirus großen Kapsid Protein (VP1) von GII.4 Sydney (Beitritt: JX459908) montiert in Capsids.
Hinweis: Capsids in der Studie wurden mit freundlicher Genehmigung von R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). - Verdünnt Capsids zu 50 µg/mL in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) auf eine maximale Lautstärke von 15 µL in aufgestellter PCR Einzelrohren. Sicherstellen, dass das Rohr mindestens 600 enthält ng Kapsid. Sicherzustellen, dass es 600 ng Kapsid pro Behandlung-Liganden Kombination.
- Vorheizen Thermocycler gewünschte Wärmebehandlung.
Hinweis: für die Zwecke dieses Protokolls, Behandlung bei 68 ° C für die verschiedenen Tageszeiten (0 - 25 min) gewählt wurde. - Heizen eine zusätzliche Thermocycler bis 4 ° C für sofortige Kühlung. Die Thermocycler Röhren mit Kapsid-Lösung für die gewünschte Zeit hinzufügen. Sofort nach dem Erhitzen auf Cycler vorgekühlte 4 ° C für 5 min übertragen.
- Include 95 ° C für 5 min Behandlung als denaturiert Kapsid Kontrolle. Sind sie unbehandelt (23 ° C) Kapsid Lösung als Positivkontrolle. PBS mit keine Kapsid als eine zusätzliche negative Kontrolle enthalten.
- Kurz spin-down in einer Zentrifuge, alle Tropfen an der Unterseite des Rohres und die behandelten Kapsid Lösungen mit PBS-Puffer bis 3 µg/mL zu verdünnen. Sicherzustellen, dass es mindestens 200 µL verdünnt, behandelten Kapsid (100 µL/Well).
- erhalten gereinigte menschlichen Norovirus großen Kapsid Protein (VP1) von GII.4 Sydney (Beitritt: JX459908) montiert in Capsids.
- Gelten 100 µL Kapsid Lösung in jede Vertiefung, gibt es mindestens zwei Brunnen pro Behandlung zu gewährleisten. Darüber hinaus gehören Sie 2 Kontroll-Vertiefungen mit 100 µL PBS für jedes Liganden; Dadurch wird die Hintergrund Extinktion des Assays. Die Platte mit einem Deckel abdecken, Versiegelung der Kanten mit Paraffin film um die Verdunstung zu reduzieren, und lassen über Nacht auf ein Schütteln Inkubator bei 4 ° C oder 2 h bei Raumtemperatur.
- Vorbereitung den blockierenden Puffer durch die 5 % Magermilch Feststoffe (w/V) in PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBST).
- Entfernen die behandelten Kapsid-Lösungen von der Platte. Fügen Sie 200 µL/Well des blockierenden Puffer. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder verschlossen über Nacht bei 4 ° c Vorbereiten der Ligand verbindliche Lösungen für die biotinylierte Aptamer M6-2 18 , 29 und biotinylierte synthetischen HBGA Blutgruppe A oder biotinylierte Typ H.
-
- Verdünnt biotinylierte Aptamer bis 1 µM in Nuklease-freies Wasser. Sicherzustellen Sie, dass es genug Lösung für 200 µL total für jede Behandlung. Verdünnen Sie der gewählten biotinylierte HBGA zu 30 µg/mL in der blocking-Puffer. Sicherzustellen, dass es genug Lösung für 200 µL Gesamtvolumen für jede Behandlung.
Hinweis: Um weniger HBGA zu verwenden, können 10 µg/mL HBGA in 0,25 % Magermilch-PBST ersetzt werden. Konzentrationen für biotinylierte M6-2 und HBGA wurden bisher optimiert und berichtet.
- Verdünnt biotinylierte Aptamer bis 1 µM in Nuklease-freies Wasser. Sicherzustellen Sie, dass es genug Lösung für 200 µL total für jede Behandlung. Verdünnen Sie der gewählten biotinylierte HBGA zu 30 µg/mL in der blocking-Puffer. Sicherzustellen, dass es genug Lösung für 200 µL Gesamtvolumen für jede Behandlung.
- Blockierende Puffer zu entfernen und waschen Sie die Platten 3 Mal mit 200 µL/Well PBST. Klopfen Sie die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern trocknen die Restfeuchte.
- Hinzufügen 100 µL/Well des Liganden verbindliche Lösungen, um sicherzustellen, dass es 2 Brunnen pro Wärmebehandlung-Liganden-Kombination gibt. Die Platte bedeckt mit einem Deckel auf einem Orbitalschüttler bei ca. 60 u/min für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Achten Sie darauf, 2 Brunnen der unbehandelten Capsids und völlig denaturierten Capsids für jede Liganden bzw. als positive und negative Kontrollen umfassen. Darüber hinaus gehören 2 " keine Kapsid " Brunnen für jeden Liganden wie die Platte Hintergrund Kontrolle. - Entfernen die Liganden-Lösungen und die Brunnen 3 Mal mit 200 µL/Well PBST waschen. Pat die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern Restfeuchte trocknen.
- Hinzufügen 100 µL/Well-Lösung von 0,2 µg/mL Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase mit PBS-Puffer. 15 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
Hinweis: Verschiedene Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugate haben unterschiedliche Konzentrationen. Wenden Sie sich an den Benutzer ' s-Handbuch für den idealen Bereich der Konzentrationen für ELISA Anwendungen des Enzyms und achten Sie darauf, dass es optimal ist. - Die konjugierte Lösung entfernen. Waschen Sie 3 Mal mit 200 µL/Well PBST. Pat die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern Restfeuchte trocknen.
- Hinzufügen 100 µL/Well 3,3 ', 5,5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat, und lassen Sie die Farbe für 5-15 min. beobachten Negativkontrolle Brunnen für jede Farbe und achten Sie darauf, konsequent für den gleichen Zeitraum zwischen replizieren Platten entwickeln entwickeln. Beachten Sie die Extinktion-Palette von der Platte-Leser verwendet, sowie.
Hinweis: Die Entwicklungszeiten können unterscheiden sich je nach der Qualität der verwendeten Liganden/Reagenzien. - Halten die Entwicklung der Reaktion mit 100 µL/Well 1M Phosphorsäure. Lesen Sie sofort Platte bei 450 nm. Sichern Sie Ihre Daten.
Hinweis: Einführung der Säure in der Regel die Reaktion drastisch verlangsamt aber nicht völlig stoppen. Lassen Sie die gestoppte Platte nicht für einen längeren Zeitraum hinweg vor dem Lesen der Extinktion.
2. Analyse der Untersuchungsergebnisse Platte-basierten
- sichern Sie die rohen Extinktion-Daten in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Die durchschnittliche Absorptionswerte für jedes gut mit der spezifischen Behandlung und Liganden zu produzieren. Verwenden Sie diese Durchschnittswerte für alle nachfolgenden Analysen.
Hinweis: Vergleichen Sie beide gut Absorptionswerte um sicherzustellen, dass keine Paare von Brunnen deutlich unterschiedliche Werte haben. - Analysieren die absolute Kapsid Integrität (alle Bindung), subtrahieren die rohe Extinktion von der " keine Kapsid " Steuerung von jedem anderen Extinktion Beispielwert.
Hinweis: Alternativ kann Verlust der Bindung durch den Verlust der höheren Ordnung (sekundären, tertiären, Quartär) Struktur direkt analysiert werden. Statt die Extinktion des Kontrollstreifens negativ (keine Kapsid) subtrahieren, subtrahieren Sie den Wert des Steuerelements vollständig denaturierten Kapsid. Dieser entfernt alle verbindenden signal aufgrund der unspezifischen Bindung an den Apparat als auch aufgrund der Kapsid Reihenfolge verbindlich. HBGA und Aptamer M6-2 Anzeigen wenig Bindung völlig denaturierten Kapsid, so dass beide Methoden ähnliche Ergebnisse produziert. Falsches positives Signal unspezifische Aptamer Bindung zugeschrieben betrachtet werden, bei der Wahl der Analyse verwenden. - Mit der negativen oder denaturierte Steuerung angepasst Absorptionswerte, die Behandlung Absorptionswerte durch ihre jeweiligen positiven (keine Behandlung) Steuern Absorptionswerte und multiplizieren dividieren durch 100. Dadurch wird den Anteil des Signals von der behandelten Kapsid gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Subtrahieren Sie
- zur Schätzung des verbindlichen Signal für jede Liganden auf die Kapsid-Sequenz, die " keine Kapsid " negative Kontrolle von der anfänglichen Absorptionswerte, und nehmen Sie die angepasste Extinktion von denaturierten Kapsid. Teilen Sie dies durch die angepassten Extinktion des positiven Steuersignals und mit 100 multiplizieren. Dies gibt die scheinbaren Prozentsatz des Signals durch Liganden Bindung an denaturierten Kapsid/Kapsid Sequenz.
3. DLS zum Nachweis von Virus-Aggregation nach der Wärmebehandlung
Hinweis: Die folgenden Schritte möglicherweise spezifisch für die Software und Instrument verwendet, können aber angepasst und zu ähnlichen Geräten angewendet werden kann.
- Erstellen eine neue Größe SOP in der DLS Instrument Software verwenden: Material = Protein, Dispergiermittel = PBS, Temperatur = 25 ° C, Gleichgewichtherstellung Zeit = 0 sec, Zelltyp = Einweg-Küvette (kleines Volumen, ZEN0040), Messwinkel = 173° Backscatter, Messdauer = Automatik, Anzahl der Messungen = 3, Verzögerung zwischen Messungen = 0 sec, Datenverarbeitung: Analysemodell = General Purpose (normale Auflösung). Verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter.
- Wählen Sie den grünen laufen Pfeil innerhalb der Software, und das Beispiel zu nennen.
- Schritte 1.1.1 bis 1.1.4 für die Wärmebehandlung von untersuchten.
- Verdünnt die Hitze untersuchten 01:10 in 1 X PBS für eine Endkonzentration von 5 µg/mL behandelt. (Optional) Filtern Sie die Probe mit einer 1 µm Porengröße, Staubpartikel zu entfernen; DLS ist sehr empfindlich gegenüber Staub, wie große Partikel wesentlich mehr Licht als Teilchen streuen.
- Transfer 50 µL verdünnter untersuchten in einem kleinen Volumen Einweg-Küvette. Legen Sie die Küvette in die Probenkammer des Instruments.
- Den Durchlauf starten und verwenden die ' Correlogram ', ' Cumulants Fit ', und ' Experte Beratung ' Registerkarten, um die Datenqualität zu bewerten.
- Während des Laufs zu prüfen, ob die Polydispersität-Index-Wert kleiner als 0,3 ist, stellvertretend für eine Qualität Messung. In der ‘ MV ’ tab, stellen Sie sicher der Korrelationskoeffizient ist konstant und in der Nähe, aber nicht mehr als 1, in kurzer Zeit und scharf auf 0 zu einem späteren Zeitpunkt, charakteristisch für Partikelgröße abfällt. Verwendung der ‘ Rat Experten ’ Registerkarte für Rückmeldung über die Qualität der Daten während der Messungen.
- Nachdem die Messung abgeschlossen ist, überprüfen Sie nochmals, dass die Polydispersität-Index-Wert ist kleiner als 0,3. Stellen Sie sicher, dass die Cumulants Linie folgt passen die Datenpunkte genau in die ‘ passen Cumulants ’ tab.
- Nehmen im Durchschnitt von der Z-Durchschnitt Partikeldurchmesser für jede Messung als die Partikelgröße von jeder Probe berichtet. Plot den Durchmesser in nm vs. Temperatur in ° c
4. DLS zur Erkennung von Viren Aggregation in Echtzeit
Hinweis: die folgenden Schritte möglicherweise spezifisch für die Software und Instrument verwendet, können aber angepasst und zu ähnlichen Geräten angewendet werden kann.
- Erstellen eine neue Größe SOP in der DLS Instrument Software verwenden: Material = Protein, Dispergiermittel = PBS, Temperatur = als gewünschte, Gleichgewichtherstellung Zeit = 0 sec, Zelltyp = Quarz Küvette, Messwinkel = 173° Backscatter, Messdauer = Automatik, Anzahl der Messungen = 50 (möglicherweise erhöhten oder verringerten Abhängigkeit von Aggregation Rate), Verzögerung zwischen Messungen = 0 sec, Datenverarbeitung: Analysemodell = mehrere schmale Modi (hohe Auflösung). Verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter.
- Wählen Sie die Ausführungspfeil innerhalb der Software zu öffnen und ein neues Beispiel zu nennen, und ermöglichen das Instrument, das Temperatur-Gleichgewicht zu erreichen.
- Aussetzen der untersuchten mit 1 X PBS-Puffer in einem Microcentrifuge Schlauch in einer Konzentration von 5 µg/mL und ein Volumen zwischen 200-500 µL. Wirbel der Aufhängung.
- Spin-down der VLP-Aufhängung für 5-10 s in einer Tischplatte Zentrifuge zu de-Gas. Dies verhindert, dass Blasenbildung bei der Wärmebehandlung die Größenmessungen stört.
- Übertragung der VLP Aussetzung zu ein kleines Volumen Quarz Küvette vermeiden Sie Luftblasen und pipette langsam gegen die Wand von der Küvette. Nachdem das Instrument Temperatur Gleichgewicht erreicht hat, setzen Sie die Küvette in die Probenkammer.
- Warten 10 s für die Temperatur der Probe zu equilibrate, dann den Durchlauf starten. Starten Sie einen Timer zu Beginn des Laufs. Stoppen Sie die Zeitmessung am Ende der ersten Messung. Nutzt diese Zeit als die ersten Zeitpunkt. Späteren Zeitpunkt Punkte erzielen, von der Messzeiten von der Software erfasst.
- Den Durchlauf starten und überwachen die Correlogram, Verteilung passen und kompetente Beratung, die Datenqualität zu bewerten.
Hinweis: Die PDI wird nicht unbedingt, dass weniger als 0,3 für diese Messungen wie die Probe, während der Anhäufung Polydisperse sein soll.- Stellen Sie sicher der Korrelationskoeffizient ist konstant und in der Nähe, aber nicht mehr als 1 in kurzer Zeit und zu einem oder mehreren späteren Zeiten, charakteristisch für Partikelgröße stark abfällt.
- Sicherstellen, dass die Verteilung passen Linie folgt die Datenpunkte eng.
- Größe Datenanalyse.
- Bestimmen jeweils Punkt aus der Zeitdifferenz zwischen jeder Messung und die erste Zeit-Punkt. Dauer der Messung sind nicht alle genau das gleiche.
- Mit eine Intensitätsverteilung, die Größe der Gipfel mit den größten Flächen für jede Messung/Zeitpunkt erfassen.
- Zeichnen Sie die Peak-Durchmesser in nm vs. Zeit in min.
5. TEM Probenvorbereitung
- erhalten Kohlenstoff Unterstützung Film (Nickel) Raster entworfen für TEM.
Hinweis: Wenden Sie sich an die zentrale Einrichtung auf empfohlene Reagenzien und deren Handhabung für den Einsatz mit dem Anlage-Mikroskop. Achten Sie darauf, Gitter in eine Kiste mit Trockenmittel oder eine Vakuumkammer zur Minimierung der Exposition gegenüber Feuchtigkeit zu speichern. - Reißen ca. 5 x 5 cm Stück Filterpapier. Erhalten Glas Petrischalen und ordnungsgemäße selbstschließende Pinzette für den Einsatz in der Mikroskopie umkehren.
- Schneiden Sie ca. 2,5 x 5 cm Stück Paraffin Film. Auf die Benchtop.
- Wärmebehandlung von Norovirus GII.4 Sydney Capsids
- die Wärmebehandlung Schritte genau wie oben beschrieben in Schritte 1.1.1 - 1.1.5 außer: 10 mM HEPES (pH 7,4) für Behandlung anstelle von PBS und Capsids nicht weiter verdünnen nach der Behandlung (halten Sie Lösung bei 50 µg/mL). Pipette die gesamte ~ 15 µL Tropfen auf Paraffin Film behandelten Kapsid.
- Greifen die Raster-Kante mit einer Pinzette, so dass sie am Rand um das Raster zu halten in der Nähe und legen Sie die Gitter Kohlenstoff-Side-Down auf den Tropfen der behandelten Lösung. Lassen Sie für 10 min erlauben das Kapsid Anfügen an das Raster inkubieren.
- Abhängig von der Reinheit der Kapsid Zubereitung wäscht von 10 mM HEPES Lösung bei Bedarf hinzugefügt werden in Form von 10-15 µL Tröpfchen in Zeile nach der behandelten Kapsid Tropfen gestellt.
- Nach 10 min, nehmen Sie das Raster mit den Tropfen. Platzieren Sie das Raster fast senkrecht auf ein Stück Filterpapier, entfernt das Droplet Docht. Das Tröpfchen von 10-15 µL HEPES-Puffer mit dem Raster abholen, halten Sie für 30 s, dann Docht entfernt mit einem anderen Stück Filterpapier, Wash
- Einen 15 µL Tropfen 2 % Uranyl-Acetat-Lösung auf dem Paraffin-Film in einem leeren Bereich zu platzieren.
- Nehmen Sie das Droplet Uranyl-Acetat mit dem Gitter und halten für 45 S. Wick entfernt Uranyl-Acetat, wobei Sie auf die meisten der Lösung zu entfernen. Stellen die Gitter Kohlenstoff-Seite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei Sie darauf achten, dass das Raster nicht " Stick " an der Feuchtigkeit auf die Pinzette. Das Filterpapier mit dem Gitter aufsetzen, in einem offenen Glas Petrischale.
Hinweis: Verwenden Sie Kunststoff Petrischalen, nicht, wie die Netze sie elektrostatisch angezogen werden und stecken zu Gericht.
- Nehmen Sie das Droplet Uranyl-Acetat mit dem Gitter und halten für 45 S. Wick entfernt Uranyl-Acetat, wobei Sie auf die meisten der Lösung zu entfernen. Stellen die Gitter Kohlenstoff-Seite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei Sie darauf achten, dass das Raster nicht " Stick " an der Feuchtigkeit auf die Pinzette. Das Filterpapier mit dem Gitter aufsetzen, in einem offenen Glas Petrischale.
- Wiederholen Sie für alle Behandlungen. Legen Sie die Petrischale-Hälften mit den Netzen in einem Exsikkator über Nacht zum Trocknen vor der Beobachtung mit TEM.
- Wenden Sie sich an die Mikroskopie-Anlage an der jeweiligen Institution in Bezug auf die vorbereiteten Gitter zu beobachten. Einige Einrichtungen ermöglichen dem Nutzer auf den Betrieb ihrer Anlage ausgebildet werden ' s Instrument. Bestimmte Details über die Einrichtung und die Beobachtung eines speziellen Mikroskops ist bEyond den Rahmen dieses Artikels sprengen.
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Representative Results
Die strukturelle Integrität des menschlichen Norovirus GII.4 Sydney Capsids (untersuchten) wurde anhand mehrere neuartige Methoden wie von Moore Et Al. vorgestellt 17. zunächst ein Experiment wurde durchgeführt, die die Integrität des Capsids in Abhängigkeit von ihrer Fähigkeit, eine vermeintliche Rezeptor/co-factor (HBGA) oder SsDNA Aptamer (M6-2) binden waren im Vergleich (Abbildung 1). Die angezeigten Ergebnisse wurden bisher von Moore Et Al. vorgelegt 17, und zeigen, dass das Bindungsverhalten Aptamer M6-2-Kapsid des Virus-HBGA Bindung bei 68 ° C Wärmebehandlung für verschiedene Belichtungszeiten ähnelte. Während die HBGA Bindung Signal etwas früher als verloren war, dass der Aptamer M6-2 M6-2 eine ähnliche Rate der Signalverlust berechnet angezeigt, nachdem untersuchten, auf 65 ° C ausgesetzt waren und 68 ° C für verschiedene Zeit (Tabelle 1)17 Punkte. Dies deutet darauf hin, dass HBGA und bindende Aptamer M6-2 wurde in ähnlicher Weise abgeschafft.
DLS Messungen gezeigt, dass Aggregation durch Protein-Denaturierung wahrscheinlich Ligand verbindliche Signalverlust (Abbildung 2), entsprach als einem hydrodynamischen Durchmesser größer als 100 nm beobachtet nach ca. 18 min Behandlung bei 68 ° C. Dies waren die Bedingungen auf dem kompletten Verlust der HBGA Bindung und fast alle Verlust der Bindung Signal für Aptamer M6-2 (> 80 %) aufgetreten ist (Abbildung 1)17. TEM Ergebnisse unterstützt diese Beobachtungen als morphologische Veränderungen und Verklumpung der der Capsids wurde immer deutlicher, wie die Temperatur schrittweise zwischen 60 ° C und 80 ° C für 1 min (Abbildung 3a) erhöht wurde. Ein ähnliches Phänomen wurde nach dem Erwärmen des Capsids bei 68 ° C für bis zu 25 min beobachtet, aber die Auflösung der TEM war weniger ausgeprägt (Abb. 3 b)17.
Abbildung 1: Konformation-abhängige Bindung von zwei verschiedenen Liganden, Norovirus GII.4 Sydney Capsids einer Wärmebehandlung unterzogen. Gereinigten GII.4 Sydney Capsids (untersuchten) wurden für unterschiedlich lange Wärmebehandlung bei 68 ° C ausgesetzt, und die Bindung, die Blutgruppe A HBGA und Aptamer M6-2 wurde anhand eines Platte-basierte ELASA Bindung Assays. Die Y-Achse zeigt die Extinktion-Signal für eine Behandlung (Belichtungszeit) beobachtet als Prozentsatz eines unbehandelten Kapsid-Steuerelements. Diese Zahl ist bereits dargestellt worden und diese Zahl wurde geändert, von Moore Et al. 17 Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung ± 1 % Signal. Daten beziehen sich auf mindestens drei replizieren Platten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiel DLS Daten für wärmebehandelte Norovirus GII.4 Sydney Capsids ideal und mehrdeutige/niedrige Qualität Resultate. Capsids (untersuchten) Wärmebehandlung bei 65 ° C und 68 ° C ausgesetzt waren, und ihre Größe wurde in Echtzeit überwacht. Panel (ein) entspricht eine hohe Qualität, klare Korrelationskoeffizient Messung; und (b) zu einer niedrigen Qualität, mehrdeutige Korrelationskoeffizient Messung. Feld (c) zeigt Partikel Größe Daten zeigt eine klare Aggregation Profil für Capsids bei 68 ° C behandelt; und (d) zeigt die mehrdeutige Partikel Größe Daten für wärmebehandelte Capsids. Einige dieser Daten werden vorgestellt, und so wird dieses Bild von Moore Et Al. geändert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: verschiedene Wärmebehandlungen unterzogen TEM der Norovirus GII.4 Sydney Capsids. Gereinigten Capsids (untersuchten) wurden verschiedene Wärmebehandlungen unterzogen und mit Transmissions-Elektronenmikroskopie beobachtet. Panel (eine) zeigt Daten für Capsids bei verschiedenen Temperaturen erhitzt (60, 65, 70, 75 und 80 ° C) für 1 min. Panel (b) Capsids 68 ° C Behandlung für 0 - 25 min. Skala (Bar) am rechten Fotos stellt 100 nm zeigt. Diese Bilder sind im Moore Et Al. vorgestellt. 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Exponentiellen Zerfallsrate (% Signal/min) | |||
| Temperatur | 65 ° C | 68 ° C | |
| Liganden | |||
| HBGA Typ A | 2,50 ± 0,24 | 13.30 Uhr ± 1.15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13.18 ± 0.47 | |
Tabelle 1: exponentielle Zerfall Preise für Norovirus GII.4 Sydney Capsids behandelt bei 65 ° C und 68 ° c Mehrfach bei 65 ° C und 68 ° C gekühlt bei 4 ° C, und ihre Fähigkeit zur Bindung von synthetischen HBGA oder Aptamer ausgewertet wurden Wärmebehandlungen für Capsids unterzogen. Die Rate der Signalverlust im Laufe der Zeit (Zerfallsrate) wurde dann mit jeder Ligand für jede Temperatur berechnet. Diese Daten wurden zuvor in Moore Et Al. vorgestellt 17 % Signal/min ± 1 Standardabweichung der % Signal werden Daten dargestellt.
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Discussion
Das Protokoll und die hier beschriebenen Techniken bieten ein Mittel zur Bewertung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität/Funktionalität. Diese Methoden können verwendet werden, für den Erhalt der mechanistische Einblicke in die Auswirkungen der Inaktivierung Behandlungen gegen das Virus und können potenziell traditionellere Inaktivierung Bewertungsmethoden wie RT-qPCR oder Plaque-Assay ergänzen. Beispielsweise sieht die Bewertung der chemischen oder physikalischen Inaktivierung durch Plaque-Assay allein ein Maß für den Grad der Inaktivierung von Viren aber nicht der zugrunde liegende Mechanismus dieser Inaktivierung. Darüber hinaus kann Virus Aggregation Unterschätzung der Titer führen und daher überschätzen Behandlung Wirksamkeit30. Diese Methoden können solche Studie weiter informieren, indem Sie Informationen über die Auswirkungen einer Behandlung auf die Integrität der Norovirus Kapsid. Vor kurzem wurden zwei in Vitro (Zellkultur) Anbaumethoden für menschliche Norovirus gemeldeten5,6; diese noch stützte sich auf PCR für Virus-Enumeration, obwohl theoretisch das Enteroid Modell könnte, für TCID50 genutzt werden Antikörper Färbung für relative Reduktion Bestimmung verwenden. Die hier vorgestellten Methoden hätten Dienstprogramm für das Verständnis des komplette Mechanismus der viralen Inaktivierung für mehrere verschiedene Arten von Behandlungen jenseits nur Wärmebehandlung. Z. B. Platte-basierte Ligand-Bindung und TEM Werkzeuge dienten als Ergänzung RT-qPCR und Plaque-Assay-Daten bei der Bestimmung des Mechanismus der Inaktivierung Noroviren auf Kupferoberflächen,31,32, bei Kontakt mit Dihydrogen Silber Citrat33und hohen hydrostatischen Druck Behandlung14.
Es gibt zahlreiche Schritte in diesen Protokollen in denen Liebe zum methodischen Detail entscheidend ist. Insbesondere für die Platte-Assay, großer Aufmerksamkeit in den Puffer verwendet, um die Liganden für die Bindung zu verdünnen entrichten. Aptamer M6-2 und SsDNA Aptamere sind in der Regel Konzentrationen und Pufferbedingungen salzempfindlich. Mit einem nicht optimalen Puffer mit dem Aptamer kann verbindliche abtragen. Obwohl Aptamer, die M6-2 erfolgreich im verwendet wurde menschlichen Stuhl verdünnt, kann zu viel Einmischung Hocker/Matrix mit Bindung, stören die im Einklang mit den Beobachtungen für andere menschliche Norovirus Aptamere18,22. Ein wesentlicher Faktor, der Grund dafür ist, dass Aptamere ein Maß der unspezifischen Bindung an die positiv geladene Moleküle aufweisen können. So könnte dies zu einem gewissen Grad von false positives Signal in der hier beschriebenen Test führen. Dies kann durch die Auswahl einer Negativkontrolle, die entweder eine komplexe Matrix ohne Virus oder einer nicht verwandten Protein ist berücksichtigt werden. Ebenso die HBGA-Konzentration und die Menge der Magermilch Feststoffe in der Bindung Puffer verwendet können erheblich positiv beeinflussen und Hintergrund signalisiert. Beachten Sie, dass verschiedene HBGAs unterschiedlicher Affinität zu verschiedenen Stämmen von menschlichen Norovirus so die Bindung Puffer müssen je nach HBGA Typ14,31,33optimiert werden. Ähnlich sollte der Puffer für die Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat verwendet berücksichtigt werden da Konzentrationen verschiedener Hersteller unterschiedlich sein können; jedoch viel weniger Variabilität dürften angesichts die hohe Affinität des Streptavidin-Biotin-Interaktion-34. Durch das hohe Maß an Anpassungsfähigkeit dieser Platte-basierte Methode ist die Problembehandlung suboptimale Ergebnisse relativ einfach. Z. B. bei hohen Hintergrundsignal, Optimierung durch Erhöhung der Magermilch Konzentration und abnehmende Liganden-Konzentration untersucht werden können, und umgekehrt für Platten mit niedrigen positive Signale. Für TEM, einer der wichtigsten Aspekte ist die Verwendung von nicht-statische Materialien (wie Glas) beim Speichern/Gitter, Handhabung wie die Raster extrem schwierig sind zu handhaben um Materialien wie Einweg-Petrischalen. Wenn solche Materialien verwendet werden, werden Netze sind in der Regel zu "springen" und halten Sie sich an das Material. Darüber hinaus sollte viel darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass es keine Restfeuchte auf den Gittern. Im Idealfall sollte ein Vakuum Exsikkator ggf. verwendet werden.
Bei der Durchführung von Experimenten mit DLS ist die Reinheit der Probe ein sehr wichtiger Aspekt. Die Funktionen verwendet, um Änderungen in der Intensität der Lichtstreuung Durchmesser korrelieren mit Monomodal abhängig oder schmalen multimodalen Partikel Distributionen. Verunreinigungen auf der Nanometerskala, einschließlich Proteine, stellen Polydispersität und Berechnungen der Größe zu verändern. Auch ist die Intensität von Licht zerstreut proportional zum Durchmesser angehoben, um eine Leistung von 6, also große Partikel wie Staub Messungen wesentlich beeinträchtigen. Blasenbildung bei Echtzeit-Wärmebehandlungen führt zu unsinnigen Ergebnissen aufgrund der schwankenden Bläschen gestreute Licht. Kapsid (VLP) Konzentration muss berücksichtigt werden, wenn Sie Verteilerlisten verwenden. Probe-Konzentrationen sind hoch genug, um genügend Signal zu erzeugen und niedrig genug, um Mehrfachstreuung zu vermeiden. Es ist auch von entscheidender Bedeutung, das richtige Material einzugeben und Dispergiermittel Eigenschaften, als diese Werte werden von der Software für Berechnungen verwendet. Insbesondere Dispergiermittel Viskosität ist eine Funktion der Temperatur und müssen entsprechend angepasst werden bei Wärmebehandlungen (die verwendete Software hat temperaturabhängige Viskositäten Wasser gebaut).
Obwohl die hier beschriebenen Methoden bieten mehrere Möglichkeiten für verbesserte Möglichkeiten zum Kapsid Integrität zu beurteilen, sie sind nicht perfekt. Da diese Methoden sehr hohe Konzentrationen von Virus erfordern, müssen sie mit gereinigten, montierte Capsids statt native infektiösen Viren verwendet werden. Die hier untersuchten bestehen aus großen Kapsid Protein der menschlichen Norovirus (VP1), die in das Norovirus Kapsid ohne virale Nukleinsäure montiert. Obwohl diese untersuchten antigenetisch ähnliches Verhalten zu infektiösen Virus Capsids aufweisen, können sie anfälliger für Inaktivierung sein. Darüber hinaus untersuchten sind schwer zu produzieren und zu reinigen und sind nicht leicht zugänglich für viele Forscher. Verwendung von gereinigten menschlichen Norovirus (z. B.mit Ultrazentrifugation) ist möglich aber Verfügbarkeit von Norovirus-positiven menschlichen Stuhlproben ist begrenzt und sogar mit Reinigung, Virus-Titer möglicherweise nicht hoch genug, um Platz für die Methoden hier beschrieben. Zukünftige wird optimierend Assays für die Verwendung von semi-gereinigte ansteckenden Virus im Stuhl derzeit gearbeitet. In der Tat, dies zeigte sich bereits für die Platte Assay18,22, aber wäre zweifellos für DLS komplizierter. Es sollte auch angemerkt werden, dass diese Methoden nur angewendet wurden, um Kapsid Integrität nach dem Auftragen eine physikalische (Wärme) zu bewerten Inaktivierung Ansatz, bei dem bekannt ist, direkt das Kapsid beeinflussen. Ergebnisse möglicherweise weniger eindeutig waren diese Techniken verwendet, um die Kapsid Integrität mit anderen Inaktivierung Ansätzen, wie chemische Mittel oder Methoden, die Zerstörung des Virusgenoms meist gezielt auszuwerten. Jedoch haben einige Berichte positiv die Leistung des HBGA verbindlich für die Bewertung der chemischen Inaktivierung31,33,35,36,37gezeigt. Zum aktuellen Zeitpunkt sind die Protokolle hier berichtet am besten in Konzert mit traditionellen Lösungstechniken wie RT-qPCR und pl verwendet.Dieb-Assays mit Surrogat Viren.
Diese Protokolle bieten eine einfache Alternative, um die Auswirkungen einer physischen Virus-Inaktivierung-Methode (Wärme) auf menschliche Norovirus verstehen bedeutet. Diese Methoden könnte wahrscheinlich für die Verwendung mit anderen unbehüllte Viren (z.B.Hepatitis A und E-Viren), erweitert werden, da das allgemeine Prinzip Verlust der höheren Ordnung Proteinstruktur zu erkennen ist. Darüber hinaus sollte die Verhalten und Potential Verwendung von anderen Liganden zur Anzeige der Verlust der Kapsid Integrität bewertet werden. Anpassung der Protokolle zu komplexeren Beispiel Matrizen und Verbesserung ihrer analytischen Empfindlichkeit (Nachweisgrenze) ist auch eine logische Zukunftsausrichtung. Alles in allem bieten die hier beschriebenen Methoden zugänglicher Mittel zur Bestimmung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität und mechanistische Einblicke in die Auswirkungen der Inaktivierung Behandlungen gegen diese wichtige Erreger.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Agriculture and Food Research Initiative wettbewerbsfähige Grant Nr. 2011-68003-30395 vom United States Department of Agriculture, nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft im Rahmen des NoroCORE Projekts unterstützt. Open-Access-Gebühr wurde von der United States Department of Agriculture finanziert. Wir möchten danken Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) freundlicherweise uns zur Verfügung gestellt die gereinigten Capsids und Valerie Lapham für ihre Unterstützung bei der TEM-Bilder. Wir möchten auch Frank N. Barry Danke für Ihre Hilfe die Experimente vorgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
